O trato gastrointestinal é um dos órgãos mais sensíveis à lesão no tratamento radioterápico do câncer. É simultaneamente um sistema orgânico com uma das mais altas capacidades regenerativas após tais insultos. O protocolo apresentado descreve um método eficiente para estudar a capacidade regenerativa do epitélio intestinal.
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Artigo de método
Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante
Neste artigo
Resumo
Resumo
O epitélio intestinal consiste de uma única camada de células, mas contém múltiplos tipos de células terminalmente diferenciadas, que são geradas pela proliferação ativa de células-tronco intestinais localizadas no fundo das criptas intestinais. No entanto, durante eventos de lesão intestinal aguda, essas células-tronco intestinais ativas sofrem morte celular. A irradiação gama é um tratamento de câncer colorretal amplamente utilizado, que, embora terapeuticamente eficaz, tem o efeito colateral de esgotar o pool ativo de células-tronco. De fato, os pacientes frequentemente experimentam síndrome de radiação gastrointestinal durante a radioterapia, em parte devido à depleção ativa de células-tronco. A perda de células-tronco intestinais ativas em criptas intestinais ativa um pool de células-tronco intestinais de reserva tipicamente quiescentes e induz a desdiferenciação de células precursoras secretoras e enterocitárias. Se não fossem essas células, o epitélio intestinal não teria a capacidade de se recuperar da radioterapia e de outros grandes insultos teciduais. Novos avanços em tecnologias de rastreamento de linhagem permitem o rastreamento da ativação, diferenciação e migração de células durante a regeneração e têm sido empregados com sucesso para estudar isso no intestino. Este estudo tem como objetivo descrever um método para a análise de células dentro do epitélio intestinal de camundongos após lesão por radiação.
Introdução
O epitélio intestinal humano cobriria aproximadamente a superfície de meia quadra de badminton se colocado completamente plano1. Em vez disso, essa única camada de células que separa os humanos do conteúdo de seus intestinos é compactada em uma série de projeções semelhantes a dedos, vilosidades e reentrâncias, criptas que maximizam a área de superfície dos intestinos. As células do epitélio diferenciam-se ao longo de um eixo cripta-vilosidade. As vilosidades consistem principalmente de enterócitos absorvedores de nutrientes, células caliciformes secretoras de muco e células enteroendócrinas produtoras de hormônios, enquanto as criptas consiste....
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Protocolo
Todos os camundongos foram alojados na Divisão de Recursos Animais de Laboratório (DLAR) da Stony Brook University. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Stony Brook University (IACUC) aprovou todos os estudos e procedimentos envolvendo cobaias animais. Os experimentos envolvendo animais foram conduzidos estritamente de acordo com o protocolo aprovado de manejo de animais (IACUC #245094).
NOTA: As estirpes de rato B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) e B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais) e cru....
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Resultados
O uso de irradiação de corpo total (TCE) de 12 Gy em combinação com o rastreamento de linhagem genética murina permite uma análise completa das consequências da lesão por radiação no intestino. Para começar, Bmi1-CreER; Camundongos Rosa26eYFP receberam uma única injeção de tamoxifeno, que induz a expressão aumentada da proteína fluorescente amarela (EYFP) dentro de uma população de células-tronco de reserva Bmi1+ . Dois dias após a injeção de tamoxifeno, os camundongos foram subm.......
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Discussão
Este protocolo descreve um modelo robusto e reprodutível de lesão por radiação. Permite a análise precisa das alterações no epitélio intestinal ao longo de 7 dias pós-lesão. É importante ressaltar que os momentos selecionados refletem estágios cruciais da lesão e são caracterizados por alterações distintas no intestino (lesão, apoptose, regeneração e fases de normalização)60. Esse modelo de irradiação foi estabelecido e cuidadosamente avaliado, demonstrando uma manifestação de lesão adequada para .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer ao Stony Brook Cancer Center Histology Research Core pela assistência especializada com a preparação de espécimes de tecido e à Divisão de Recursos de Animais de Laboratório da Stony Brook University pela assistência com cuidados e manuseio de animais. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde DK124342 concedidos a Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 ao Dr. Vincent W. Yang.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de 1 mL | BD | ||
| 309659-16G Reutilizável Agulhas de alimentação para pequenos animais: Reta | VWR | 20068-630-27G | |
| x agulha de 1/2" | BD | ||
| 305109-28G x 1/2" Seringa de insulina Monoject 1mL | Covidien | ||
| ′-desoxiuridina (EdU) | Santa Cruz Biotechnology | sc284628A | 10 mg/mL em DMSO estéril: água (1:4 v/v), alíquota e armazenar em -20° C |
| Azer Scientific 10% de Formalina Tamponada Neutra | Fisher Scientific | 22-026-213-B6.129X1-Gt | |
| (ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | A Cepa do Laboratório Jackson | #:006148 | |
| B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J | The Jackson Laboratory | Strain #:010531 | |
| Soro bovino Albumina Fraction V, choque térmico | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
| Frango anti-GFP | Aves | GFP-1020 | |
| Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 kit de imagem, Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638-Óleo | |
| milho | Millipore-Sigma | C8267-Decloaking | |
| Chamber | Biocare Medical | DC2012-Dimetilsulfóxido | |
| (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
| proteinase livre de DNase | Invitrogen | C10618H | diluída 25x em DPBS |
| Donkey anti-frango AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
| DPBS | Fisher Microscópio de | 21-031-CV-Eosin | |
| Fisher Scientific | S176 | ||
| Nikon Eclipse 90i Luz brilhante e fluoerescente, com objetivas: 10X, 20X | Meio | ||
| Fluoromount | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
| Gamma Cell 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | - | 0,759 Gy min-1 |
| Goat anti-coelho AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| Solução de hematoxilina, Gill No. 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
| HM 325 micrótomo rotativo da Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668 | |
| Hoechst 33258, pentahidratado (bis-benzimida) | Thermo Fisher Scientific | Solução | diluição H3569 1:1000 |
| , ACS, 29-32%, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-603-252-In | |
| , Fluoresceína (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
| Bloqueador de líquidos Super PAP PEN, Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Carbonato de lítio (pó/ACS certificado), Fisher Chemical | Seringa Luer-Lok Fisher Scientific | L119-500 | 0.5g/1L dH2O |
| estéril, uso único, 10 mL | VWR | 89215-218-Metanol | |
| VWR | BDH1135-4LP | ||
| Produtos Pharmco Álcool etílico, 200 PROOF | Fisher Scientific | ||
| NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Ácido Acético Grau ACS | Capitol | Scientific AAP-281000ACSCSLT-Rabbit | |
| anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
| Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Meio de Montagem | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Incubadora Scientific Industries-Genie para assar lâminas a 65 graus | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
| Citrato de Sódio Dihidratado | Fisher Scientific | S279-500 | |
| VWR | 25640-002 | ||
| Superfrost Plus micro lâminas [tamanho: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Tamoxifeno | Millipore-Sigma | T5648 | 30 mg/mL em óleo de milho estéril, de preferência fresco ou armazenamento de curto prazo em -20° C, Suportes de |
| 24 Lâminas Tissue-Tek sensíveis à luz com alça destacável | Sakura | 4465 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Lâminas de Perfil Baixo | Sakura | 4689 | |
| Tissue-Tek Conjunto de coloração manual | Sakura | 4451 | |
| Tissue-Tek Prato de coloração, Verde com tampa | Sakura | 4456 | |
| Prato de coloração Tissue-Tek, Branco com tampa | Sakura | 4457 | |
| Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
| de Processamento Unisette | VWR | 87002-292-VWR | |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48393-081 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL |
Referências
- Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
- vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithel....
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Reimpressões e permissões
