Cancer Research

ラットモデルにおける乳癌予防のための乳管内エタノール焼灼治療のX線可視化

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64042

Elizabeth Kenyon^1,2, Erin Zaluzec^1,3, Katherine Powell^1,2, Maximilian Volk^1,4, Shatadru Chakravarty^2,5, Jeremy Hix^2,6, Matti Kiupel⁷, Erik M. Shapiro², Lorenzo F. Sempere^1,2

¹Precision Health Program, Michigan State University, ²Department of Radiology, Michigan State University, ³Department of Pharmacology & Toxicology, Michigan State University, ⁴College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, ⁵TechInsights Inc., ⁶IQ Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University, ⁷Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

乳癌の画像誘導予防治療のためのラット乳管樹への化学的切除液の送達のための手順が記載されている。乳腺上皮細胞は、乳頭開口部への直接カニューレ挿入および70%エタノールベースのアブレーション溶液の管内注入により、最小限の側副組織損傷で標的にすることができる。

Abstract

乳がん予防のための一次介入の数はまだ限られている。乳がんを発症するリスクが高い女性にとって、最も効果的な介入は予防的乳房切除術です。乳がんの原因となる乳腺上皮細胞を周囲の組織とともに完全に除去する抜本的な手術です。このプロトコルの目標は、乳がん予防のための新しい主要な介入になる可能性のある低侵襲の膵管内処置の実現可能性を実証することです。この局所手順は、乳腺上皮細胞が悪性になる前に優先的に切除します。乳がんのげっ歯類モデルにおいて、これらの上皮細胞に直接溶液を送達する管内法が、ミシガン州立大学などで開発されている。ラット乳腺は、人間の乳房と比較してより単純で直線的な構造を持つ単一の管樹で構成されています。しかし、乳がんの化学的に誘発されたラットモデルは、新しい予防的介入の概念実証研究と、マウスモデルからヒトへのスケーラビリティのための貴重なツールを提供します。ここでは、X線造影剤としての酸化タンタルナノ粒子およびゲル化剤としてのエチルセルロースを含むエタノールベースのアブレーション溶液のラット乳管管樹への管内送達の手順について説明する。乳管内注射による水性試薬(例えば、細胞傷害性化合物、siRNA、AdCre)の送達は、マウスおよびラットモデルにおいて既に記載されている。このプロトコルの説明では、アブレーション溶液の送達に特有の方法論的変更と手順、アブレーション溶液の局所的および全身的な副作用を最小限に抑えるための製剤の考慮事項、および乳管樹充填の in vivo 評価のためのX線イメージングを強調しています。透視法とマイクロCT技術により、タンタル含有造影剤との適合性により、アブレーション溶液送達の成功と乳管樹充填の程度を判断することができます。

Introduction

米国¹の女性にとって、乳がん(BC)は引き続き最も診断されたがんの種類であり、肺がんを除く他のどの種類のがんよりも多くの死亡を引き起こします。2022年の予測では、51,400人の女性が上皮内癌と診断され、287,850人の女性が浸潤性癌と診断され、43,600人の女性がBC1で死亡すると推定されています。BCに関連する有病率と死亡率にもかかわらず、一次予防は連邦機関によって優先されていないため、一次予防と新規介入に関するトランスレーショナル研究に利用できる選択肢はほとんどありません²。予防的乳房切除術は、一次予防のための最も効果的な介入です。ただし、この手順は人生を変える結果をもたらす大手術であるため、リスクの高い個人にのみ推奨されます³。この手術では、発がんが発生する乳腺上皮細胞と正常な周囲組織を完全に除去します。個人は、身体的、心理的、社会的ストレスの悪影響のために、この手順を一次介入の最初の選択肢として使用することを思いとどまらせることがよくあります。これらの理由から、一部の高リスクの個人でさえ、この手順を受けず、代わりに注意深い待機または同様の監視戦略を選択することを選択します³。以前の発表では、マウスモデルの乳管樹への70%エタノール(EtOH)の直接送達は、隣接する正常組織への損傷を制限した乳腺上皮細胞を化学的に切除し、乳房腫瘍の形成を防ぐのに効果的でした⁴。EtOHは、いくつかの癌の局所治療のための切除剤または動静脈腫脹および奇形の局所治療のための硬化剤として、複数の臨床用途で使用されています⁵、⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11、¹²、¹³^、¹⁴.EtOHの低い毒性および安全性プロファイルは十分に確立されており、いくつかの手順では、セッション50あたり最大55mLの95%EtOHを投与することができる^5,10。

BCが発生する乳腺上皮細胞の完全な除去は、予防的乳房切除術および切除液の局所送達の両方の最も重要な要素である。したがって、アブレーション溶液がすべての乳腺上皮細胞と直接接触したことを保証するために、完全な乳管樹充填の確認が必要です。乳管樹内にソリューションを提供し、画像誘導透視法またはダクトグラフィによるその視覚化は、すでに存在する臨床手順によって可能です^15,16,17。したがって、臨床試験でこの手順を容易に実装および評価することが可能になります。一次予防のための新しい介入としての管内(ID)アブレーションの有効性と翻訳の実現可能性を確立するための重要なステップは、このX線視覚化アプローチの実現可能性を実証することです彼らの乳^管樹構造のサイズと複雑さが増す動物モデル4,18,19。このアブレーション手順をマウス²⁰からラットモデルにスケールアップするプロトコルをここで説明します。マウスとラットの乳管樹は同様の線状構造と分岐パターンを持っていますが、ラットの管の木は比例して大きく、はるかに密集した間質に囲まれています。私たちは実験室で、造影剤を含むアブレーション溶液を使用して、毎週の一連のセッションでラットのすべての乳腺を正常に注射する方法を実装しました。動物がEtOHの副作用を最小限に抑えるためには、セッション間隔が必要です(図1および図2)。この手順では、33 Gの針でイソフルラン麻酔をかけたラットの乳頭開口部にアブレーション溶液を直接注入します。手順のいくつかの重要な改善には、拡張された抗炎症治療の使用、提案された²¹よりも管の木あたりの大量の注入、および液体および気体用の気密注射器が含まれます。ID注射の48時間前から1週間後までの5 mg / kgのカルプロフェン(NSAID)による治療期間は、クリニックでの静脈奇形の硬化療法に使用される抗炎症プロトコルに匹敵します。.治療は全身麻酔下で患者に行われ、その後NSAIDなどの抗炎症薬が2日間投与されます。抗炎症治療は、局所炎症および潜在的な痛みを軽減するために、さらに数日間延長され得る¹³。マウス²⁰と同様に、5%スクロース溶液の腹腔内注射は、ラットにおけるアルコール中毒の短期的影響を軽減する。ラットには、このスクロース溶液を投与した場合、1回のセッションで最大1 mLの70%EtOH(最大4つのダクト、血中の0.2 g / dLのEtOH含有量)を注射できます。動物はID注射後4時間以内に完全に回復します。4つ以上の腺および/またはより高いEtOH濃度を注入するときに十分な回復時間を確保するために、連続セッションを実行します。女性のアルコール中毒は、両方の乳房のすべての乳管樹のID注射としてはるかに可能性が低く、16のメインダクト^16,17および2 mLあたり2 mL、70%のEtOHを使用すると、血中のEtOH含有量が0.1 g / dL未満^{になり、軽}度の障害を引き起こす可能性があります。

X線イメージングにより、個々の腺で管内送達がどの程度成功しているか、および乳管樹全体が満たされているかどうかを判断できます(図1、図2、図3)。マイクロCTスキャンおよび/またはDICOMファイルデータの3D再構成の準備におけるリアルタイムの透視イメージングを使用して、乳管樹への溶液送達の程度および間質への漏れを評価することができます。透視法の使用は、動物に課せられる全体的な放射線量を制限するのに役立ちます。透視技術は、このアブレーション治療の画像ガイダンスのための意図された臨床応用により近い。FDA承認のヨウ素含有イソビューと酸化タンタル(_TaOx)ナノ粒子との比較は、アブレーション溶液の有用性をさらに洗練するために行われている^4,19。TaOx_は、マウスにおける乳管樹の初期充填の可視化のためにIsovueよりも優れたマイクロCT造影剤であることが見出された^4,19。ここでは、TaOxがラット乳管樹の初期充填を視覚化するのに適した造影剤であることを実証します(図2および図3)。トランスレーショナルリサーチおよび臨床診療アプリケーションの両方において、ゲル化剤エチルセルロース(EC)がEtOH溶液に添加され、意図された標的領域¹³、¹⁴^、²⁴、^25、26、27^、²⁸^、²⁹からの拡散が最小限に抑えられている。研究によると、EtOHを含むアブレーション溶液に最大1.5%のECを添加すると、_{TaOxベースの}イメージングと互換性があることが示されています(図3)。アブレーションソリューションのこれらおよびさらなる改良は、この画像誘導手順をクリニックにすぐに変換するのに役立つ可能性があります。

Protocol

記載されているすべての実験は、ミシガン州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施されました。

1.拡張抗炎症治療

カルプロフェンの経口投与としてスクラロースゲルカップを準備します。70%EtOHのID注射を受ける2日前から手順の7日まで、ラットにこの抗炎症治療を提供します。
カルプロフェンの作業溶液を滅菌PBSで希釈してカップに注射する。50 mg/mLストック溶液から、1%v/v滅菌青色食用色素で着色された希釈2 mg/mL溶液を調製し、各カップに500 μLを注入します。染料の添加は、カップのスクラロース内の薬物の完全な混合の視覚化に役立ちます。
製造元の推奨に従って、カルプロフェンを追加するためのカップを準備します。ベンダーから特に指示がない限り、汚染のリスクを減らすために、カップを60°Cの水浴で15分間温め、取り外したら乾かします。
1. スクラロースカップの蓋を70%EtOHで拭き取り、カルプロフェン作業溶液を含むシリンジの針を導入します。適切な容量(500 μL)を分注します。
2. パンクをステッカーで覆います。カップを15秒間精力的に振ってから、そのカップをさらに15秒間渦の中に置きます。後で使用するために保管する前に、均質で完全な混合を視覚的に評価します。濃い青色の存在を探します。
  注意: カップを室温に戻します。必要に応じてカップを室温で保管しますが、製造元からの薬効ガイダンスに注意してください。または、カップを4°Cで保管し、1か月以内に使用してください。ステッカーの日付を記入することは、ペンや鋭いマーカーが蓋に穴を開けるリスクなしに注射日を追跡するための良い習慣です。
使用直前に、70%EtOHでカップの外側を拭き取ってください。カップを動物ケージに入れる前に蓋を外してください。カップは一日おきまたは空のときに交換してください。適切な投与量を確保するために、毎日ゲルのレベルを確認してください。.1カップで最大2匹のラットに最大2日間カルプロフェンを供給することができます。ただし、ラットはカップ全体をより早く消費する可能性があります。

2.術前の準備

注意: 動物の準備ステップがID注射手順より2〜3日先行していることを確認してください。

イソフルラン気化器(2%-3%イソフルラン、1.5 L /分の酸素)をオンにして、ラットに麻酔をかけます。.動物を加温パッドの上のノーズコーンに移動します。ラットに目の潤滑剤を塗布し、動物を背中に配置します。動物の呼吸を注意深く監視して、麻酔面がイソフルランの1%〜3%に維持されていることを確認します。
注意: 電気かみそりを使用して、脱毛前に余分な毛皮を取り除くことができます。かみそりで乳首を傷つけないように細心の注意を払う必要があります。このため、この手順はスキップできます。ラットはマウスよりも脱毛クリームに敏感であるため、余分なクリームの除去は非常に重要です。脱毛による擦り傷がすでに存在する領域にエタノール含有溶液を注入することは避けてください。一部のクリームには、擦り傷の可能性を最小限に抑えるのに役立つアロエやラノリンなどの化合物が追加されています。
コットンチップアプリケーターを使用して、市販の脱毛クリームを乳首領域に広げます。アプリケーターを使用して、クリームをその領域に10〜30秒間こすりつけます。毛皮がすぐに緩んだかどうかを確認します。
1. クリームをラットにできるだけ短い間隔で放置し、皮膚のやけどを防ぐために完全に取り除きます。ラットはマウスよりもこの手順にさらに敏感です。
10〜30秒塗布した後、ガーゼを温水で濡らし、それを使用してクリームと緩んだ毛皮を動物から洗い流します。新鮮な湿らせたガーゼでその領域を少なくとも3回すすぎ、最後のすすぎの後に乾いたガーゼで乾かします。毛皮が取り除かれた場所から乳首の領域への良好な視認性とアクセスを確認します。必要に応じて脱毛手順を繰り返します。
ラットを加熱パッドの上のきれいなケージに入れ、回復させます。ラットをチェックして、麻酔から完全に回復していることを確認してから、永久ケージに戻します。
抗炎症治療のために、カルプロフェンを投与した(1 mg /カップ)スクラロースゲルカップをケージに入れます。.ゲルの消費量を毎日チェックし、必要に応じて新しいカップと交換してください。カップを2日以上放置しないでください。通常、カップは1日後に交換する必要があります。

3.管内注射

滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて¹⁹に記載のように333.3mMで_{TaOxストック}溶液を調製する。粉末が完全に溶解しない場合は、溶液を温めます。穏やかにかき混ぜる。気泡の形成を避けるために、渦を巻いたり激しく振ったりしないでください。
333.3 mM TaO x 3部と 100% EtOH 7 部を混合して、最終的な 70% EtOH 100 mM/TaO_x 溶液にします。任意選択で、ゲル化剤として0.5%〜1.5%エチルセルロース(EC)の適量を添加して、アブレーション溶液の局所保持を最大化する。注入中の乳管樹への送達を目視検査するために、アブレーション溶液に1%v / v青色食用染料を追加します。
実験のニーズに適したボリュームを準備します。腺ペア1(子宮頸部)と6(鼠径部)には最大100 μLの溶液を充填でき、他のすべてのペアは最大300 μLで充填できます。
ステップ2.1のようにラットを麻酔し、完全に麻酔されたらラットをノーズコーンに移動します。両目に目の潤滑剤を塗り、動物を背中に置きます。必要に応じて、注射される乳首の近くにテープを使用して、ステレオスコープの下にラットを固定します。ラットの体重は、一般に、テーピングなしで実質的に動かないようにするのに十分です。
注射用の乳首を準備するには、可能であれば、乳首の開口部を細かい先のとがった鉗子で覆っている死んだ皮膚を取り除きます。ラットは、乳首の開口部から突き出たプラグを持っていることが多く、取り外さないと乳首のカニューレ挿入の成功を妨げる可能性があります。
注:ラットで使用されているアブレーション溶液の注射量が多いと、注射部位の近くに表在性の皮膚創傷が生じる可能性が高いことに注意することが重要です。.このため、1回のセッションで他のすべての乳首を注射することは、隣接する乳首を注射するよりも動物への損傷と刺激が少なくなります。注射後7日間、ラットの擦り傷を監視することで、動物の引っかき傷による深刻な健康への影響がなく、ケージの床の破片による汚染による感染の可能性が導入されないようにすることができます。トリプル抗生物質軟膏またはクロルヘキシジン溶液による洗浄は、発生する可能性のある傷害感染の兆候を治療するために使用できます(表1)。
33 Gの針が付いた500 μLのシリンジを使用して、101〜301 μLのアブレーション溶液を吸引します。カニューレ針を取り外すときに軽微な漏れを防ぐために、追加の1μLの溶液を吸引します。
注:これらは、乳管樹を完全に満たすことを目的とした量の推奨事項です:頸部腺と鼠径部腺で最大100μL、その他の腺で最大300μL。他のアプリケーションでは、小さいボリュームまたは大きいボリュームを使用するのが適切な場合があります。
ピンセットを使用して乳首をそっと保持し、針を乳首の開口部にカニューレ挿入します。ベベルが乳首の中に完全に入るまで、針をそっと挿入し続けます。針を乳首に収めるには、針を乳首に押し下げるのではなく、乳首を針に向かって持ち上げます。(表1)。乳首の開口部の経路をたどるように注意してください。
注:ラットの乳首は、サイズが大きいため、一般的にマウスの乳首よりも操作とカニューレ挿入がはるかに簡単です。ただし、乳首開口部周辺の脂肪量が増えると、針が主管から外れた場合に誤って脂肪パッドを注入する可能性も高くなります。
針のかさばが完全に挿入されたら、ラットに約100 μL / minの一定速度で溶液をゆっくりと注入します。.注入速度の急激な変化は、管の木を破裂または損傷する可能性があります。注入終了後30秒間待ってから、鉗子を使用して補助してカニューレの木から針を外す。これにより、注入された量が管樹内に留まり(図2)、漏れの可能性が減少します。
画像に余分なコントラスト溶液を避けるために、湿らせたガーゼまたはEtOHワイプでこぼれた溶液を取り除きます。
ID注射液にエタノールが含まれている場合、アルコール中毒の影響を軽減するために、5%ショ糖(10 mL / kg)を含むPBSを腹腔内に注射します。.この用量は、手順の開始時および終了時に投与することができる。

4. マイクロCTイメージング

すべての所望の腺が注入された後、動物をマイクロCTシステムに素早く移動させ、組み込まれたイソフルラン気化器を使用して麻酔を維持し続ける。
動物の背骨をまっすぐにし、各後肢を伸ばした位置にテープで留めて、動物の脚の骨が関心のある下部腺からさらに離れ、スキャンされた画像の関心領域と重ならないようにします。
腹部を横切ってテープで留めて、下部腺をスキャンする場合の呼吸のアーチファクトを最小限に抑えます。
注:ラットの放射線の適切な許容生涯線量を決定し、累積線量がこのレベルを超えないように注意が払われる場合、動物はさまざまなスキャンパラメータ(高解像度、縦断スキャンなど)で画像化できます。放射線被曝は、スキャンを行わずに透視静止画やビデオを取得することでさらに低減できます(図2)。
ラット乳管樹の_{TaOxイメージング} を良好な解像度で実行し、次のスキャンパラメータを使用して標準(2分)取得スキャンを繰り返す機会があります:90 kVp/88 μA;視野 (FOV), 72 mm;スライス数、512;スライスの厚さ、72μm;ボクセル分解能、72 μm³。より長い期間(4〜14分)の高解像度スキャンは、同じパラメータを使用して縦方向にスキャンされない動物でも取得できます。
データ取得後、ラットを麻酔コーンから慎重に離し、加熱パッド上の新しい清潔なケージに入れます。ラットをチェックして、麻酔から完全に回復してから、永久ケージに戻します。カルプロフェン含有スクラロースカップを置き、ステップ2.5の説明に従って適切に交換して、動物が次の7日間抗炎症治療を受け続けるようにします。.
スキャンした画像をマイクロCTソフトウェア内ですばやくレンディション処理して、コントラストの漏れ、部分的な充填のみ、または過剰充填をよりよく理解します(図2)。
次のセクションに進み、必要に応じて、公開用の正式な画像処理またはスキャンの詳細な分析を実行します(図3)。

5. 画像解析

専用のソフトウェアパッケージを使用して、塗りつぶされたダクタルツリーのレンダリングを作成します。
注:注入された乳管樹の最良の表現を得るために、乳脂肪パッドをセグメント化することが最善です。スプラインは、このセグメンテーションを達成するために、動物の厚さ全体にわたって脂肪パッドの暗い境界をトレースします。
対象の乳管ツリーが含まれているファットパッド(マウスとは異なり、このコンパートメントの境界は、同様のハウンズフィールドユニットのため、腹腔、大腿筋、および皮膚と簡単に区別できません)をセグメント化するには、手動メニューから「スプライントレース」オプションを選択することが、レンダリングを作成する最初のステップです。
スプラインは、3 スライスごとにファットパッドの輪郭をトレースします。半自動メニューから[ オブジェクトの伝播 ]オプションをクリックします。これにより、すべてのスライスが伝播され、関心のある単一のセグメント化されたオブジェクトに接続されます。
注:セグメント化された領域内のしきい値を変更すると、ハウンズフィールドユニット(HU)の特定範囲内でのみ信号を視覚化できます。他の造影剤または画像パラメータについては、この範囲を調整する必要があるかもしれません。ソフトウェアパッケージまたは人工知能分析を使用して、他の測定値や画像を作成し、ダクトツリーがどれだけ満たされたかを示すことができます。
しきい値ボリュームタブの下の半自動メニューで、HU値を下限300および最高点3,000に設定します。これにより、ダクトツリー内のコントラスト(_TaOx)のみを表示するレンディションを作成できます。
「表示」ボタンを使用してレンディションをプライマリとして設定します。これにより、ダクタルツリーの3Dレンディションのみを表示するように表示が変更されます。
注意: さらに分析するために、管樹の再建を実行します。

Representative Results

雌ラットの12個の乳腺のそれぞれには、乳頭開口部に開く単一の乳管樹が含まれています。マウスとラットのサイズの違いにもかかわらず、乳腺の発達タイミングとこれらの動物が成人期に達する時間は非常に似ています^30,31。両方のげっ歯類種を代表するラットにおける乳腺発達の重要な段階の簡単な説明が提供される。終末芽(TEB)は、管分岐を指示する伸長管樹の先端にある高度に増殖する構造です^30,31。TEBの増殖および密度のピークは、思春期発達における乳管樹の伸長期の3〜4週齢で発生する³⁰。9〜10週齢までに、乳管樹が脂肪パッド³⁰の全長を占めるように成長したため、TEBはほとんど残っていない。その後、乳管樹の成長と拡大は、脂肪パッドと動物³²の成長と拡大に比例します。ヒト乳房の末端小葉ユニット(TDLU)は、げっ歯類のTEBと同様の役割を果たします。TDLUは、発がんの開始と^BC33,34への進行の主な原因です。最大300 μLの70%EtOH溶液を注入して、9週齢のSprague-Dawleyラットの胸腺と腹部乳腺の乳管樹全体を満たすことができます(図1、図2、図3)。マウス²⁰とは異なり、Sprague-Dawleyラットの頸部腺および鼠径部の乳首は、典型的には80%以上の動物への注射に適しており、乳管樹全体を満たすには最大100μLの70%EtOH溶液が必要です(図2)。私たちは定期的に最大10個の乳腺に研究中のアブレーション溶液を注射します。典型的な実験デザインは、2つの独立した毎週のID注射セッションで構成され、5つの交互の腺に、ゲル化剤としてX線造影剤および/またはECを含むアブレーション溶液を注入します(図2)。TaOx_含有(50-200 mM)アブレーション溶液の場合、各セッションの終了後に透視および/またはマイクロCTスキャンを実行して、各管樹に部分的または全量の注入溶液を注入することの個々の成功を決定および記録します(図2)。注入後の即時および縦断的なイメージングにより、製剤の変化、特にECゲル化剤の濃度が、注入量の関数としてアブレーション溶液の外向きの拡散にどのように影響し、制限されるかを評価できます(図3)。この画像分析は、最小限の側副組織損傷で最大のアブレーションを達成するための最適なパラメータを理解するための情報を提供します。

図1:ラットにおける膵管内注射と画像解析の手順の概略図。膵管内注射と画像分析の段階的な手順が強調されています。詳しくは動画をご覧ください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:乳頭カニュレーションの例と複数の乳腺へのアブレーション溶液の送達結果。 (A)Sprague-Dawleyラット系統における乳首形状の典型的な提示。乳首の長さは、カニュレーションが成功する可能性と相関しています。長い乳首は短い乳首よりもカニューレ挿入しやすいですが、過度に短い乳首や痕跡のある乳首はカニューレ挿入できません。カニューレ挿入されると、長い乳首と短い乳首の両方に溶液を注入し、同様の分娩成功率を達成することができます。注入された溶液中の青色食用色素は、管樹の充填および送達の成功のin vivo証拠として使用され得る(最も明白なのは、脂肪パッド注入の失敗に対するドーム形成)。画像取得(C)後に生成されたリアルタイムの透視法(B)および3DマイクロCTレンディションは、送達の成功のin vivo証拠と、TEBに到達する溶液のより定量的な評価を提供します。(B)最初のペア(#4、#10)の各腹部乳腺は、1%EC(オレンジ色の輪郭)またはそれなしで(緑色の輪郭)のアブレーション溶液を受け取りました(C)右頸部の切除液の送達成功(青い輪郭)、胸部(#3、#9)と腹部の最初のペア(#4、#10)乳腺の2番目のペア、および左胸部への注射の失敗(白い破線)。スケールバーは、異なる倍率で画像の1mmに対応します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:アブレーション溶液の充填と拡散の3D再構成と評価。 1%EC(上)またはECなし(下)を有する70%EtOH/100mM_{TaOxナノ粒子} を第2腹部乳腺対(#4および#10)に膀管内注射し、直ちにマイクロCTで画像化した。各Sprague-Dawleyラットは、いずれかの溶液の量を増やしました。個々のダクタルツリーは、画像解析ソフトウェアパッケージ(スプライントレース+伝播オブジェクト+しきい値レンディション)を使用して再構築されました。1%ECでは、溶液が末端に達するのを見ることができます。供給量が増加するにつれて、充填されるTEBの数がより明確になります。縮尺記号は、すべてのレンディションで 10 mm に対応します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

発行	様子	解決
短い乳首(図2)	乳首は目立たない–つかむのが難しい	乳首の近くに皮膚を持って、針で乳首の中心を狙う方が簡単な場合があります。針はおそらく皮膚の下に潜ります。ゆっくりと引き上げると、乳首が針の先端のわずかに上にあることが明らかになり、残りの部分をつかんで針に引っ張る余地が与えられます。針の角度について皮膚の下に潜るときは十分に注意してください。間違った角度で刺すことで、うっかり脂肪パッド注射を受けるのは簡単です。
脂肪パッド注入(図2)	乳首の周りとおそらく乳首自体の腫れ–注射液に色が追加されているかどうかを簡単に確認できます	最初の数回のulを注入した状態で乳首が腫れている場合は、針を外し、角度に注意して再度挿入してみてください。再び注射を開始し、さらなる腫れに注意してください。腫れが続く場合は、試みを断念してください。脂肪パッド注入として始まった乳首をうまく注入することは非常にまれです。
傷/かさぶた	EtOH溶液の注射部位近くの開放創またはかさぶた	ラットはマウスよりも注射部位の近くに傷やかさぶたを発症する可能性が高い。傷が見つかった場合は、開いた傷にトリプル抗生物質軟膏を塗布しますが、かさぶたの傷はそのままにしておきます。かさぶたに軟膏を塗ると、動物がかさぶたを悩ませて取り除く可能性が高くなります。傷の重症度に応じて、治癒するまで1〜2日ごとに確認してください。カルプロフェンは、通常のウィンドウを超えても治癒するまで投与する必要があります。.
交互腺を注入する	該当なし	ラットの注射量が多いと、連続した腺を注射する場合に皮膚の擦り傷を引き起こす可能性が高くなります。注射領域への外傷の可能性を最小限に抑えるために、単一のセッション内に交互の腺を注射します(つまり、#1-4ではなく#1、3、4、および6を注射します)。3番目(#3と#9)と4番目(#4と#10)の腺ペアの間の間隔は、1回のセッションでこれらの腺の両方の注入を可能にします。

表 1: 役立つヒントとトラブルシューティング

Discussion

ここに示すように、70%のEtOHのID送達は、マウスにおいて周囲の間質および血管系への限定的な付随的損傷を有する乳腺上皮細胞を優先的に切除する⁴。乳管樹の局所切除は、マウスモデル⁴における腫瘍形成の防止に有効である。ここでは、この切除手順をラットにスケールアップできることを示します。

これは、高リスクの個人の乳がんの一次予防のための予防的乳房切除術への代替介入としてのこの切除手順の翻訳への道の次のステップです。切除溶液へのX線造影剤としての_{TaOxナノ粒子}の添加は、手順が乳管樹を完全に満たすことに成功したかどうかを判断できるため、腫瘍形成の予防における溶液の有効性を評価することを可能にする。蛍光透視法を使用して注射された乳腺を視覚化することは、このID手順を導くためにクリニックで行われる可能性が高いことを反映しています。溶液が乳管樹をどれだけ満たし、いつ注入を停止するかについての画像ガイダンスは、各管樹の最大充填を確実にするための臨床実施の重要な側面になります。トラブルシューティングと役立つヒントを表 1 に示します。この切除手順の有効性は、注入された溶液が細胞殺傷の速度を最大化するためにすべての上皮細胞と直接接触することを必要とする。1つまたは複数の樹木内の予備の上皮細胞は、最終的にBC発生の源として役立つ可能性があります。他のグループは、マウスにおけるウイルス粒子(例えば、Cre / LoxPおよび/またはCas9 / CRISPRシステムの成分)、ホルモンおよびホルモン拮抗薬(例えば、プロラクチン、フルベストラント)、化学療法剤(例えば、シスプラチン)、siRNAおよび/または抗体または他の標的剤のID送達を報告した⁴、¹⁹、²¹、^35、36、³⁷、³⁸、³⁹、⁴⁰^、 41,42,43,44,45、ラット21,33,46,47,48および/またはウサギ^{18,49,50,51,52,53}.化学療法の局所送達のためのヒト乳房あたり最大8本の乳管樹のカニュレーションの成功は、独立した臨床試験で報告されています47,54,55。腫瘍予防を目的とした、または局所治療を目的としたこれらの他の溶液を注入するための画像ガイダンスは、同様にその有効性を最大化します。

マウスからラットの乳管樹へのこの手順のスケーラビリティと洗練がここで示されています。マウス⁴^、¹⁹およびラット(未発表データ)乳管樹中の_{TaOxナノ粒子}は、FDA承認のヨウ素含有X線造影剤を超える高解像度イメージングを提供する。同様に、我々は、_TaOxに匹敵する解像度を提供することができるマウス⁴⁰^、⁴¹または他の動物モデル¹⁸における他の乳管樹画像化アプローチを認識していない。臨床翻訳に関連するのは、この中間サイズのラットモデルにおけるECのゲル化効果が、側副組織の損傷を最小限に抑えるための製剤の改良を可能にするという事実です。BCを予防する能力についてこの切除的ID手順を評価し続けると、化学的に誘導された他のラットモデルにおけるID送達後の画像によって提供される追加情報を通じて、BCがどの腺から発生するかをより正確に決定できるようになります。これらのデータは、この手順の安全性を判断し、部分的または失敗した処理された管の木がリスクの高い女性でBCを発症する傾向があるかどうかの懸念または欠点を特定します。

Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgments

この研究は、LFSに対する国立がん研究所R21 CA226579およびR01 CA258314助成金、およびEMSへの国立生物医学画像生物工学研究所R01 EB029418助成金によって部分的に支援されました。MSU定量研究所(IQ)健康科学工学イメージングコア施設が、イメージングシステムと技術的専門知識を使用してくれたことに感謝しています。ビデオの内容と動物福祉ガイドラインの遵守に関する数値を確認してくれたダニエル・ファーガソン博士に感謝します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnalyzeDirect v12.0	Caliper	n/a	For micro-CT image processing
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL	Allivet	50647	For anti-inflammatory treatment
Ethyl cellulose	Acros Organics	9004-57-3	For intraductal injection
Evans blue	Sigma	E2129-50G	For injection visualization
Hot water bath	Toolots	Yidu_HH-S2	For preparing carprofen cups
MediGel Sucralose Cups	ClearH2O	74-02-5022	For delivery of carprofen
Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL	Hamilton	81220	For intraductal injection
Photoshop 2021	Adobe	n/a	For image processing
Quantum GX2 microCT Imaging System	Perkin Elmer	CLS149276	For micro-CT image acquisition
Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4)	Hamilton	7747-01	For intraductal injection
Stereo Microscope SZM Series	AmScope	SM-4TPZ-144	For intraductal injection
Sterile blue food dye	McCormick	930641	For injection visualization
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	14190250	For solution preparation
Stickers	DOT Scientific	DOTSCI-C50	For preparing carprofen cups
Sucrose	Calbiochem	8550-5KG	For intraductal injection
Syringes	Fisher	14-826-79	For preparing carprofen cups
Vortex	VWR	10153-834	For preparing carprofen cups
Warming pump/pad(s)	Braintree Scientific	HTP-1500 120V; AP-R 26E	For intraductal injection/preoperative preparation