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Artigo de método

Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante

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DOI:

10.3791/64028

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27 de julho de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Neste artigo

Resumo

O trato gastrointestinal é um dos órgãos mais sensíveis à lesão no tratamento radioterápico do câncer. É simultaneamente um sistema orgânico com uma das mais altas capacidades regenerativas após tais insultos. O protocolo apresentado descreve um método eficiente para estudar a capacidade regenerativa do epitélio intestinal.

Resumo

O epitélio intestinal consiste de uma única camada de células, mas contém múltiplos tipos de células terminalmente diferenciadas, que são geradas pela proliferação ativa de células-tronco intestinais localizadas no fundo das criptas intestinais. No entanto, durante eventos de lesão intestinal aguda, essas células-tronco intestinais ativas sofrem morte celular. A irradiação gama é um tratamento de câncer colorretal amplamente utilizado, que, embora terapeuticamente eficaz, tem o efeito colateral de esgotar o pool ativo de células-tronco. De fato, os pacientes frequentemente experimentam síndrome de radiação gastrointestinal durante a radioterapia, em parte devido à depleção ativa de células-tronco. A perda de células-tronco intestinais ativas em criptas intestinais ativa um pool de células-tronco intestinais de reserva tipicamente quiescentes e induz a desdiferenciação de células precursoras secretoras e enterocitárias. Se não fossem essas células, o epitélio intestinal não teria a capacidade de se recuperar da radioterapia e de outros grandes insultos teciduais. Novos avanços em tecnologias de rastreamento de linhagem permitem o rastreamento da ativação, diferenciação e migração de células durante a regeneração e têm sido empregados com sucesso para estudar isso no intestino. Este estudo tem como objetivo descrever um método para a análise de células dentro do epitélio intestinal de camundongos após lesão por radiação.

Introdução

O epitélio intestinal humano cobriria aproximadamente a superfície de meia quadra de badminton se colocado completamente plano1. Em vez disso, essa única camada de células que separa os humanos do conteúdo de seus intestinos é compactada em uma série de projeções semelhantes a dedos, vilosidades e reentrâncias, criptas que maximizam a área de superfície dos intestinos. As células do epitélio diferenciam-se ao longo de um eixo cripta-vilosidade. As vilosidades consistem principalmente de enterócitos absorvedores de nutrientes, células caliciformes secretoras de muco e células enteroendócrinas produtoras de hormônios, enquanto as criptas consistem principalmente de células Paneth produtoras de defensina, células-tronco ativas e de reserva e células progenitoras 2,3,4,5. Além disso, a comunicação bidirecional dessas células com as células estromais e imunes do compartimento mesenquimal subjacente e a microbiota do lúmen gera uma complexa rede de interações que mantém a homeostase intestinal e é fundamental para a recuperação após a lesão6,7,8.

O epitélio intestinal é o tecido que mais rapidamente se auto-renova no corpo humano, com taxa de turnover de 2-6 dias 9,10,11. Durante a homeostase, células-tronco ativas na base das criptas intestinais (células colunares da base das criptas), marcadas pela expressão do receptor acoplado à proteína G 5 (LGR5), rico em leucina, rapidamente se dividem e fornecem células progenitoras que se diferenciam em todas as outras linhagens epiteliais intestinais. No entanto, devido à sua alta taxa mitótica, as células-tronco ativas e seus progenitores imediatos são particularmente sensíveis à lesão por radiação gama e sofrem apoptose após irradiação 5,12,13,14. Ao serem perdidas, células-tronco de reserva e não-células-tronco (subpopulação de progenitores e algumas células terminalmente diferenciadas) dentro das criptas intestinais sofrem ativação e reposição do compartimento criptário basal, que pode então reconstituir populações celulares das vilosidades e, assim, regenerar o epitélio intestinal15. Utilizando técnicas de rastreamento de linhagens, vários grupos de pesquisa têm demonstrado que células-tronco de reserva (quiescentes) são capazes de suportar a regeneração após a perda de células-tronco ativas 13,16,17,18,19,20,21,22. Essas células são caracterizadas pela presença do oncogene da proteína 1 do complexo policomb (Bmi1), do gene da transcriptase reversa da telomerase de camundongo (mTert), da homeobox de Hop (Hopx) e do gene da proteína 1 de repetição rica em leucina (Lrig1). Além disso, tem sido demonstrado que as células não estaminais são capazes de repor criptas intestinais em caso de lesão23,24,25,26,27,28,29,30,31. Em particular, tem sido demonstrado que progenitores de células secretoras e enterócitos sofrem desdiferenciação após lesão, revertem para células-tronco semelhantes e suportam a regeneração do epitélio intestinal. Estudos recentes identificaram células expressando múltiplos marcadores que possuem a capacidade de adquirir características semelhantes ao tronco no momento da lesão (como DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Surpreendentemente, Yu e col. mostraram que mesmo células Paneth maduras (LYZ+) podem contribuir para a regeneração intestinal37. Além disso, além de causar apoptose das células epiteliais intestinais e interromper a função da barreira epitelial, a irradiação resulta em disbiose da flora intestinal, ativação de células imunes e início de resposta pró-inflamatória, ativação de células mesenquimais e estromais38,39.

A radiação gama é uma ferramenta terapêutica valiosa no tratamento do câncer, especialmente para os tumorescolorretais40. No entanto, a irradiação afeta significativamente a homeostase intestinal, induzindo danos às células, o que leva à apoptose. A exposição à radiação causa múltiplas perturbações que retardam a recuperação do paciente e é marcada por lesão da mucosa e inflamação na fase aguda e diarreia, incontinência, sangramento e dor abdominal a longo prazo. Essa panóplia de manifestações é referida como toxicidade por radiação gastrointestinal. Além disso, a progressão da fibrose transmural e/ou esclerose vascular induzida pela radiação só pode se manifestar anos após o tratamento38,41. Simultaneamente à própria lesão, a radiação induz uma resposta de reparo nas células intestinais que ativa as vias de sinalização responsáveis por iniciar e orquestrar a regeneração42. A doença do intestino delgado induzida pela radiação pode originar-se da radioterapia pélvica ou abdominal fornecida a outros órgãos (como colo do útero, próstata, pâncreas, reto)41,43,44,45,46. A lesão por irradiação intestinal é, portanto, um problema clínico significativo, e um melhor entendimento da fisiopatologia resultante provavelmente fará avançar o desenvolvimento de intervenções para aliviar as complicações gastrointestinais associadas à radioterapia. Existem outras técnicas que permitem investigar a finalidade regenerativa do epitélio intestinal além da radiação. Modelos murinos transgênicos e químicos para estudar a inflamação e a regeneração a partir de então têm sido desenvolvidos47. O sulfato de sódio dextran (DSS) induz inflamação no intestino e leva ao desenvolvimento de características semelhantes às da doença inflamatória intestinal48. A combinação do tratamento da ESD com o composto pró-carcinogênico azoximetano (AOM) pode resultar no desenvolvimento de câncer associado à colite48,49. A lesão induzida por isquemia e reperfusão é outro método empregado para estudar o potencial regenerativo do epitélio intestinal. Esta técnica requer experiência e conhecimento cirúrgico50. Além disso, as técnicas citadas causam diferentes tipos de lesão do que a radiação e podem levar ao envolvimento de diferentes mecanismos de regeneração. Além disso, esses modelos são demorados, enquanto a técnica de radiação é bastante breve. Recentemente, métodos in vitro utilizando enteróides e colonóides gerados a partir do intestino e cólon têm sido utilizados em combinação com a lesão por radiação para estudar os mecanismos de regeneração intestinal51,52. No entanto, essas técnicas não recapitulam completamente o órgão quemodelam53,54.

O protocolo apresentado inclui a descrição de um modelo murino de lesão por radiação gama em combinação com um modelo genético que, após o tratamento com tamoxifeno, permite o rastreamento de linhagens originárias da população de células-tronco de reserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Esse modelo utiliza uma irradiação de corpo total de 12 Gy, que induz lesão intestinal significativa o suficiente para ativar células-tronco de reserva, ao mesmo tempo em que permite a investigação subsequente da capacidade regenerativa intestinal dentro de 7 dias após a lesão55.

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Protocolo

Todos os camundongos foram alojados na Divisão de Recursos Animais de Laboratório (DLAR) da Stony Brook University. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Stony Brook University (IACUC) aprovou todos os estudos e procedimentos envolvendo cobaias animais. Os experimentos envolvendo animais foram conduzidos estritamente de acordo com o protocolo aprovado de manejo de animais (IACUC #245094).

NOTA: As estirpes de rato B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) e B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais) e cruzadas para obter Bmi1-Cre ER; Camundongos Rosa26eYFP (Bmi1ctrl), como descrito anteriormente56,57,58.

1. Alojamento de Bmi1-Cre ER; Camundongos Rosa26 eYFP

  1. Manter os ratos em uma instalação animal a uma temperatura variando de 68-72 °F e umidade variando de 30-70%, em um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, com água e ração normal ad libitum.
  2. Antes dos experimentos, confirme os genótipos dos camundongos usando uma técnica padrão de genotipagem por PCR57,58.

2. Preparação de animais e materiais

  1. Transfira os camundongos para a sala de alojamento experimental pelo menos 7 dias antes de qualquer experimentação para permitir que os camundongos se aclimatem.
  2. Combinar animais experimentais e controles de acordo com sexo e idade.
  3. Submeter os animais de controlo à recombinação mediada por Cre induzida pelo tamoxifeno, mas não à irradiação (tratamento simulado, 0 Gy), assegurando simultaneamente que os animais de ensaio recebem a injeção de tamoxifeno e são expostos à irradiação gama.
  4. Prepare a solução de tamoxifeno. Ressuspender o tamoxifeno em pó em óleo de milho estéril na concentração de 30 mg/mL. Sonicar por 3 min em ciclos de 30 s ON e 30 s OFF com 60% de amplitude e depois girar no escuro por 1 h à temperatura ambiente (TR). A solução de tamoxifeno pode ser congelada a -20 °C, mas não congelar/descongelar mais do que uma vez. De preferência, prepare uma solução fresca de cada vez e não a armazene.
    NOTA: O tamoxifeno é sensível à luz. Envolva-o com papel alumínio durante a rotação à temperatura ambiente.
    CUIDADO: O tamoxifeno é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (GHS08) e perigo para o meio ambiente (GHS09).
  5. Preparar a solução-mãe de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU). Ressuspenda o pó de EdU em 1/5 do volume total de dimetilsulfóxido estéril (DMSO) e adicione lentamente os 4/5 restantes do volume total de água ultrapura estéril. Quando completamente dissolvido, alíquota e armazenar a -20 °C.
    CUIDADO: 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) e dimetil sulfóxido (DMSO) são substâncias potencialmente perigosas: Perigo para a saúde (H340 e H631, e H227, H315 e H319, respectivamente). EdU pode causar defeitos genéticos e é suspeito de prejudicar a fertilidade ou nascituros, e DMSO pode causar irritação da pele e dos olhos.
  6. Preparar reagentes para coleta e fixação de tecidos: diluir o etanol para preparar uma solução aquosa a 70%, resfriar o DPBS a 4 °C e preparar o tampão fixador de Bouin modificado (etanol a 50% e ácido acético a 5% em H2O destilado) e formalina tamponada a 10%.
    CUIDADO: O álcool etílico é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H225-H319), inflamável (GHS02) e causa toxicidade aguda (GHS07). O ácido acético é uma substância potencialmente perigosa: perigo para a saúde (H226-H314), inflamável (GHS02) e corrosivo (GHS05). A formalina é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H350, H315, H317, H318, H370) e corrosiva. A formalina pode causar câncer, irritação da pele e dos olhos, danos aos órgãos e reações alérgicas na pele.
  7. Preparar o equipamento necessário para a eutanásia de acordo com um método aprovado (câmara de CO2 , por exemplo), um kit de dissecção de ratos (tesoura, pinças), placas de Petri, uma agulha de gavagem de 16 G acoplada a uma seringa de 10 mL para lavar os intestinos e histológicas.

3. Irradiação gama (TCE) de corpo total e coleta de tecidos

  1. Dois dias antes da exposição à irradiação gama, injetar nos animais experimentais uma dose única de tamoxifeno para induzir recombinação mediada por Cre e rastreamento da linhagem celular IMC1/EYFP+ . Pesar cada animal e calcular uma dose de 40 mg/kg de peso corporal de tamoxifeno ressuspendido em óleo de milho. Desinfetar a região abdominal com etanol a 70% e administrar tamoxifeno por via intraperitoneal com agulha 27G acoplada a seringa de 1 mL.
  2. Observar os animais durante as 48 horas seguintes para excluir uma potencial toxicidade por tamoxifeno.
  3. Transfira os camundongos para a sala de irradiação, conforme especificado pela instituição local.
  4. Calcular o tempo de exposição à irradiação liberado pela fonte de 137Cs de acordo com a taxa de dose exata atual. Por exemplo, se a taxa de dose atual for igual a 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), o tempo de exposição em minutos é calculado como a dose desejada/0,759. Para irradiar os animais para uma dose de 12 Gy TBI, o tempo de exposição é de ~15,81 min (15 min e 48 s).
  5. Desinfetar a câmara de amostras no irradiador gama com solução de etanol a 70%; Coloque o tapete absorvente e os animais dentro da câmara de amostragem.
    NOTA: Os animais tratados com simulação devem ser colocados na sala de irradiação, mas não expostos à irradiação gama.
  6. Coloque a tampa e feche a câmara.
  7. Programar o gamairradiador para expor os animais ao TCE de 12 Gy.
    1. Ligue a máquina girando a chave na posição START.
    2. Digite o número do operador usando um teclado numérico e confirme pressionando ENTER.
    3. Digite o número PIN usando um teclado numérico e confirme pressionando ENTER.
    4. Pressione 1 para opções.
    5. Pressione 1 para configurações de temporizador.
    6. Pressione 1 para obter o tempo de irradiação.
    7. Insira a configuração do temporizador para o próximo ciclo usando um teclado numérico (formato hh:mm:ss) e confirme pressionando ENTER.
    8. Confirme as configurações mais uma vez pressionando ENTER.
    9. Volte para o menu inicial pressionando CLEAR 2x.
    10. Pressione START para iniciar a exposição.
  8. Deixe a sala para o tempo de exposição ativa. A máquina irá parar automaticamente após o tempo predefinido passar e começará a apitar.
    CUIDADO: O césio-137 (137Cs) é uma substância perigosa mortal (Perigo para a saúde: H314). A exposição externa a grandes quantidades de 137Cs pode causar queimaduras, doença aguda por radiação e até a morte.
  9. Desligue a máquina girando a chave na posição STOP.
  10. Abra a câmara de amostras, retire a tampa, transfira os animais de volta para a gaiola e desinfete a câmara de amostras com solução de etanol a 70%.
  11. Transfira os animais de volta para a sala de alojamento convencional e observe sua condição pós-tratamento.
  12. Monitorar o peso dos animais todos os dias e eutanasiá-los imediatamente (apesar do período planejado) se quaisquer sintomas de bem-estar alterado, angústia ou perda de peso superior a 15% do peso corporal inicial forem observados.
  13. Três horas antes da eutanásia planeada, desinfetar a área abdominal e, utilizando uma seringa de insulina 28G, injetar nos ratinhos 100 μL de solução de EdU (administrada por via intraperitoneal).
  14. Coletar intestinos proximais em 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 168 h após a irradiação.
    1. Realizar a eutanásia CO2 de acordo com as normas da instituição de origem.
      CUIDADO: O dióxido de carbono é uma substância perigosa (H280). Contém gás sob pressão; pode explodir se aquecido. Pode deslocar o oxigênio e causar sufocamento rápido.
    2. Em seguida, dissecar a parte proximal do intestino delgado, remover os tecidos aderidos, lavar com DPBS fria usando uma agulha de alimentação reta de 16 G acoplada a uma seringa de 10 mL, fixar com tampão fixador de Bouin modificado usando uma agulha de alimentação reta de 16 G conectada a uma seringa de 10 mL, abrir longitudinalmente e enrolar os intestinos proximais usando a técnica swiss-roll, como descrito anteriormente59.
  15. Colocar os tecidos em um histológico e deixar por 24-48 h à temperatura ambiente em um recipiente com formalina tamponada a 10%. O volume da formalina deve ser suficiente para cobrir totalmente os histológicos. Decorrido o tempo de incubação, com pinças, transferir os histológicos para o recipiente preenchido com etanol 70%. Em seguida, proceda com a inclusão em parafina tecidual.
    NOTA: A inclusão de parafina tecidual foi realizada pelo Research Histology Core Laboratory da Stony Brook University. O procedimento pode ser interrompido aqui, e os blocos de parafina podem ser armazenados à temperatura ambiente.
    CUIDADO: A formalina é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H350, H315, H317, H318, H370) e corrosiva. A formalina pode causar câncer, irritação da pele e dos olhos, danos aos órgãos e reações alérgicas na pele.

4. Análise histológica

  1. Resfriar os histológicos contendo os espécimes de tecido embebidos em parafina, colocando-os no gelo por pelo menos 1 h. Usando um micrótomo, prepare cortes de 5 μm de espessura para coloração. Cada tecido deve ser cortado horizontalmente para cobrir todo o espécime laminado.
    1. Após o corte do bloco de parafina, transfira os cortes de tecido para banho-maria aquecido a 45 °C e coloque os cortes em lâminas carregadas. Deixe as corrediças em um rack durante a noite em temperatura ambiente para secar.
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui, e as lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente.
  2. Coloque as corrediças em um suporte de corrediça e leve ao forno a 65 °C durante a noite. As lâminas podem ser assadas por um tempo mais curto, 1-2 h. No entanto, isso não é aconselhável no caso de lâminas recém-cortadas (menos de 1 mês de idade).
    OBS: Coloque o conjunto de coloração manual sob o capô químico e realize as incubações com xileno, etanol e hematoxilina sob o capô químico.
  3. No dia seguinte, resfrie as lâminas colocando-as em um suporte de corrediças sob o capô químico por 10 min.
  4. Desparafinizar os tecidos colocando o suporte de lâmina em um recipiente preenchido com xilol 100% por 3 min. Repita a incubação usando 100% de xileno fresco.
    NOTA: A partir desse momento, certifique-se de que os espécimes sejam mantidos úmidos o tempo todo.
    CUIDADO: O xileno é uma substância potencialmente perigosa: inflamável (GHS02), causando toxicidade aguda (GHS07) e um perigo para a saúde (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Os potenciais efeitos perigosos são que é fatal se ingerido ou entra nas vias aéreas e pode causar irritação na pele, nos olhos e nas vias respiratórias. Além disso, pode afetar as funções motoras, causando sonolência ou tonturas e causar danos aos órgãos em caso de exposição prolongada ou repetida.
  5. Reidratar seções em um gradiente de etanol colocando o suporte deslizante sequencialmente em recipientes cheios com as seguintes soluções: etanol 100%, 2 min; etanol 95%, 2 min; Etanol 70%, 2 min.
  6. Transfira o suporte deslizante para o recipiente cheio de água destilada e enxágue em água destilada corrente por 2 min.
  7. Coloque o suporte de corrediça em um recipiente cheio de solução de hematoxilina e core por 5 min (sob o capô químico).
  8. Transfira o suporte da corrediça para o recipiente cheio de água da torneira e enxágue em água corrente da torneira até que a coloração da hematoxilina fique azulada, normalmente após 2 minutos.
  9. Transfira o suporte deslizante para o recipiente preenchido com solução de carbonato de lítio a 5% (p/v). Mergulhe 10x.
    CUIDADO: O carbonato de lítio é uma substância potencialmente perigosa: causa toxicidade aguda (GHS07) e um perigo para a saúde (H302 - H319). É prejudicial se ingerido, prejudicial em contato com a pele e causa irritação ocular grave.
  10. Transfira o suporte deslizante para o recipiente cheio de água destilada e enxágue em água destilada corrente por 2 min.
  11. Coloque o suporte deslizante em um recipiente cheio de eosina e manche por 5 min.
  12. Transfira o suporte da corrediça para o recipiente preenchido com etanol 70% e enxágue brevemente (10 s).
  13. Desidratar as seções colocando o suporte deslizante sequencialmente nos recipientes cheios com soluções de gradiente de etanol: etanol 95%, 5 mergulhos; 100% etanol, 5 mergulhos.
  14. Limpe as lâminas colocando o suporte de corrediças no recipiente cheio com 100% de xileno por 3 min. Repita a incubação usando 100% de xileno fresco.
  15. Retire a lâmina do rack, seque a área ao redor dos tecidos usando um papel toalha e, dependendo do tamanho da amostra, adicione uma ou duas gotas de meio de montagem à base de xileno na superfície da amostra. Monte colocando suavemente uma tampa em cima da lâmina de vidro (cuidado para não deixar bolhas de ar). Pressione suavemente, se necessário. Toda a superfície do vidro deve ser coberta e selada.
  16. Seque as lâminas, deixando-as sob o capô químico durante a noite. Normalmente, o meio de montagem solidifica-se em menos de 24 horas. Para garantir que as lâminas estejam secas, uma lâmina de amostra pode ser feita. Usando uma lâmina vazia, coloque uma gota do meio de montagem e deixe sob o capô químico durante a noite. No dia seguinte, toque na gota e verifique se ela está solidificada.
  17. Quando as lâminas secarem, analise a histologia dos tecidos usando um microscópio de luz ou um microscópio mais avançado com um canal de campo brilhante.
    1. Coloque uma lâmina de microscópio no palco, mova-se até que a amostra esteja no centro do campo de visão, ajuste o foco usando o botão de foco e use uma lente objetiva de aumento de 10x e/ou 20x para analisar a histologia em comparação com os tecidos controle (sham irradiado).
    2. Se o microscópio estiver equipado com uma câmera, tire fotos também.
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui; As lâminas podem ser armazenadas em temperatura ambiente e analisadas posteriormente. Não mantenha as lâminas por mais de 30 dias, pois a coloração desaparece lentamente.

5. Coloração por imunofluorescência

  1. Resfriar os histológicos contendo espécimes de tecido embebidos em parafina, colocando-os no gelo por pelo menos 1 h. Usando um micrótomo, prepare cortes de 5 μm de espessura para coloração. Cada tecido deve ser cortado horizontalmente para cobrir todo o espécime laminado.
    1. Após o corte do bloco de parafina, transfira os cortes de tecido para banho-maria aquecido a 45 °C e coloque os cortes em lâminas carregadas. Deixe as corrediças em um rack durante a noite em temperatura ambiente para secar.
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui, e as lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente.
  2. Coloque as corrediças em um suporte de corrediça e leve ao forno a 65 °C durante a noite. As lâminas podem ser assadas por um tempo mais curto, 1-2 h. No entanto, isso não é aconselhável no caso de lâminas recém-cortadas (menos de 1 mês atrás).
    NOTA: Coloque o conjunto de coloração manual sob o capô químico e realize as incubações com xileno, etanol e H 2 O2/metanol sob o capô químico.
  3. No dia seguinte, resfrie as lâminas colocando-as em um suporte de corrediças sob o capô químico por 10 min.
  4. Desparafinizar os tecidos colocando o suporte de lâmina em um recipiente preenchido com xilol 100% por 3 min. Repita a incubação usando 100% de xileno fresco.
    NOTA: A partir desse momento, certifique-se de que os espécimes sejam mantidos úmidos o tempo todo.
  5. Atenuar a peroxidase endógena incubando as lâminas por 30 min em um recipiente preenchido com solução de peróxido de hidrogênio a 2% em metanol sob a capela química.
    CUIDADO: O álcool metílico é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H225-H301, H311, H331-H370), inflamável (GHS02), e causa toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) (GHS08). O peróxido de hidrogênio é uma substância potencialmente perigosa: corrosiva (GHS05) e causa toxicidade aguda (GHS07).
  6. Reidratar as seções em um gradiente de etanol colocando o suporte deslizante sequencialmente em recipientes cheios com as seguintes soluções: etanol 100%, 3 min; etanol 95%, 3 min; Etanol 70%, 3 min.
  7. Transfira o suporte da corrediça para um recipiente cheio de água destilada e enxágue em água destilada corrente por 2 min.
  8. Para recuperar os antígenos, transferir o suporte de lâmina para um recipiente com 250 mL de solução tampão citrato (citrato de sódio 10 mM, Tween-20 a 0,05%, pH 6,0) e cozinhar a 110 °C por 10 min usando uma câmara de descamuflagem.
  9. Transfira todo o recipiente para a câmara fria e deixe o resfriamento gradual ao longo de 30 min.
  10. Após 30 min, substituir a solução tampão citrato por água destilada e enxaguar em água destilada corrente até que todos os pedaços de parafina flutuante sejam removidos.
  11. Retire as lâminas do suporte (uma de cada vez), toque em um papel toalha e seque cuidadosamente a área ao redor do espécime com um papel toalha. Desenhe uma forma fechada ao redor do espécime usando uma caneta que forneça uma barreira hidrofóbica (caneta PAP). Coloque em uma câmara umedificada.
  12. Bloquear com albumina de soro bovino (BSA) a 5% em TBS-Tween adicionando 200 μL da solução na superfície de uma amostra. Certifique-se de que não há vazamento. Incubar a 37 °C numa câmara humidificada durante 30 min.
  13. Retire a solução de bloqueio batendo a lâmina de vidro em um papel toalha. Coloque novamente em uma câmara umedecida. Adicionar 100 μL da concentração adequada dos anticorpos primários ressuspensos num tampão de bloqueio e incubar a 4 °C com balanço suave durante a noite. Para IMC1/EYFP, utilizar frango anti-GFP (diluição 1:500); para Ki-67, utilizar coelho anti-Ki-67 (diluição 1:200).
  14. Remova a solução de anticorpos batendo a lâmina de vidro em uma toalha de papel; Coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente preenchido com TBS-Tween. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 3x. De cada vez, use uma nova porção de buffer TBS-Tween.
  15. Retire as lâminas do suporte (uma de cada vez), remova o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Adicionar 100 μL da concentração adequada de anticorpos secundários ressuspensos num tampão de bloqueio e incubar a 37 °C durante 30 minutos. Os anticorpos secundários devem ser conjugados com um fluoróforo. Para IMC1/EYFP, use burro anti-frango Alexa Fluor 647 (diluição 1:500); para Ki-67, use cabra anti-coelho Alexa Fluor 488 (diluição 1:500).
  16. Remova a solução de anticorpos batendo a lâmina de vidro em uma toalha de papel; Coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente preenchido com TBS-Tween. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 3x. De cada vez, use uma nova porção de buffer TBS-Tween.
  17. Retire as lâminas do suporte (uma de cada vez), remova o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Adicionar 100 μL da solução corante de EdU preparada de acordo com as instruções do fabricante e utilizando o fluoroforo Alexa Fluor 555.
  18. Retire a solução de EdU batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; Coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente preenchido com TBS-Tween. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 2x. De cada vez, use uma nova porção de buffer TBS-Tween.
  19. Retire os slides do suporte (um de cada vez); Retire o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Efectuar a contracoloração Hoechst 33258 adicionando 100 μL da solução Hoechst 33258 (diluição 1:1000 em TBS-Tween) na superfície da amostra. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 5 minutos.
  20. Retire a solução Hoechst 33258 batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para um recipiente cheio de TBS-Tween. Lave as lâminas com agitação por 5 min.
  21. Retire a lâmina do suporte da lâmina, seque a área ao redor dos tecidos usando uma toalha de papel e, dependendo do tamanho da amostra, adicione uma ou duas gotas de meio de montagem à base de água na superfície da amostra. Monte colocando suavemente uma tampa em cima da lâmina de vidro (cuidado para não deixar bolhas de ar). Pressione suavemente, se necessário. Toda a superfície do vidro deve ser coberta e selada.
  22. Seque as lâminas, deixando-as no escuro à temperatura ambiente durante a noite. Normalmente, a mídia de montagem se solidifica em menos de 24 h. Para garantir que as lâminas estejam secas, uma lâmina de amostra pode ser feita. Use um slide vazio; Coloque uma gota do meio de montagem e deixe sob o capô químico durante a noite. No dia seguinte, toque na gota e verifique se ela está solidificada.
  23. Quando as lâminas secam, os tecidos corados podem ser analisados usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros de comprimento de onda de emissão, permitindo a visualização das colorações Ki-67, EdU e IMC1/EYFP (535 nm, 646 nm e 700 nm, respectivamente).
  24. Coloque uma lâmina de microscópio no palco, mova até que a amostra esteja no centro do campo de visão, ajuste o foco usando o botão de foco e use a lente objetiva de aumento de 10x e/ou 20x para analisar a coloração em comparação com os tecidos controle (sham irradiado). Se o microscópio estiver equipado com uma câmera, as imagens também podem ser tiradas. Tire imagens para cada canal separadamente e mescle mais tarde.
    NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui; as lâminas podem ser armazenadas a 4 °C e analisadas posteriormente. Não mantenha as lâminas por mais de 14 dias, pois a coloração desaparece lentamente.

6. Coloração TUNEL

  1. Resfriar os histológicos contendo espécimes de tecido embebidos em parafina, colocando-os no gelo por pelo menos 1 h. Usando um micrótomo, prepare cortes de 5 μm de espessura para coloração. Cada tecido deve ser cortado horizontalmente para cobrir todo o espécime laminado.
    1. Após o corte do bloco de parafina, transfira os cortes de tecido para banho-maria aquecido a 45 °C e coloque os cortes em lâminas carregadas. Deixe as corrediças em um rack durante a noite em temperatura ambiente para secar.
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui, e as lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente.
  2. Coloque as corrediças em um suporte de corrediça e leve ao forno a 65 °C durante a noite.
    NOTA: As lâminas podem ser assadas por um tempo mais curto, 1-2 horas. No entanto, não é aconselhável no caso de lâminas recém-cortadas (há menos de 1 mês). Coloque o conjunto de coloração manual sob a coifa química e realize as incubações com xileno e etanol sob a coifa química.
  3. No dia seguinte, resfrie as lâminas colocando-as em um suporte de corrediças sob o capô químico por 10 min.
  4. Desparafinizar os tecidos colocando o suporte das lâminas em um recipiente preenchido com xileno 100% por 3 min. Repita a incubação usando 100% de xileno fresco.
    NOTA: A partir deste ponto, certifique-se de que os espécimes sejam mantidos úmidos o tempo todo.
  5. Reidratar as seções em um gradiente de etanol colocando o suporte de lâminas sequencialmente em recipientes preenchidos com as seguintes soluções: etanol 100%, 3 min; etanol 95%, 3 min; etanol 90%, 3 min; etanol 80%, 3 min; Etanol 70%, 3 min.
  6. Transfira o suporte da corrediça para um recipiente cheio de água destilada e enxágue em água destilada corrente por 1 min.
  7. Retire as lâminas do suporte (uma de cada vez), toque em um papel toalha e seque cuidadosamente a área ao redor do espécime com um papel toalha. Desenhe uma forma fechada ao redor do espécime usando uma caneta que forneça uma barreira hidrofóbica (caneta PAP). Coloque em uma câmara umedificada.
  8. Incubar com proteinase K livre de DNase. Adicionar 100 μL da solução de proteinase K livre de DNase (diluição 1:25 em DPBS) na superfície da amostra dentro da barreira hidrofóbica. Incubar à temperatura ambiente numa câmara humidificada durante 15 min.
    CUIDADO: A proteinase K é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H315 - H319 - H334).
  9. Retire a solução de proteinase K batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente cheio de DPBS. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 2x. De cada vez, use uma nova porção de DPBS.
  10. Preparar a mistura de reacção TUNEL: Misturar a solução do rótulo (1x) com a solução enzimática (10x). Pipetar bem.
  11. Retire os slides do suporte (um de cada vez); Retire o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Adicionar 50 μL de mistura de reacção TUNEL à superfície da amostra e incubar no escuro a 37 °C numa câmara humidificada durante 60 minutos. Para um controle negativo, use apenas a solução de rótulo (sem TdT).
  12. Retire a solução TUNEL batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; coloque os slides em um suporte de slides e transfira para um contêiner cheio de DPBS. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 2x. De cada vez, use uma nova porção de DPBS.
  13. Retire os slides do suporte (um de cada vez); Retire o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Efectuar a contracoloração Hoechst 33258 adicionando 100 μL da solução Hoechst 33258 (diluição 1:1000 em TBS-Tween) na superfície da amostra. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 5 minutos.
  14. Retire a solução Hoechst 33258 batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente cheio de DPBS. Lave as lâminas com agitação por 5 min.
  15. Retire o slide do suporte do slide; Seque a área ao redor dos tecidos usando um papel toalha e, dependendo do tamanho do espécime, adicione uma ou duas gotas de meio de montagem à base de água na superfície do espécime. Monte colocando suavemente uma tampa em cima da lâmina de vidro (cuidado para não deixar bolhas de ar). Pressione suavemente, se necessário. Toda a superfície do vidro deve ser coberta e selada.
  16. Seque as lâminas, deixando-as no escuro à temperatura ambiente durante a noite. Normalmente, o meio de montagem solidifica-se em menos de 24 horas. Para garantir que as lâminas estejam secas, uma lâmina de amostra pode ser feita. Coloque uma gota do meio de montagem e deixe no escuro em temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, toque na gota e verifique se ela está solidificada.
  17. Quando as lâminas secam, os tecidos corados podem ser analisados usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros de comprimento de onda de emissão, permitindo a visualização da coloração TUNEL (535 nm).
  18. Coloque uma lâmina de microscópio no palco, mova-se até que a amostra esteja no centro do campo de visão, ajuste o foco usando o botão de foco e use uma lente objetiva de aumento de 10x e/ou 20x para analisar a coloração em comparação com os tecidos controle (irradiação simulada). Se o microscópio estiver equipado com uma câmera, as imagens também podem ser tiradas. Tire imagens para cada canal separadamente e mescle mais tarde.
    NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui; as lâminas podem ser armazenadas a 4 °C e analisadas posteriormente. Não mantenha as lâminas por mais de 14 dias, pois a coloração desaparece lentamente.

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Resultados

O uso de irradiação de corpo total (TCE) de 12 Gy em combinação com o rastreamento de linhagem genética murina permite uma análise completa das consequências da lesão por radiação no intestino. Para começar, Bmi1-CreER; Camundongos Rosa26eYFP receberam uma única injeção de tamoxifeno, que induz a expressão aumentada da proteína fluorescente amarela (EYFP) dentro de uma população de células-tronco de reserva Bmi1+ . Dois dias após a injeção de tamoxifeno, os camundongos foram subm...

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Discussão

Este protocolo descreve um modelo robusto e reprodutível de lesão por radiação. Permite a análise precisa das alterações no epitélio intestinal ao longo de 7 dias pós-lesão. É importante ressaltar que os momentos selecionados refletem estágios cruciais da lesão e são caracterizados por alterações distintas no intestino (lesão, apoptose, regeneração e fases de normalização)60. Esse modelo de irradiação foi estabelecido e cuidadosamente avaliado, demonstrando uma manifestação de lesão adequada para ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer ao Stony Brook Cancer Center Histology Research Core pela assistência especializada com a preparação de espécimes de tecido e à Divisão de Recursos de Animais de Laboratório da Stony Brook University pela assistência com cuidados e manuseio de animais. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde DK124342 concedidos a Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 ao Dr. Vincent W. Yang.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 1 mLBD
309659-16G Reutilizável Agulhas de alimentação para pequenos animais: RetaVWR20068-630-27G
x agulha de 1/2"BD
305109-28G x 1/2" Seringa de insulina Monoject 1mLCovidien
′-desoxiuridina (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL em DMSO estéril: água (1:4 v/v), alíquota e armazenar em -20° C
Azer Scientific  10% de Formalina Tamponada NeutraFisher Scientific22-026-213-B6.129X1-Gt
(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JA Cepa do Laboratório Jackson#:006148
B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain #:010531
Soro bovino Albumina Fraction V, choque térmicoMillipore-Sigma3116956001
Frango anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 kit de imagem, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-Óleo
milhoMillipore-SigmaC8267-Decloaking
ChamberBiocare MedicalDC2012-Dimetilsulfóxido
(DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100
proteinase livre de DNaseInvitrogenC10618Hdiluída 25x em DPBS
Donkey anti-frango AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Microscópio de21-031-CV-Eosin
Fisher ScientificS176
Nikon Eclipse 90i Luz brilhante e fluoerescente, com objetivas: 10X, 20XMeio
FluoromountMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0,759 Gy min-1
Goat anti-coelho AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Solução de hematoxilina, Gill No. 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 micrótomo rotativo da Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, pentahidratado (bis-benzimida)Thermo Fisher ScientificSoluçãodiluição H3569 1:1000
, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-In
, Fluoresceína (Roche)Millipore-Sigma11684795910
Bloqueador de líquidos Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Carbonato de lítio (pó/ACS certificado), Fisher ChemicalSeringa Luer-Lok Fisher ScientificL119-5000.5g/1L dH2O
estéril, uso único, 10 mLVWR89215-218-Metanol
VWRBDH1135-4LP
Produtos Pharmco  Álcool etílico, 200 PROOFFisher Scientific
NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Ácido Acético Grau ACSCapitolScientific AAP-281000ACSCSLT-Rabbit
anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Meio de MontagemFisher Scientific22-050-262
Incubadora Scientific Industries-Genie para assar lâminas a 65 grausFisher Scientific50-728-103
Citrato de Sódio DihidratadoFisher ScientificS279-500
VWR25640-002
Superfrost Plus micro lâminas [tamanho: 25 x 75 x 1 mm]VWR  48311-703
TamoxifenoMillipore-SigmaT564830 mg/mL em óleo de milho estéril, de preferência fresco ou armazenamento de curto prazo em -20° C, Suportes de
24 Lâminas Tissue-Tek sensíveis à luz com alça destacávelSakura4465
Tissue-Tek  Accu-Edge  Lâminas de Perfil BaixoSakura4689
Tissue-Tek  Conjunto de coloração manualSakura4451
Tissue-Tek Prato de coloração, Verde com tampaSakura4456
Prato de coloração Tissue-Tek, Branco com tampaSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
de Processamento UnisetteVWR87002-292-VWR
Micro Cover GlassesVWR48393-081
XyleneFisher ScientificX5P-1GAL
1188128012-5-Etinil-2 de sensível à luz K Fluorescência Scientific de Montagem Aquosa Nikon de peróxido de hidrogênio Kit de detecção de morte celular in situ Kit de Dissecação de Aço Inoxidável

Referências

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63(2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300(2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984(2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667(2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387(2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208(2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855(2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186(2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29(2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649(2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740(2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161(2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421(2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952(2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308(2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965(2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783(2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644(2017).

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