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Artigo de método

Construção de vetores adenovirais usando tecnologia de montagem de DNA

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DOI:

10.3791/64033

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16 de junho de 2022

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1NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 2Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, National Center for Children’s Health, 3Henan Chemical Technician College, 4Research Unit of Critical Infection in Childre, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Chinese Academy of Sciences Joint Research Center for Emerging Infectious Diseases and Biosafety, Chinese Center for Disease Control and Prevention-Wuhan Institute of Virology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste estudo, um clone infeccioso de adenovírus humano tipo 7 (HAdV-7) foi construído, e um sistema vetorial HAdV-7 deletado por E3 foi estabelecido modificando o clone infeccioso. Essa estratégia usada aqui pode ser generalizada para fazer vetores de transferência de genes de outros adenovírus do tipo selvagem.

Resumo

Os vetores adenovirais têm sido usados como ferramenta de transferência de genes na terapia gênica há mais de três décadas. Aqui, apresentamos um protocolo para construir um vetor adenoviral manipulando o DNA genômico do HAdV-7 do tipo selvagem usando um método de montagem de DNA. Primeiro, um clone infeccioso de HAdV-7, pKan-Ad7, foi gerado pela fusão do DNA genômico viral com um produto de PCR da estrutura do plasmídeo, compreendendo o gene resistente à canamicina e a origem da replicação (Kan-Ori), por meio da montagem do DNA. Isso foi feito projetando um par de primers de PCR, que continham ~ 25 nucleotídeos da sequência terminal de HAdV-7 invertida terminal (ITR) na extremidade 5 ', um local de enzima de restrição sem cortador para o genoma HAdV-7 no meio e uma sequência específica do modelo para PCR priming na extremidade 3 '. Em segundo lugar, uma estratégia intermediária baseada em plasmídeo foi empregada para substituir a região E3 por elementos que expressam transgenes no clone infeccioso para gerar um vetor adenoviral. Resumidamente, pKan-Ad7 foi digerido com enzima de restrição de corte duplo Hpa I, e o fragmento contendo a região E3 foi ligado a outro produto de PCR do esqueleto do plasmídeo por montagem de Gibson para construir um plasmídeo intermediário pKan-Ad7HpaI. Por conveniência, a montagem de restrição foi usada para designar o método de clonagem de plasmídeo de digestão e montagem de restrição combinada. Usando montagem de restrição, os genes E3 em pKan-Ad7HpaI foram substituídos por um de expressão de proteína fluorescente verde (GFP), e a região E3 modificada foi liberada do plasmídeo intermediário e restaurada ao clone infeccioso para gerar um plasmídeo adenoviral pKAd7-E3GFP. Finalmente, pKAd7-E3GFP foi linearizado por digestão de Pme I e usado para transfectar células de empacotamento HEK293 para resgatar o vírus HAdV-7 recombinante. Para concluir, uma estratégia baseada em montagem de DNA foi introduzida aqui para a construção de vetores adenovirais em laboratórios gerais de biologia molecular sem a necessidade de materiais e instrumentos especializados.

Introdução

Nas últimas três décadas, os vetores adenovirais recombinantes têm sido amplamente utilizados no desenvolvimento de vacinas e terapia gênica 1,2,3,4 bem como na pesquisa básica devido às suas excelentes propriedades biológicas, como alta eficiência de transdução gênica, não integração ao genoma do hospedeiro, genoma viral manipulativo e facilidade de produção em larga escala.

Atualmente, os vetores adenovirais mais comumente utilizados são construídos com base no adenovírus humano 5 (HAdV-5)5,6. Embora a transdução mediada por vetor HAdV-5 forneça resultados encorajadores, as aplicações pré-clínicas e clínicas revelaram várias desvantagens (por exemplo, alta imunidade antivetorial pré-existente na população humana e baixa eficiência de transdução em células sem o vírus coxsackie e o receptor de adenovírus (CAR)). Para contornar esses problemas, tem havido um grande interesse em construir vetores baseados em outros tipos de adenovírus humanos ou de mamíferos 3,7,8.

Até agora, o método mais popular para construir um vetor adenoviral é a recombinação homóloga em bactérias5. Essas cepas bacterianas devem expressar recombinases, o que pode afetar a estabilidade ou amplificação dos plasmídeos que carregam. Algumas cepas estão até mesmo comercialmente indisponíveis. Recentemente, métodos baseados em outros princípios, incluindo cromossomos artificiais bacterianos, clonagem direta ou montagem direta de DNA, têm sido empregados para gerar clones infecciosos de adenovírus ou vetores adenovirais recombinantes 9,10,11,12. No entanto, esses métodos são um tanto hostis para pesquisadores com pouca experiência neste campo.

Em 2018, o processo de construção de um clone infeccioso de adenovírus é simplificado em laboratório, ligando diretamente o genoma do vírus a um produto de PCR que transporta a estrutura do plasmídeo através da montagem de Gibson13. Depois disso, os métodos de digestão de restrição e montagem de Gibson são combinados para carregar transgenes em plasmídeos adenovirais existentes 14,15,16,17,18. Por uma questão de conveniência, a montagem de restrição é usada a seguir para se referir ao método de digestão combinada da enzima de restrição e montagem de Gibson. Estratégias foram desenvolvidas para construir vetores adenovirais a partir de clones infecciosos usando montagem de restrição19. A essência da montagem de restrição é incluir fragmentos extirpados de plasmídeos tanto quanto possível em uma reação de montagem de DNA, enquanto produtos de PCR curtos servem como ligantes ou patches para modificação de plasmídeo. Ao mesmo tempo, o número de fragmentos incluídos é mantido o mais baixo possível. Tais esforços refletem a recompensa; a possibilidade de mutações indesejadas causadas por PCR ou montagem de DNA pode ser minimizada e a taxa de sucesso pode ser melhorada. Conclusivamente, um pipeline de um adenovírus de tipo selvagem para um vetor adenoviral foi estabelecido em laboratório 13,14,15,16,17,18,19.

Aqui, tentamos apresentar esses métodos fornecendo exemplos de construção de um clone infeccioso HAdV-7 e um vetor HAdV-7 competente para replicação deletado por E3.

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Protocolo

NOTA: Os adenovírus são classificados como Nível de Biossegurança 2 (BSL-2); Todas as etapas para o uso dos vírus foram realizadas em um laboratório de nível de biossegurança 2. O HAdV-7 do tipo selvagem foi isolado em 2017 a partir da amostra de aspirado nasofaríngeo de um bebê de 10 meses que foi hospitalizado com infecção aguda do trato respiratório no Hospital Infantil de Pequim20. Os estoques de vírus foram armazenados a -80 °C.

1. Extração do DNA genômico HAdV-7

  1. Semear 2,0 x 106 das células HEK293 em um frasco T-25 contendo 5 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) mais 10% de soro fetal bovino (FBS) e cultura a 37 °C em atmosfera umidificada suplementada com 5% de CO2. As células devem estar 80% a 90% confluentes e prontas para infecção em 18-24 h.
  2. Inocular as células com HAdV-7 de tipo selvagem durante 2 h. Remova o meio contendo vírus por aspiração e adicione 5 mL de DMEM fresco contendo 2% de FBS às células.
  3. Extrair o DNA genômico viral com o método de Hirt modificado21
    1. Em 2 ou 3 dias após a infecção, quando o efeito citopático (CPE) for observado em 50% a 90% das células, descarte o sobrenadante da cultura e enxágue as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
      NOTA: O efeito citopático (CPE) é definido como um fenômeno em que as células infectadas pelo vírus se arredondam, incham e se fixam ou se desprendem frouxamente do frasco de cultura em cachos semelhantes a uvas22.
    2. Lise as células no frasco em 1,0 mL de tampão de lise contendo 25 mM de Tris-HCl, 0,5 mM de EDTA, 50 μg/mL de protease K e 0,8% de SDS (pH 7,6) por 5 min em gelo. Transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e incubar o tubo em banho-maria a 50 °C durante 30 min.
    3. Adicione 120 μL de tampão de precipitação ao tubo. Coloque o tubo no gelo por mais 30 minutos depois de misturar suavemente.
      NOTA: O tampão de precipitação é composto por 3 M CsCl, 1 M de acetato de potássio e 0.67 M de ácido acético. Isso ajudará a precipitar os detritos celulares e o DNA do cromossomo celular após a centrifugação, mantendo o genoma do vírus no sobrenadante.
    4. Centrifugue o tubo por 25 min a 15.000 x g a 4 ° C e, em seguida, transfira o sobrenadante (cerca de 1,1 mL) para um tubo de polipropileno de 15 mL.
    5. Adicione 2,2 mL de etanol absoluto gelado ao tubo. Misture delicadamente e deixe o tubo repousar no gelo por 15 min. Centrifugue por 5 min a 2000 x g em temperatura ambiente.
    6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e lavar o precipitado (ADN genómico do vírus) uma vez com 800 μL de etanol a 70%. Centrifugue o tubo por 6 min a 15.000 x g em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e secar ao ar o sedimento de ADN na parte inferior. Não seque demais o pellet de DNA, pois pode causar dificuldade em dissolver.
    7. Dissolva o pellet em 200 μL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA), adicione 1 μL de RNase A (10 mg / mL) e incube o tubo a 37 ° C por 15 min. Purifique o DNA dissolvido usando um kit comercial de limpeza e concentrador de DNA genômico (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: Quantifique o DNA genômico viral com o método comumente usado em laboratório. Geralmente, 1-5 μg de DNA genômico podem ser obtidos em um frasco T-25 de células HEK293 infectadas com adenovírus.

2. Construção de clone infeccioso de HAdV-7 por montagem de DNA

  1. Projete primers de PCR para amplificar o esqueleto do plasmídeo (Figura 1). Adicione as sequências de sobreposição necessárias para a montagem do DNA às extremidades 5 'dos primers de PCR. Além disso, inclua locais de restrição sem corte (por exemplo, local Pme I) em ambas as extremidades do genoma do HAdV-7 para ajudar a liberar o genoma viral do clone infeccioso.
    NOTA: A estrutura do plasmídeo contendo o gene resistente a antibióticos e a origem da replicação é amplificada por PCR e fundida ao genoma do HAdV-7. Os adenovírus podem ser resgatados de células de empacotamento com maior eficiência quando o genoma do vírus linearizado é usado em vez de um plasmídeo adenoviral circular. Depois de considerar os fatores mencionados acima, os primers são projetados conforme mostrado na Figura 1.
  2. Realize PCR para amplificar um fragmento (Kan-Ori) contendo o gene de resistência à canamicina (Kan) e a origem do pBR322 (Ori) usando pShuttle-CMV como modelo com primers de Ad7KanF1 e Ad7KanR1 (Tabela S1). Defina a reação de PCR da seguinte forma: um ciclo a 98 °C por 30 s, depois cinco ciclos de desnaturação a 98 °C por 8 s, recozimento a 68 °C por 30 s, extensão a 72 °C por 90 s e, finalmente, 25 ciclos de desnaturação a 98 °C por 8 s, recozimento e extensão a 72 °C por 2 min.
  3. Execute o produto de PCR em um gel de agarose a 1% por eletroforese e purifique o fragmento usando um kit comercial de recuperação de gel de DNA.
  4. Adicione o Kan-Ori recuperado e o DNA genômico viral do HAdV-7 ao Master Mix de Montagem de DNA comercial. Configure a reação de montagem em um volume total de 20 μL e uma proporção molar de vetor para DNA genômico viral de 1: 2. Incubar a 50 °C durante 1 h.
    NOTA: Defina a reação em um volume total de 20 μL com 1-3 μL de vetor, 7-9 μL de DNA genômico viral e 10 μL de DNA Assembly Master Mix.
  5. Transforme as células TOP10 da cepa de E. coli quimicamente competentes com 10 μL do produto de montagem usando choque térmico. Espalhe a mistura de transformação em placas Luria-Bertani (LB-Kan) contendo canamicina (50 μg/mL). Incubar as placas a 37 °C durante, pelo menos, 12 h.
  6. Inocular pelo menos três clones cada um em 5 ml de meio LB-Kan a 37 °C durante 12 h com agitação suave (200-250 rpm). Extraia o DNA do plasmídeo usando um kit comercial Plasmid Miniprep.
  7. Digerir o plasmídeo utilizando endonuclease de restrição e, em seguida, verificar o tamanho dos fragmentos de ADN com electroforese em gel de agarose (figura 2A). Além disso, confirme os locais de fusão por sequenciamento. O plasmídeo de montagem correto é denominado pKan-Ad7.
  8. Cultive uma cultura de 100 mL de bactérias a partir do clone correto. Extraia uma preparação de maxi-plasmídeo usando um kit comercial Plasmid Maxprep.

3. Construção in silico e modificação de um plasmídeo intermediário

NOTA: Geralmente, um plasmídeo intermediário deve ser construído, e como construir um plasmídeo intermediário ideal é o passo principal. Software de análise de DNA com um módulo de enzima de restrição, como o pDRAW32 (um software gratuito, disponível em www.acaclone.com), é necessário para o projeto de um plasmídeo intermediário.

  1. Importe a sequência de DNA de pKan-Ad7 para pDRAW32 para desenhar um mapa de plasmídeo. Anote as regiões de interesse no mapa. Para pKan-Ad7, as regiões E1, E3 e o backbone do plasmídeo (Kan-Ori) foram anotados.
  2. Opere o programa pDRAW32. Clique em Configurações > Seleção de enzimas primeiro e, em seguida, clique em Cortes mínimos/máximos. Insira 1 na caixa Min e insira 2 na caixa Max e marque a caixa antes em toda a sequência. Por fim, clique em OK para mostrar os locais de enzimas de restrição de cortador único e duplo no mapa.
    NOTA: Geralmente, apenas as enzimas de restrição que reconhecem uma sequência de 6 pb ou mais são selecionadas. Conforme mostrado na Figura 3A, 17 enzimas correspondem aos critérios de seleção enzimática.
  3. Considere o primeiro local de restrição que flanqueia a região E3 desde que a E3 está planejada para ser modificada. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I e Spe I satisfizeram o requisito.
    NOTA: Para este experimento, Hpa I é selecionado porque a digestão de pKan-Ad7 com ele geraria o fragmento mais curto carregando a região E3, e um plasmídeo intermediário menor facilitaria a modificação futura. A seleção de sítios Sal I também tem vantagens - tal plasmídeo intermediário é adequado para a modificação das regiões E1 e E3 (Figura S1).
  4. Crie um arquivo de sequência final exibindo ambas as fitas de DNA do plasmídeo intermediário pKan-Ad7HpaI. Essa sequência virtual pode ser usada como modelo para projetar primers sobrepostos.
    1. Copie a sequência entre os dois locais de restrição Hpa I, incluindo a região E3. Para montagem subsequente, é necessário copiar cada sequência de ~20 pb (Tm igual ou superior a 48°C) fora do local de restrição de Hpa I (Figura 3C, sobreposição-Final 1 e sobreposição-Final2).
    2. Adicione a sequência de reconhecimento de Pme I (Figura 3C, gtttaaac) em ambas as extremidades da sequência acima.
    3. Adicione a sequência de plasmídeo de backbone contendo gene resistente a antibióticos e origem de replicação (Figura 3C, Kan-Ori) fora do local de restrição de Pme I.
    4. Importe a sequência final para pDRAW32 para desenhar um mapa de plasmídeo. Anote a região E3 no mapa.
    5. Opere o programa pDRAW32. Clique em Configurações > Seleção de Enzimas primeiro e, em seguida, clique em Cortes Mín/Máximo. Insira 1 na caixa Min e Max e marque a caixa antes em toda a sequência. Clique em OK por último para mostrar os locais exclusivos da enzima de restrição no mapa. Pode-se ver que muitos cortadores exclusivos estão disponíveis para modificação do E3.
      NOTA: Para este experimento, BstZ17 I e Mlu I são selecionados para a substituição de E3 parcial. Um cortador duplo também pode ser útil. Por exemplo, o cortador duplo Ssp I junto com o cortador exclusivo BssH II pode ser selecionado para a substituição de toda a região E3 usando PCR de extensão de sobreposição.
  5. Projete primers usando a sequência virtual como modelo para a construção de plasmídeo intermediário ( Figura 3C ).
    NOTA: Para encurtar o comprimento de cada primer, quatro primers foram projetados. O produto de PCR, que é amplificado com primers de Ad7HpaIF1 e Ad7HpaIR1, seria usado como molde para obter o fragmento final de PCR com primers de Ad7HpaIF2 e Ad7HpaIR2 (Figura 3C).

4. Resgate de adenovírus recombinante infeccioso em células HEK293

NOTA: Os três adenovírus gerados neste artigo são todos resgatados de acordo com o protocolo a seguir.

  1. Digerir 10 μg de plasmídeo adenoviral recombinante com 2 μL de Pme I durante 5 h a 37 °C num volume total de 100 μL para linearizar o plasmídeo. Verifique 1 μL do DNA digerido em um gel de agarose a 0,8%. A digestão deve produzir um fragmento de ~ 34 kb do genoma adenoviral e uma estrutura de plasmídeo de ~ 2,5 kb de Kan-Ori.
  2. Purifique o plasmídeo adenoviral linearizado remanescente usando o kit genômico DNA Clean and Concentrator.
  3. Cultive células HEK293 em DMEM mais 10% de FBS. Semeie células HEK293 (2 x 10,6 células) em um frasco T-25 1 dia antes da transfecção, para que atinjam 70% -80% de confluência no dia seguinte. Use 5 μg de plasmídeo adenoviral digerido por Pme I para transfectar células HEK293 usando reagentes de transfecção disponíveis comercialmente.
    NOTA: O meio das células transfectadas deve ser substituído a cada 3 dias.
  4. Verifique as células todos os dias, colete as células e o meio de cultura em um tubo de polipropileno de 15 mL quando os focos do cometa se formarem (Figura 2B, indicando replicação do vírus).
  5. Lise as células por meio de três ciclos de congelamento e descongelamento. Após centrifugação durante 12 min a 1200 x g à temperatura ambiente, recolher o sobrenadante e armazená-lo a -80 °C para posterior propagação do vírus.
    NOTA: Quando o adenovírus recombinante expressa GFP ou outras proteínas fluorescentes, é mais fácil identificar se o vírus foi resgatado com sucesso, pois os focos formados por células positivas para proteínas fluorescentes podem ser observados intuitivamente em um microscópio de fluorescência.

5. Construção do plasmídeo do genoma HAdV-7 deletado por E3

NOTA: O genoma do HAdV-7 tem 35.239 pb de comprimento e a região E3 está localizada entre 27.354 pb e 31.057 pb do genoma. Para construir um plasmídeo intermediário, encontre uma endonuclease com dois locais de corte no plasmídeo do clone infeccioso ou duas endonucleases com um único local de corte no plasmídeo. Existem Hpa I, Sal I ou Avr II e Mlu I disponíveis. A sequência entre BstZ17 I (28.312 pb) e Mlu I (30.757 pb) deve ser excluída e substituída pelo CMV-GFP-PA ou CMV-mCherry-PA.

  1. Digerir 600 ng de pKan-Ad7 com Hpa I. Purificar o fragmento grande pKAd7-HpaI-FL (~30 kb) e o fragmento pequeno pKAd7-HpaI-FS (~7 kb), respectivamente, usando um kit de recuperação de gel de DNA após eletroforese em gel. Conservar o pKAd7-HpaI-FL a -20 °C.
  2. Amplifique o fragmento contendo Kan e Ori usando pShuttle-CMV como modelo com primers de Ad7HpaIF1 e Ad7HpaIR1 (Tabela S1) por PCR. Recupere e dilua o produto de PCR (2541 pb) a ser usado como modelo para a segunda rodada de reação de PCR para amplificar Kan-Ori2 com primers de Ad7HpaIF2 e Ad7HpaIR2.
    1. Purifique o produto de PCR (2584 pb) após a resolução em um gel de agarose a 1% por eletroforese. Defina a reação de PCR da seguinte forma: um ciclo a 98 °C por 30 s, depois 30 ciclos de desnaturação a 98 °C por 8 s, recozimento e extensão a 72 °C por 2 min.
      NOTA: A parte central de Kan-Ori2 é o fragmento contendo Kan e Ori, seguido pelas sequências de uma endonuclease de restrição única que não existe no pequeno fragmento pKAd7-HpaI-FS (por exemplo, Pme I), e a região sobreposta com o grande fragmento pKAd7-HpaI-FL; as sequências mais externas são a região sobreposta com pequeno fragmento pKAd7-HpaI-FS.
  3. Adicione o produto de PCR Kan-Ori2 e o pKAd7-HpaI-FS recuperado na etapa 5.1 ao DNA Assembly Master Mix. Incubar a 50 °C durante 1 h. Siga as etapas 2.4 a 2.6. O plasmídeo correto é denominado pKan-Ad7HpaI (~ 10 kb).
  4. Amplifique o fragmento CMV-GFP-PA (~ 1,7 kb) contendo o promotor CMV, GFP CDS e sinal SV40 polyA (PA) usando pShuttle-GFP23 como modelo com primers de Ad7E3GFPF1 e Ad7E3GFPR1 (Tabela S1). Purifique o produto de PCR (1650 pb) após a resolução em um gel de agarose a 1% por eletroforese.
    NOTA: Regiões sobrepostas que podem ser montadas com BstZ17 I e Mlu I digerido pKan-Ad7HpaI devem ser incluídas nos primers, e um local de restrição exclusivo (por exemplo, Sbf I) que não existe no plasmídeo pKan-Ad7 é adicionado aos primers para posterior montagem de restrição.
  5. Digerir 300 ng de pKan-Ad7HpaI com BstZ17 I e Mlu I. Purificar o fragmento de 7,3 kb (a maioria das regiões E3 são deletadas) após a resolução em gel de agarose a 1% por eletroforese. Adicione o fragmento recuperado de 7,3 kb e o fragmento CMV-GFP-PA recuperado (~ 1,6 kb) ao DNA Assembly Master Mix. Siga as etapas 2.4-2.6. O plasmídeo correto é denominado pKAd7-E3GFP (~ 9 kb).
    NOTA: Todas as sequências entre BstZ17 I e Mlu I pertencem à região E3.
  6. Digerir 300 ng de pKAd7-HE3GFP com Pme I. Purificar o fragmento grande (~6,4 kb) usando um kit de recuperação de gel de DNA após eletroforese em gel. Adicione o fragmento purificado e o pKAd7-HpaI-FL recuperado na etapa 5.1 ao DNA Assembly Master Mix. Incubar a 50 °C durante 1 h. Siga as etapas 2.4 a 2.6. O plasmídeo correto é denominado pKAd7-E3GFP.
  7. Transfectar células HEK293 com pKAd7-E3GFP linearizado Pme I, conforme descrito na seção 3. O adenovírus resgatado é denominado Ad7-E3GFP.
  8. Amplifice o fragmento CMV-mCherry-PA (~ 1,6 kb) contendo o promotor CMV, mCherry CDS e sinal SV40 polyA usando pKFAV4-CX19A como modelo com os primers de Ad7E3CHEF1 e Ad7E3CHER1. Purifique o produto de PCR após a resolução em gel de agarose a 1% por eletroforese.
  9. Digerir 600 ng de pKAd7-E3GFP com Sbf I e purificar o fragmento de ~35 kb. Adicione o fragmento de 35 kb e o fragmento CMV-mCherry-PA recuperado ao DNA Assembly Master Mix. Incubar a 50 °C durante 1 h. Siga as etapas 2.4-2.6. O plasmídeo correto é denominado pKAd7-E3CHE.
  10. Transfectar células HEK293 com pKAd7-E3CHE linearizado Pme I, conforme descrito na seção 3. O adenovírus resgatado é denominado Ad7-E3CHE.

6. Amplificação e purificação do adenovírus recombinante em células HEK293

  1. Inocular uma monocamada confluente de 80% a 90% de células HEK293 cultivadas em oito placas de cultura tratadas com TC de 150 mm de diâmetro com adenovírus. Incubar a 37 °C durante 2 h sob agitação ligeira. Substitua o sobrenadante por 25 mL de DMEM contendo 2% de FBS.
  2. Incubar as células a 37 °C durante 2-3 dias.
    1. Rejeitar a maior parte do sobrenadante dos oito pratos de 150 mm de diâmetro quando um ECP afectar a maioria das células. Colha células infectadas usando elevadores de células com um volume final de eluição de ~ 6,0 mL em tubos de polipropileno de 15 mL.
    2. Interrompa as células por três ciclos de congelamento e descongelamento para liberar o vírus. Limpar o lisado por centrifugação durante 12 min a 1200 x g à temperatura ambiente. Colete o sobrenadante contendo vírus.
  3. Adicione MgCl2 (0,1 mM) e nuclease benzonase (50 U/mL) ao sobrenadante. Vortex suavemente por 40 min a 37 °C. Adicionar NaCl (600 mM) ao sobrenadante e vórtice suavemente durante mais 40 min a 37 °C. Centrifugue por 12 min a 1200 x g em temperatura ambiente. Colete o sobrenadante contendo vírus para purificação.
  4. Prepare cloreto de césio (CsCl) com diferentes concentrações de 1,35 g / mL, 1,30 g / mL e 1,25 g / mL com 10 mM de Tris-HCl.
    1. Adicione 0,8 mL de solução de CsCl a 1,35 g/mL no fundo de um tubo Ultra-Clear de 5,1 mL usando uma pipeta e, em seguida, adicione lentamente 0,8 mL de solução de CsCl a 1,30 g/mL e 0,8 mL de solução de CsCl a 1,25 g/mL em cima da primeira solução sequencialmente.
    2. Por fim, sobreponha cuidadosamente ~ 2,5 mL do sobrenadante coletado na etapa 6.3 no topo da solução de CsCl de 1,25 g / mL e encha o tubo a 2-3 mm do topo usando 10 mM de Tris-HCl.
  5. Centrifugue por 2 h a 200.000 x g e 8 °C em um rotor de caçamba oscilante com aceleração e desaceleração lentas para separar as partículas virais intactas das partículas virais defeituosas.
    NOTA: Após a centrifugação, várias faixas brancas podem ser vistas claramente na solução de CsCl.
  6. Remova cuidadosamente as bandas das partículas vazias e a camada de detritos celulares usando a pipeta e colete a banda mais baixa contendo o vírus maduro usando uma seringa de 2 mL.
  7. Transfira a suspensão do vírus coletada para um de diálise MWCO 20 K e dialise em tampão de diálise contendo 10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2 e 2% de glicerol (pH 8,0) durante a noite a 4 ° C.
    1. Troque o tampão de diálise contendo 10 mM de Tris-Cl, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2 e 5% de glicerol (pH 8,0) no dia seguinte e dialise 5 h a 4 °C.
    2. Colete as partículas de vírus dialisadas usando uma seringa de 2 mL. Prepare várias alíquotas de pequenos volumes desejados (20-200 μL) e armazene o vírus purificado a -80 ° C.
      NOTA: O título de partículas do vírus purificado pode ser determinado medindo o conteúdo do DNA genômico, e o título de infectividade pode ser determinado em células HEK293 contando células GFP-positivas com o ensaio de diluição limitante.

7. Identificação do genoma do adenovírus recombinante por digestão enzimática de restrição

  1. Infecte uma monocamada confluente de 80% a 90% de células HEK293 cultivadas em um frasco T-25 com adenovírus recombinante. Incubar durante 2 h a 37 °C. Substitua o meio de cultura por DMEM fresco contendo 2% de FBS.
  2. Remover o sobrenadante da cultura e extrair o ADN genómico viral com o método de Hirt modificado descrito no passo 1.3 quando o CPE ocorrer no prazo de 2-3 dias.
  3. Digerir o DNA genômico do adenovírus recombinante com as enzimas indicadas e analisar na eletroforese em gel de agarose. O plasmídeo adenoviral recombinante serviu como controle.

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Resultados

A estratégia para a construção de um clone infeccioso do HAdV-7 é mostrada na Figura 1 e na Figura 2. Dois plasmídeos de clones infecciosos foram selecionados aleatoriamente e identificados por BstZ17 I, BamH I e EcoR V, respectivamente. Os resultados mostraram que os fragmentos eram consistentes com o tamanho esperado (Figura 2A), indicando que os plasmídeos foram construídos corretamente. Focos de cometas puderam ser vistos nas cé...

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Discussão

Diferentes adenovírus têm vários tropismos teciduais, e a prevalência de imunidade pré-existente do hospedeiro contra diferentes adenovírus pode flutuar intensamente em seres humanos24, o que atrai o interesse na construção de novos vetores adenovirais para terapia gênica ou desenvolvimento de vacinas. No entanto, o estabelecimento de um novo sistema de vetores adenovirais permanece complicado para laboratórios genéricos de biologia molecular.

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7204258), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82161138001, 82072266), Fundo de Inovação CAMS para Ciências Médicas (2019-I2M-5-026) e a pesquisa e aplicação sobre rastreamento molecular de patógenos respiratórios essenciais em Pequim, pela Capital Health Development and Research of Special (2021-1G-3012).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mLAxygenMCT-150-CArmazenamento de vírus
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL Corning430790Armazenamento de vírus
150 mm Placas de cultura tratadas com TCCorning430599Crescimento de células HEK29E
20 K MWCO de diáliseThermoFisher Scientific66005Diálise de vírus
Ácido acéticoAmresco714Extração de DNA
Afl IINEBR0520Digestão
AgaroseTakara5260Eletroforese
Idade INEBR0552Digestão
Asc INEBR0558Digestão
BamH INEBR0136Digestão
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KUPurificação do vírus
BsrG INEBR0575Digestão
Elevador de célulasCorning3008Raspe as células 
CsClSigmaC3032Purificação do kit de recuperação de gel de DNA do vírus
ZymoD4045Recuperação de DNA
Dulbecco ' s Águia modificada' s medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 células médias
E.coli TOP10 células competentesTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD.CB-104Transformação do produto de montagem
EcoR VNEBR3195Digestão
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extração de DNA
Soro fetal bovino (FBS)CytivaSV30208.02Cultura de células HEK293
DNA genômico Kit de limpeza e concentradorZymoD4065Purificação de DNA
GlicerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Diálise de
células HEK293ATCCCRL-1573Amplificação do vírus
DNA polimerase de alta fidelidadeNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestão
Sulfato de canamicinaAmresco408Seleção do plasmídeo
Kpn INEBR3142Digestão
Lambda / HindIII Marcador de DNATakara3403Eletroforese
LB caldoBD240230LB placa para bactérias
LB meioSolarbio Life ScienceL1010Meio para bactérias
MgCl2Sigma63068Diálise de
vírus MicrocentrífugaThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtração de DNA
NaClSigmaS5886Diálise do vírus
Nde INEBR0111Digestão
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621Montagem de DNA
Nhe INEBR0131Digestão
Fosfato Tampolado SalinoCytivaSH30256.01Lavagem de células
PipetaThermo Fisher ScientificMatrixAspirar o meio
Plasmídeo Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extração de
Kit Miniprep de Plasmídeo deTIANGEN BIOTECH (PEQUIM) CO., LTD.DP103Extração de DNA
Pme INEBR0560Digestão
Acetato de potássioAmresco698Extração de
DNA Protease KThermo Fisher ScientificAM2542Extração de DNA
pShuttle-CMVStratagene240007Modelo de PCR
RNaseBeyotimeD7089Extração de DNA
Sal INEBR0138Digestão
Sbf INEBR3642Digestão
SDSAmresco227Extração de DNA
Rotor de balde oscilanteHITACHIS52STPurificação do frasco de
células T-25do vírus Corning430639Crescimento de células HEK29E
Frasco de células T-75Corning430641Crescimento de células HEK29E
Reagente de transfecçãoPolyplus-transfecção114-15Transfecção
Microscópio eletrônico de transmissãoFEITECNAI 12Obsevação de vírus
Tris-HClAmresco234Diálise de vírus
UltracentrífugaHITACHIHimac CS120GXIIPurificação de vírus
do vírus DNA

Referências

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