Neste protocolo, foram gerados organoides retinianos 3D derivados de células-tronco pluripotentes (iPSC) induzidos por pacientes com retinite pigmentosa. Esses organoides recapitularam com sucesso alguns fenótipos clínicos da doença da retinite pigmentosa.
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Artigo de método
Geração de organoides retinianos derivados de iPSC de pacientes humanos para modelar retinite pigmentosa
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A retinite pigmentosa (RP) é uma doença degenerativa da retina rara e hereditária com uma prevalência de aproximadamente 1/4.000 pessoas em todo o mundo. A maioria dos pacientes com RP apresenta degeneração progressiva dos fotorreceptores, levando à perda da visão periférica, cegueira noturna e, finalmente, cegueira total. Até o momento, milhares de mutações em mais de 90 genes foram relatadas como associadas à RP. Atualmente, existem poucos modelos animais disponíveis para todos os genes afetados e diferentes tipos de mutações, o que dificulta em grande parte a decifração dos mecanismos subjacentes à patologia gene/mutação e limita o tratamento e o desenvolvimento de medicamentos. Os organoides retinianos (ROs) 3D derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por pacientes (iPSC) forneceram um sistema melhor para modelar a doença humana de início precoce do que células e animais. Para estudar o RP, esses organoides retinianos 3D derivados do paciente foram utilizados para recapitular os fenótipos clínicos do RP. Nos ROs derivados de pacientes com RP, a localização incorreta da rodopsina foi claramente exibida. Em comparação com outros modelos animais, os modelos organoides retinianos derivados de iPSC do paciente recapitularam mais de perto as características do RP e representam uma abordagem ideal para investigar a patogênese da doença e para o desenvolvimento de medicamentos.
Introdução
As doenças retinianas humanas, como retinite pigmentosa e degeneração macular relacionada à idade, são pouco compreendidas devido à falta de modelos experimentais apropriados 1,2. Embora a retina do camundongo seja muito semelhante à retina humana e seja uma ferramenta poderosa para estudar a etiologia da degeneração da retina, existem enormes diferenças de espécies entre camundongos e humanos 3,4. Por exemplo, a arquitetura nuclear das células fotorreceptoras em camundongos e humanos é diferente, e a retina do camundo....
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Protocolo
O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da Capital Medical University.
1. Cultura celular e geração de iPSCs
- Escolha pacientes com RPGR para este estudo. Aqui, três pacientes, um portador familiar e três controles saudáveis, foram usados. O paciente 1 possuía uma mutação c.1685_1686delAT no éxon 14 do gene RPGR, o paciente 2 abrigava uma mutação c.2234_2235delGA no éxon 15 do gene RPGR e o paciente 3 tinha uma mutação c.2403_2404delAG no éxon 15 do gene RPGR. Escolha três voluntários saudáveis como controles14. Colete amostra....
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Resultados
A ilustração esquemática descreve os procedimentos de diferenciação para gerar organoides retinianos derivados de iPSC saudáveis e pacientes (Figura 1). De iPSC a ROs, variações podem ser produzidas devido a vários fatores. O status do iPSC é a etapa determinante da geração de RO. Além disso, é altamente recomendável que os pesquisadores registrem todas as etapas, catálogos e números de lote de todas as mídias para que todos os experimentos sejam rastreáveis. Na Figura 2.......
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Discussão
Os organoides retinianos são estruturas laminadas 3D derivadas de hiPSCs ou células-tronco embrionárias (ESCs) e apresentam um modelo muito promissor para imitar os padrões espaciais e temporais do desenvolvimento da retina humana31,32. As ROs consistem em vários tipos de células da retina, incluindo fotorreceptores, células bipolares, células ganglionares, células amácrinas, células horizontais e glia de Müller.......
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Divulgações
Todos os autores não divulgam conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos a M.S. Yan-ping Li e Zhuo-lin Liu por seu apoio técnico e comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (Z200014, 82125007) e Programa Nacional de P&D da China (2017YFA0105300).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 96 poços cônicos com fundo em V | Sumitomo Baquelite | MS-9096VZ | |
| A-83: 01 | R& D Systems | 2939/10 | |
| Lâminas de microscópio de adesão | CITOtest | 188105 | |
| Agarose | Gene Tech | 111760 | |
| Amaxa Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Sistema de transfecção |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | R& D Systems | 3718-FB | |
| Blebistatina | Nuwacell Biotechnologies | RP01008 | |
| Tubo de coleta de sangue | BD Vacutainer EDTA | 366643 | |
| CHIR99021 | TOCRIS | 4423/10 | |
| Lâminas de cobertura | CITOGLAS | 10212440C | |
| cTarget hPSC Medium | Nuwacell Biotechnologies | RP01020 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| DMEM/Ham' s F12 | Gibco | 10565-042 | |
| Burro anti-rato 488 | Invitrogen | A-21202 | |
| Burro anti-coelho 594 | Invitrogen | A-21207 | |
| EDTA | Nuwacell Biotechnologies | RP01007 | |
| Meio de incorporação | FluorSaveTM Reagente | 345789 | |
| EX-CYTE meio de aumento de crescimento | Sigma | 811292 | Meio de aumento de crescimento |
| Soro bovino fetal | Gibco | 04-002-1A | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 26873-85-8 | Gradiente de densidade médio |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | Suplemento de L-glutamina |
| HA-100 | STEMCELL Technologies | 72482 | |
| Presunto' s F12 | Gibco | 11765-054 | |
| hLIF | Thermo Fisher Scientific | AF-250-NA | |
| Homogeneizador | EDEN lab | D-130 | |
| IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Iscove' s Modified Dulbecco Medium | Gibco | 12440053 | |
| KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Gibco | A3181502 | Serum replacement media |
| L/M-opsin | Millipore | ab5405 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| N-2 suplemento | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nanodrop Espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | Espectrofotômetro |
| ncEpic 125x Suplemento | Nuwacell Biotechnologies | RP01001-02 | 125x ncEpic |
| Basal Medium | Nuwacell Biotechnologies | RP01001-01 | Basal hpsc medium |
| ncLaminin511 proteína recombinante humana | Nuwacell Biotechnologies | RP01025 | |
| PD0325901 | STEMCELL Technologies | 72182 | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| BMP4 humano recombinante | R& D Systems | 314-BP | |
| Ácido retinóico | Sigma | R2625 | |
| Rodopsina | Sigma | O4886 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| sIL6-R | Thermo Fisher Scientific | RP-75602 | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL Technologies | 09600 | |
| Taurina | Sigma | T8691 | |
| Trizol reagente | Invitrogen | 15596026 | |
| Vitronectina | Nuwacell Biotechnologies | RP01002 | |
| V-Lance faca | Alcon Surgical | 8065912001 |
Referências
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Lin, Q., et al. Generation of nonhuman primat....
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Reimpressões e permissões
