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Espectrometria de massa de hidrogênio/deutério-deutério para o estudo da dinâmica estrutural alfa-sinucleína sob condições fisiológicas

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DOI:

10.3791/64050

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23 de junho de 2022

 , 
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

Neste artigo

Resumo

O conjunto estrutural da alfa-sinucleína monomérica afeta sua função fisiológica e propriedades fisiológicas. O presente protocolo descreve como realizar espectrometria de massa de milissegundos de hidrogênio/deutério e análises subsequentes de dados para determinar informações conformais sobre o monômero dessa proteína intrinsecamente desordenada em condições fisiológicas.

Resumo

Alfa-sinucleína (aSyn) é uma proteína intrinsecamente desordenada cujos agregados fibrilares são abundantes em corpos e neuridos de Lewy, que são as marcas da doença de Parkinson. No entanto, grande parte de sua atividade biológica, bem como sua agregação, envolve centralmente a forma de monômero solúvel da proteína. A elucidação dos mecanismos moleculares da biologia e da fisiopatologia requer métodos estruturalmente altamente resolvidos e é sensível às condições biológicas. Suas estruturas nativamente desdobradas e meta-estáveis tornam o aSyn monoméico intratável a muitas técnicas de biologia estrutural. Aqui, a aplicação de uma dessas abordagens é descrita: espectrometria de massa de hidrombútrio/deutério(HDX-MS) na escala de tempo de milissegundos para o estudo de proteínas com baixa estabilidade termodinâmica e fatores fracos de proteção, como aSyn. Na escala de tempo de milissegundos, os dados HDX-MS contêm informações sobre a acessibilidade solvente e a estrutura ligada a hidrogênio de aSyn, que são perdidas em tempos de rotulagem mais longos, resultando em resolução estrutural até o nível de aminoácido. Portanto, o HDX-MS pode fornecer informações em altas resoluções estruturais e temporais sobre dinâmica conformacional e termodinâmica, interações intra e intermárgidas, e o impacto estrutural de mutações ou alterações às condições ambientais. Embora amplamente aplicável, é demonstrado como adquirir, analisar e interpretar medidas milissegundos de HDX-MS em aSyn monomérica.

Introdução

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa que afeta milhões de pessoas em todo o mundo1. Caracteriza-se pela formação de inclusões citoplasmáticas conhecidas como corpos de Lewy e neurites de Lewy na região substantia nigra pars compacta do cérebro. Essas inclusões citoplasmáticas têm sido encontradas para conter agregados da proteína intrinsecamente desordenada aSyn2. Em DP e outras sinucleinopatias, aSyn se transforma de um estado solúvel desordenado em um estado doente insolúvel e altamente estruturado. Em sua forma nativa, o monoméico aSyn adota uma ampla gama de conformações estabilizadas por interações eletrostáticas de longo alcance entre suas interações N e C-termini e hidrofóbicas entre sua região de componente beta C-terminus e não amiloide (NAC) 3,4,5,6. Quaisquer interrupções nessas interações estabilizadoras, como mutações, modificações pós-translacionais e mudanças no ambiente local, podem levar ao descompos do monômero, desencadeando assim o processo de agregação7.

Embora exista uma vasta quantidade de pesquisa sobre as formas oligomeméricas e fibrilares de aSyn 8,9,10,11, há uma necessidade crucial de estudar a forma monomérica da proteína e entender melhor quais conformadores são funcionais (e como) e que são propensos a agregar 8,9,10,11 . Sendo intrinsecamente desordenado, apenas 14 kDa de tamanho, e difícil de cristalizar, o monômero aSyn não é favorável à maioria das técnicas biológicas estruturais. No entanto, uma técnica capaz de medir a dinâmica conformacional do aSyn monomérico é o milissegundo HDX-MS, que recentemente gerou observações estruturais importantes que seriam desafiadoras ou impossíveis de obter de outra forma 12,13,14. Milissegundos HDX-MS mede sensivelmente a média do conjunto conformacional da proteína monitorando a troca isotópica em hidrogênios amidos, indicando acessibilidade solvente e participação de rede de ligação de hidrogênio de uma determinada região proteica na escala de tempo de milissegundos. É necessário enfatizar o aspecto milissegundo do HDX-MS, pois, devido à sua natureza nativamente desdobrada e meta-estável, aSyn exibe cinética de troca de hidrogênio muito rápida que se manifestam bem abaixo do limite inferior dos sistemas HDX-MS convencionais. Por exemplo, a maioria da molécula de ASyn tem completamente trocado hidrogênio por deutério sob condições intracelulares em menos de 1 s. Vários laboratórios já construíram uma instrumentação de mistura rápida; neste caso, um protótipo de instrumento de fluxo de sada rápida capaz de executar HDX-MS com um tempo morto de 50 ms e uma resolução temporal de 1 ms é usado15. Embora o MILISSEGUD HDX-MS tenha sido recentemente extremamente importante no estudo da ASyn, é valioso estudar proteínas/regiões intrinsecamente desordenadas de forma mais ampla e um grande número de proteínas com laços/regiões que são apenas fracamente estáveis. Por exemplo, drogas de peptídeos (por exemplo, insulina; GLP-1/glucagon; proteínas de fusão de tirzepatidas) e peptídeos (por exemplo, o inibidor do HIV FN3-L35-T1144) são os principais formatos de drogas onde informações estruturais e de estabilidade em fase de solução podem ser uma entrada crítica para decisões de desenvolvimento de medicamentos, e, ainda assim, a moiety peptídeo é muitas vezes apenas fracamente estável e intratável pelo HDX-MS na escala de tempo de segundos 16,17,18,19,20 . Métodos emergentes de HDX-MS com rotulagem nos domínios de segundos/minutos têm sido mostrados para obter informações estruturais para G-quadruplexes de DNA, mas deve ser possível estender isso a estruturas oligonucleotídeos mais diversas pela aplicação de milissegundos HDX-MS21.

Os experimentos HDX-MS podem ser realizados em três níveis diferentes: (1) de baixo para cima (pelo qual a proteína rotulada é digerida proteolítico), (2) de baixo para baixo (pelo qual a proteína rotulada é digerida proteolyticamente, e os peptídeos resultantes são fragmentados ainda mais por técnicas de fragmentação suave) e (3) de cima para baixo (pelo qual as técnicas de fragmentação macia são diretamente fragmentadas a proteína rotulada) 22 . Assim, os dados sub-moleculares do HDX-MS permitem-nos localizar o comportamento de troca para regiões específicas de uma proteína, tornando-se fundamental ter cobertura de sequência adequada para tais experimentos. A resolução estrutural de qualquer experimento HDX-MS baseia-se no número de peptídeos ou fragmentos protelíticos derivados da proteína após a digestão ou fragmentação suave, respectivamente. Em cada um dos três tipos de experimentos descritos acima, a mudança na troca de amide em cada peptídeo/fragmento é mapeada de volta à estrutura primária da proteína para indicar o comportamento das regiões localizadas da proteína. Embora a maior resolução estrutural seja alcançada através da fragmentação suave, a descrição desses experimentos está fora do escopo do presente estudo, que se concentra na medição de conformações monômeros de aSyn. Excelentes resultados podem ser obtidos com o fluxo de trabalho "de baixo para cima" comumente aplicado descrito aqui.

Aqui, são fornecidos procedimentos sobre (1) como preparar e lidar com amostras de ASyn e buffers HDX-MS, (2) como realizar mapeamento de peptídeos para um experimento HDX-MS de baixo para cima, (3) como adquirir dados HDX-MS sobre ayn monomérica em condições fisiológicas, especificamente no domínio de tempo milissegundo (usando um instrumento personalizado; instrumentos alternativos para rotulagem de milisse e (4) como processar e analisar os dados do HDX-MS. Métodos que utilizam aSyn monomérica em pH fisiológico (7.40) em duas condições de solução são exemplificados aqui. Embora criticamente úteis no estudo de aSyn, esses procedimentos podem ser aplicados a qualquer proteína e não se limitam a proteínas intrinsecamente desordenadas.

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Protocolo

1. Expressão proteica e purificação de aSyn

  1. Prepare aSyn após um relatório publicado anteriormente9.
  2. Dialisar em um buffer de armazenamento seguro (por exemplo, Tris, pH 7.2 ).
  3. Se necessário, concentre a amostra (por exemplo, tubos de microcentrifuuge do filtro de spin usando 3 kDa MWCO, 14.000 x g por aproximadamente 10-30 min, ver Tabela de Materiais).
    NOTA: É aconselhável não se concentrar excessivamente. A integridade do conjunto monômero não foi verificada além de 25 μM.
  4. Aliquot e armazenar a −80 °C
    NOTA: A proteína monômero aSyn é estável por até 1 ano nestas condições de armazenamento.

2. Preparação do buffer HDX

NOTA: Como o Tris tem um coeficiente de alta temperatura, a medição do pH precisa ser ajustada para a temperatura em que será feita a reação HDX, que é de 20 °C neste protocolo.

  1. Prepare o tampão de equilíbrio para o Estado A e o Estado B pesando 0,002 mol de Tris em 100 mL de água de grau LC-MS. Para o Estado B, adicione 29,8 mg de CCL, 14,2 mgs de MgCl2, 36,8 g de CaCl2 e 836 mg de NaCl ao buffer Tris. Ajuste o pH para 7,40 ± 0,05.
    NOTA: O tampão de equilíbrio deve conter as condições em que a ASyn deve ser estudada. Neste caso, são 20 mM Tris em pH 7,4 +/− sais.
  2. Prepare o tampão de rotulagem para o Estado A e o Estado B pesando 0,002 mol de Tris em 100 mL de água deuterada. Para o Estado B, adicione 29,8 mg de CCL, 14,2 mgs de MgCl2, 36,8 g de CaCl2 e 836 mg de NaCl ao buffer de rotulagem Tris. O pD do tampão de rotulagem corresponde ao pH do buffer de equilíbrio. Como pH = pD - 0,41, ajuste para que o medidor de pH leia 6,99 ± 0,0523,24.
    NOTA: O tampão de rotulagem precisa ter os mesmos componentes do tampão de equilíbrio, exceto que ele é preparado usando água deuterada.
  3. Prepare o tampão de saciar pesando 0,010 mol de Tris e 0,050 mol de ureia e faça até 100 mL com água de grau LC-MS. Ajuste o pH para 2,50 ± 0,05 a 0,5 °C.
    NOTA: Uma tela tampão de saciar deve ser realizada antes dos experimentos HDX para identificar o melhor tampão de saciar para a proteína de interesse. Diferentes concentrações e combinações de denaturantes (por exemplo, cloridrato de ureia e guanidinium) e agentes redutores (por exemplo, tris(2-carboxyethyl)fosfina) são rastreados, juntamente com parâmetros físicos como volume de trapping e temperatura, para efetivamente desdobrar e digerir a proteína saciada. Um tampão de saciar composto por 100 mM Tris e 0,5 M de ureia no pH 2,50 é ideal para o presente estudo.
  4. Prepare o tampão de lavagem da coluna de digestão pesando 0,125 mol de cloridrato de guanidinium em uma garrafa de vidro Duran. Adicione 25 mL de metanol e 250 μL de ácido fórmico. Faça até 250 mL com água de grau LC-MS.
    NOTA: Para a coluna de pepsina Enzymate BEH (ver Tabela de Materiais), use um tampão de lavagem de coluna de 0,5 M de cloridrato de guanidinium, 10% (v/v) de metanol e 0,1% (v/v) ácido fórmico.
  5. Prepare a lavagem fraca da seringa ao tubo de 0,5 μL de ácido fórmico em 249,5 mL de água de grau LC-MS.
  6. Prepare a lavagem forte da seringa misturando partes iguais de água de grau LC-MS, metanol, acetonitrilo e isopropanol. Adicione o ácido fórmico a uma concentração final de 2% (v/v).
    NOTA: Para evitar a contaminação cruzada entre os vários buffers e a proteína e permitir a limpeza da porta de injeção, é fundamental que as soluções de lavagem de seringas sejam preparadas e que o caminho de fluxo para a válvula (muitas vezes chamado de "forro de lavagem") seja totalmente preparado com líquido. O ácido fórmico é opcional para a lavagem fraca da seringa.

3. Procedimento de mapeamento de peptídeos

  1. Prepare a amostra seguindo o passo abaixo.
    1. Filtro descongelou o estoque de proteínaSyn do congelador de −80 °C com filtros de seringa de 0,22 μm. Meça a absorvância da proteína de estoque filtrada em 280 nm para determinar a concentração pela lei Beer-Lambert. Diluir a proteína a uma concentração de 5 μM no tampão de equilíbrio (passo 2.1.).
      NOTA: A lei Beer-Lambert: A = εcl, onde A é absorvente, ε é o coeficiente de extinção da proteína no comprimento de onda medido (280 nm aqui) com unidades M−1cm−1, c é a concentração proteica em M, e l é o comprimento do caminho em cm. Para o tipo selvagem aSyn26, ε = 5960 M−1cm−1.
  2. Configure o método de cromatografia líquida.
    1. Crie um arquivo de entrada com um tempo de carga/captura de 3 min a uma pressão de 7000-9000 psi, seguido por um gradiente de 5% de acetonitrila a 40% de acetonitrila em 7 min, seguido por repetidas etapas de lavagem de 5%-95% de acetonitrila-água por 10 minutos.
    2. Certifique-se de que o spray de bloqueio (por exemplo, enkephalina leucina, ver Tabela de Materiais) esteja fluindo a 2000 psi e conectado à sonda de pulverização de bloqueio de origem do espectrômetro de massa.
  3. Configure os métodos de espectrometria de massa MSE .
    NOTA: O MSE é um método de aquisição independente de dados de banda larga sem isolamento de massa precursor. Portanto, todos os íons dentro da faixa m/z selecionada são fragmentados ainda mais usando dissociação induzida por colisão (CID)27.
    1. No arquivo do método MS, escolha o MSE Continuum e configure um tempo de aquisição entre 2-10 min, fonte de eletrospray e modo de resolução positiva. Adquira MSE acima de 50-2000 Da, escaneando a cada 0.3 s.
    2. Para a função 1 (baixa energia), configure a armadilha e transfira energias de colisão para ser 4 V. Para a função 2 (alta energia), configure a energia de colisão de transferência de rampa para ser constante em 4V e a energia de colisão da armadilha seja conforme indicado na Tabela 1 para cada nível de energia de mapeamento.
      NOTA: Os métodos MSE de mobilidade de íons também podem ser usados. Métodos alternativos de mapeamento (por exemplo, aquisição dependente de dados ou DDA) podem ser usados a critério do usuário.
  4. Configure o robô autosampler (ver Tabela de Materiais).
    1. Adicione 50 μL da proteína de 5 μM a um frasco de recuperação total. Coloque o frasco em uma posição de amostra na câmara direita HDX. Certifique-se de que esta câmara está em 0,5 °C.
    2. Adicione um frasco de reagente de tampão de equilíbrio e dois frascos de reagente de tampão de rotulagem para as posições de reagente um, dois e três na câmara esquerda HDX. Certifique-se de que esta câmara está a 20 °C, definindo o controlador de temperatura Peltier (ver Tabela de Materiais). Adicione um frasco de reagente de tampão de saciar à posição do reagente na câmara direita HDX.
    3. Adicione oito frascos de recuperação total nas posições de reação da câmara esquerda HDX e oito frascos de recuperação máxima nas posições de reação da câmara direita HDX.
      NOTA: Para garantir a limpeza completa e a reprodutibilidade máxima dos volumes dispensados, é aconselhável realizar uma lavagem de seringa e uma lavagem primordial nas seringas do autopesado. Por exemplo, execute uma sequência de (1) lavagem fraca, (2) lavagem forte, (3) lavagem fraca antes de iniciar os experimentos de mapeamento. Esta sequência pode ser repetida extensivamente, e é recomendável fazê-lo até 20x ou até que a seringa esteja totalmente molhada.
    4. Configure uma lista de amostras com métodos apropriados de LC e MS no software de agendamento e inicie o cronograma.
      NOTA: Para o presente estudo, o Cronos é usado como software de agendamento (ver Tabela de Materiais).
  5. Processe os dados de mapeamento.
    1. Identifique peptídeos a partir dos arquivos de experimento de mapeamento usando software apropriado (ver Tabela de Materiais).
    2. Importar dados de identificação de peptídeos em DynamX (ver Tabela de Materiais) utilizando os seguintes parâmetros de limiar de peptídeo: intensidade mínima = 5000, comprimento mínimo de sequência = 0, comprimento máximo da sequência = 40, produtos mínimos = 1, produtos mínimos por aminoácido = 0,25, produtos consecutivos mínimos = 2, intensidade mínima de soma para produtos = 0, escore mínimo = 0, escore mínimo = 0, e máximo erro de MH+ (ppm) = 0.
      NOTA: Alternativamente, obtenha as configurações otimizadas de acordo com um fluxo de trabalho recomendado28.
    3. Selecione Dados no menu e clique em Importar Resultados PLGS. Clique em Adicionar para escolher os arquivos de dados relevantes para a atribuição espectral. Quando tudo tiver sido adicionado, clique em 'Próximo ' e digite as configurações do filtro acima. Em seguida, clique em Concluir.
    4. Faça a curadoria manual de atribuições isotópicas para obter o mapa final de cobertura de peptídeos de aSyn em DynamX.

4. Estudo de troca de hidrogênio/deutério de milissegundo

  1. Limpe o instrumento protótipo FastHDX (ver Tabela de Materiais) antes de iniciar experimentos HDX.
    1. Abra o software HDX compatível GUI e permita que o sistema inicialize.
    2. Insira a temperatura da Câmara de Amostra a 20 °C e a Câmara de Suto como 0,5 °C. Clique em Definir para aplicar as novas temperaturas.
    3. Configure os tubos de centrífugas com água de grau LC-MS em todas as entradas.
    4. Na guia Titrator Plumbing Delivery , verifique as seringas esquerda e direita e clique em Prime para remover quaisquer bolhas de ar latentes nos tubos. Repita até que todas as bolhas se vão.
    5. Na guia Macros , verifique todas as caixas para as seringas. Clique em Calibrar Seringas Posição inicial. Clique em Wash Syringe Load Loop. Clique em Lavar todos os volumes de loop de mistura.
    6. Repita o passo 4.1.5. 1x mais.
    7. Se aparecerem bolhas nas seringas tampão, degas desconectando a seringa e ejetando a bolha verticalmente. Substitua a seringa e recalibra até a posição zero.
  2. Configure o instrumento protótipo FastHDX para experimentos HDX.
    1. Adicione 500 uL de 5 μM aSyn filtrados em um frasco de recuperação total e coloque dentro de uma geladeira de mesa para evitar oligomerização e agregação induzida pela temperatura.
    2. Adicione 50 mL de equilíbrio, rotulagem e sacie buffers a cada buffer (2). Etapas de preparação do buffer HDX 1-3) entrada nas câmaras esquerda e direita.
    3. Adicione 50 mL de tampão de lavagem de coluna (2. Etapa de preparação do buffer HDX 4) para a entrada de lavagem da pepsina.
    4. Para preparar as linhas de lavagem de proteínas e colunas 1x, verifique as seringas esquerda e direita na guia Titrator Plumbing Delivery e clique em Prime uma vez.
      NOTA: Qualquer clique subsequente no Prime causará repetições adicionais do processo primo, resultando no consumo de grandes quantidades de amostra de proteína. O cuidado é aconselhável evitar isso, mesmo quando há um atraso no software após uma tentativa de clique de botão.
    5. Repita as etapas 4.1.5. 1x.
    6. Na guia Fluxo de saciamento manual , digite as configurações necessárias, explicadas nas etapas 4.2.7.-4.2.10.
    7. Para um experimento de curso de tempo, digite os tempos em milissegundos usando o botão pontos simbólicos . Se forem necessárias réplicas, adicione o mesmo ponto de tempo várias vezes, por exemplo, para um triplicado de 50 ms, 50 50 50 precisa ser inserido. A lista de amostras no software de espectrômetro de massa (MassLynx é usado aqui, ver Tabela de Materiais) precisa corresponder exatamente a esses pontos de tempo.
      NOTA: Os nomes dos arquivos da lista de espectrômetros de massa e/ou texto de amostra devem ser usados para garantir um registro permanente dos tempos de rotulagem HDX correspondentes aos inseridos na GUI do software FastHDX. Os tempos de rotulagem para cada amostra não serão armazenados em nenhum outro lugar.
    8. Definir tempo de armadilha (minutos) para ser o comprimento do tempo de captura. Aqui, são 3:00.
    9. Definir Aguarde por HPLC (minutos) = (tempo de armadilha + tempo de execução + 1,5 min).
      NOTA: Por exemplo, para um experimento com 3 min de trapping e 17 min de gradiente, este será de 21,50 min.
    10. Clique na caixa Run Blank somente se executar experimentos em branco entre as séries de amostras. Se sim, certifique-se de uma entrada (ou seja, uma linha válida na lista de amostras) no software para a execução em branco após cada amostra executada.
    11. Uma vez que a lista de amostras esteja pronta no software, destaque as entradas apropriadas e inicie a execução no software clicando no botão Play e fastHDX no software.
      NOTA: Devido à mistura de hidrogênio/deutério, métodos somente de MS ou técnicas de fragmentação suave (dissociação de transferência de elétrons, dissociação de captura de elétrons e foto dissociação ultravioleta) podem ser usados apenas29. Para aSyn em um pH fisiológico de 7,40, pontos de tempo que variam de 50 ms a 300 s são mais aplicáveis, pois estes cobrem toda a curva de absorção de deutério8.

5. Processamento de dados

  1. Carregue o arquivo de peptídeos espectralmente atribuídos dos experimentos de mapeamento de peptídeos. Abra o menu Arquivo e clique em Abrir no software DynamX (ver Tabela de Materiais).
  2. Importe arquivos brutos para o software de medição de massa preferido (por exemplo, DynamX, HDExaminer, etc.). Abra o menu "Dados" e clique em Arquivos MS. Clique em Novo Estado para criar estados para cada condição proteica estudada.
    1. Clique em Nova Exposição para adicionar cada ponto de tempo HDX. Clique em New RAW para importar os arquivos .raw. Arraste cada arquivo .raw para a posição correta. Clique em OK quando terminar.
  3. Atribuir automaticamente isótopos primeiro (este é automático seguindo a etapa 5.2. acima), em seguida, faça a curadoria manual da atribuição isotópica para garantir a alta qualidade dos dados.
  4. Exporte os dados do cluster para um arquivo .csv com colunas na seguinte ordem: nome da proteína, número de início de sequência, número final de sequência, sequência, sequência, modificação, fragmento, captação máxima possível, massa de espécies monoisotópicas, nome do estado, tempo de exposição, nome do arquivo, carga, tempo de retenção, intensidade e centroide.
  5. Abra o menu Data no software de medição em massa e clique em Dados de Cluster de Exportação.

6. Análise de dados

  1. Carregue os dados de cluster exportados no software de análise HDX preferido. Aqui, o HDfleX é usado30 (ver Tabela de Materiais).
  2. Encaixe os dados experimentais para todos os peptídeos e estados, selecionando os métodos apropriados de correção de back-exchange para obter constantes de taxa observadas para a reação HDX.
  3. Calcule um limiar de significância global pelo método preferido (O HDfleX suporta várias opções para isso) e realize testes de significância híbrida para determinar as diferenças significativas entre os estados em comparação com31,32.
    NOTA: Se a diferença observada for maior que o limiar global e o valor p for inferior ao nível de confiança escolhido (por exemplo, 95%), a diferença é considerada significativa.

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Resultados

Devido à sua natureza intrinsecamente desordenada, é difícil capturar as intrincadas mudanças estruturais em aSyn no pH fisiológico. HDX-MS monitora a troca isotópica em hidrogênios de amido backbone, sondando a dinâmica e interações conformais da proteína. É uma das poucas técnicas para adquirir essas informações em altas resoluções estruturais e temporais. Este protocolo é amplamente aplicável a uma ampla gama de proteínas e condições de tampão, e isso é exemplificado pela medição da cinética cambial de aSyn em duas co...

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Discussão

No presente artigo, são descritos os seguintes procedimentos: (1) a realização de experimentos de mapeamento de peptídeos em aSyn monomérica para obter a maior cobertura de sequência, (2) aquisição de dados milissegundos HDX-MS sobre a aSyn monomérica em condições fisiológicas e (3) a realização da análise e interpretação dos dados de HDX-MS resultantes. Os procedimentos fornecidos são geralmente simples de executar, cada experimento de rotulagem normalmente dura apenas cerca de 8h para três réplicas e oito pontos de tem...

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Divulgações

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Agradecimentos

A NS é financiada pela Bolsa de Estudos do Jubileu de Diamante do Conselho Universitário. A JJP é apoiada por uma Ukri Future Leaders Fellowship [Número de subvenção: MR/T02223X/1].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 &vezes; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μ m Coluna C18Waters Corporation186002346Coluna analítica
Acetonitrila HPLC grau >99,9% HiPerSolvVWR20060.420Para fases móveis LC
CaCl2Sigma Sal AldrichC5670para buffers HDX
ChronosAxel Semrau (Adquirido da Waters Corporation)667006090Software de agendamento para permitir várias injeções de amostras HDX-MS automaticamente. Está disponível software alternativo de outros fornecedores, por exemplo, HDXDirector ou LEAP Shell Cloreto de
deutérioGoss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-2-50Para tampões de marcação HDX
Óxido de deutério (99,9% D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-4Água deuterada
DynamX 3.0Waters Corporation176016027Atribuição isotópica e cálculo de incorporação de deutério
Coluna de pepsina Enzimato BEH WatersCorporation186007233Coluna de digestão de pepsina
Ácido fórmico, 99,0% LC / MS GrauFisher Scientific10596814Para fases móveis LC
Cloridrato de guanidínioSigma AldrichRDD001-500GChaotrope / Desnaturante
HDfleXUniversidade de ExeterN / Ahttps://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KClSigma AldrichP3911Sal para buffers HDX
LEAP HDX-2 CTC PAL robô de amostragemWaters Corporation725000637Robô amostrador automático
Leucina encefalinaWaters Corporation186006013Para calibração de lockspray de espectrometria de massa.
MassLynxWaters Corporation667004007Software controlando métodos de entrada e espectrômetro de massa
Frascos de recuperação máximaWaters Corporation600000670CV100 pack incluindo tampas - usado para bandeja de têmpera em LEAP HDX-2
MgCl2Sigma AldrichM8266Sal para buffers HDX
Millipore 0.22 µ m filtros de seringaMilliporeN9CA7069BFiltros de seringa
ms2minApplied Photophysics LtdN/Ade mistura rápida de fluxo de têmpera milissegundo instrumento hdx
NaClSigma AldrichS9888Sal para buffers HDX
Controlador de temperatura PeltierLEAP Technologies Inc.Controlador HP115-COOL/DPeltier para definir a temperatura precisa das câmaras no robô LEAP.
ProteinLynx Global Server 3.0Waters Corporation715001030Software de identificação de peptídeos. Softwares alternativos estão disponíveis em outros fornecedores.
Tampas de potes de reagentesWaters Corporation186004632pacote de 100
potes de reagentes para LEAP HDX-2Waters Corporation186001420 pacote de100 excluindo tampas - usado para tampões em LEAP HDX-2
Deuteróxido de sódio (99,5% em D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-57Para tampões de rotulagem HDX
Tubos de microcentrífuga com filtro de rotação (3 kDa MWCO)Amicon (Merck Sigma Aldrich)UFC5003Micro tubos de centrífuga para concentrar proteínas. Isso facilita a troca de buffer e o carregamento preciso de amostras para experimentos HDX-MS.
Espectrômetro de massa Synapt G2-Si Espectrômetromassa Waters Corporation176850035
Frascos de recuperação totalWaters Corporation600000671CV100 pacotes incluindo tampas - usado para rotular a bandeja em LEAP HDX-2
Tris-HClSigma AldrichT3253-250GBuffer
Trizma base SigmaAldrichT60040-B2005Buffer
UreiaSigma AldrichU5378-1KGChaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 coluna Coluna de dessalinização de armadilha186004623da Waters Corporation
de

Referências

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 1 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820(2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712(2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424(2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. New York. 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

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