Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca2+ em miócitos de roedores

Summary

Um conjunto de protocolos são apresentados que descrevem a medida da função contrátil via detecção do comprimento do sarcômero juntamente com a medição transitória de cálcio (Ca²⁺) em miócitos isolados de ratos. A aplicação desta abordagem para estudos em modelos animais de insuficiência cardíaca também está incluída.

Abstract

A disfunção contrátil e os transientes de Ca²⁺ são frequentemente analisados a nível celular como parte de uma avaliação abrangente da lesão e/ou remodelação induzida pelo coração. Uma abordagem para avaliar essas alterações funcionais utiliza o encurtamento descarregado e análises transitórias de Ca²⁺ em miócitos cardíacos adultos primários. Para esta abordagem, os miócitos adultos são isolados por digestão de colagenase, tornados tolerantes ao Ca²⁺ e, em seguida, aderidos a coberturas revestidas de laminina, seguidas de estimulação elétrica em meio livre de soro. O protocolo geral utiliza miócitos cardíacos de ratos adultos, mas pode ser prontamente ajustado para miócitos primários de outras espécies. Alterações funcionais em miócitos de corações lesados podem ser comparadas a miócitos simulados e/ou a tratamentos terapêuticos in vitro . A metodologia inclui os elementos essenciais necessários para a estimulação dos miócitos, juntamente com a câmara celular e os componentes da plataforma. O protocolo detalhado para esta abordagem incorpora as etapas para medir o encurtamento descarregado pela detecção do comprimento do sarcômero e transientes celulares de Ca²⁺ medidos com o indicador ratiometric Fura-2 AM, bem como para a análise de dados brutos.

Introduction

A análise da função da bomba cardíaca geralmente requer uma série de abordagens para obter uma visão adequada, especialmente para modelos animais de insuficiência cardíaca (IC). A ecocardiografia ou as medidas hemodinâmicas fornecem informações sobre a disfunção cardíaca in vivo ¹, enquanto abordagens in vitro são frequentemente empregadas para identificar se a disfunção surge de alterações no miofilamento e/ou no transiente Ca²⁺ responsável pela excitação do acoplamento, ou o potencial de ação, com função contrátil (por exemplo, acoplamento excitação-contração [E-C]). As abordagens in vitro também oferecem uma oportunidade para rastrear a resposta funcional a neurohormônios, alterações genéticas induzidas por vetores, bem como potenciais agentes terapêuticos² antes de buscar estratégias de tratamento in vivo dispendiosas e/ou trabalhosas.

Várias abordagens estão disponíveis para investigar a função contrátil in vitro, incluindo medidas de força em trabéculas³ intactas ou miócitos permeabilizados⁴, bem como encurtamento descarregado e transientes de Ca²⁺ em miócitos intactos na presença e ausência de IC ^5,6. Cada uma dessas abordagens tem como foco a função contrátil dos miócitos cardíacos, que é diretamente responsável pela função da bomba cardíaca ^2,7. No entanto, a análise da contração e do acoplamento E-C é mais frequentemente realizada medindo o encurtamento do comprimento muscular e os transientes de Ca 2+ em miócitos adultos isolados e tolerantes a Ca²⁺. O laboratório utiliza um protocolo detalhado publicado para isolar miócitos de corações de ratos para esta etapa⁸.

Tanto o transiente de Ca²⁺ quanto os miofilamentos contribuem para o encurtamento e realongamento dos miócitos intactos e podem contribuir para a disfunção contrátil ^2,7. Assim, esta abordagem é recomendada quando a análise funcional in vitro requer um miócito intacto contendo a maquinaria de ciclagem Ca²⁺ mais os miofilamentos. Por exemplo, miócitos isolados intactos são desejáveis para o estudo da função contrátil após a modificação do miofilamento ou da função de ciclagem de Ca²⁺ via transferência gênica⁹. Além disso, uma abordagem de miócitos intactos é sugerida para analisar o impacto funcional dos neurohormônios ao estudar o impacto das vias de sinalização do segundo mensageiro a jusante e/ou a resposta a agentes terapêuticos². Uma medida alternativa da força dependente da carga em miócitos únicos é mais frequentemente realizada após a permeabilização da membrana (ou esfolamento) a baixas temperaturas (≤15 °C) para remover a contribuição transitória de Ca²⁺ e focar na função miofilamentar¹⁰. A medida da força dependente da carga mais transientes de Ca²⁺ em miócitos intactos é rara devido em grande parte ao desafio complexo e técnico da abordagem¹¹, especialmente quando é necessário maior rendimento, como para medir as respostas à sinalização neurohormonal ou como uma tela para agentes terapêuticos. A análise das trabéculas cardíacas supera esses desafios técnicos, mas também pode ser influenciada por não miócitos, fibrose e/ou remodelamento da matriz extracelular². Cada uma das abordagens descritas acima requer uma preparação contendo miócitos adultos porque os miócitos neonatais e miócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzíveis (iPSCs) ainda não expressam o complemento completo de proteínas de miofilamento adulto e geralmente não possuem o nível de organização de miofilamentos presente no miócito adulto em forma de bastonete². Até o momento, evidências em iPSCs indicam que a transição completa para isoformas adultas excede mais de 134 dias em cultura¹².

Dado o foco desta coleção na IC, os protocolos incluem abordagens e análises para diferenciar a função contrátil em miócitos intactos com falha versus não falha. Exemplos representativos são fornecidos a partir de miócitos de ratos estudados 18-20 semanas após uma coarctação suprarrenal, descrita anteriormente ^5,13. Comparações são então feitas com miócitos de ratos tratados com simulação.

O protocolo e a plataforma de imagem aqui descritos são utilizados para analisar e monitorar alterações no encurtamento e transientes de Ca²⁺ em miócitos cardíacos em forma de bastonete durante o desenvolvimento de IC. Para esta análise, miócitos em forma de bastonete tolerantes a 2 x 10 4⁴ Ca²+ são banhados em coberturas de vidro revestidas de laminina (CSs)^{de 22 mm 2} mm e cultivados durante a noite, conforme descrito anteriormente⁸. Os componentes montados para esta plataforma de imagem, juntamente com os meios e buffers usados para imagens ideais, são fornecidos na Tabela de Materiais. Um guia para análise de dados usando um software e os resultados representativos também são fornecidos aqui. O protocolo geral é dividido em subseções separadas, com as três primeiras seções se concentrando em miócitos isolados de ratos e análise de dados, seguidas por experimentos transitórios celulares de Ca²⁺ e análise de dados em miócitos.

Protocol

Os estudos realizados em roedores seguiram a Política do Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanitários e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Para este estudo, os miócitos foram isolados de ratos Sprague-Dawley e F344BN de 3-34 meses de idade, pesando ≥ 200 g⁵. Foram utilizadas as taxas masculinas e femininas.

1. Estimulação miocitária para estudos da função contrátil

1. Faça meios frescos à base de M199 para cada conjunto de miócitos isolados (Tabela de Materiais). 1 dia antes da marcha, placa 2 x 10⁴ Ca 2+ tolerantes a miócitos em forma de bastonete em²² mm² lâminas de vidro revestidas de laminina (CSs), conforme descrito anteriormente⁸.
2. Para preparar as câmaras, mergulhe cada câmara em 10% de água sanitária por 1 h. Em seguida, lave as câmaras com água corrente da torneira por 30-45 min, seguida de água destilada substituída a cada 5 min por 30 min, seguida de água deionizada substituída a cada 5 min por 30 min e um enxágue final em água deionizada.
3. Secar as câmaras em uma superfície limpa por 20-30 min (Figura suplementar 1A-C). Em seguida, os UV tratam as câmaras em um armário de biossegurança por 5 min em cada direção (total = 20 min). Esta etapa não é necessária para câmaras pré-esterilizadas.
   CUIDADO: Deixe a área para minimizar a exposição aos raios UV.
4. Remova a tampa da câmara, adicione 3 mL de meio à base de M199 (ver Tabela de Materiais) a cada poço (Figura suplementar 1B), substitua a tampa e pré-aqueça a câmara em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO 2 e 20% de O₂.
5. Esterilizar fórceps em um esterilizador de contas quentes a 250 °C por 20-25 s. Transfira a câmara de estimulação pré-aquecida da incubadora para um gabinete de biossegurança.
6. Transfira cada coverslip (CS) contendo miócitos cardíacos para poços individuais na câmara de estimulação usando pinça estéril. Transfira CSs quatro de cada vez, seguido de aquecimento por 10 minutos antes da transferência dos quatro CSs restantes para manter a temperatura do meio.
7. Anexar macacos de banana à câmara de estimulação em uma extremidade (Figura suplementar 1C) e ao estimulador na outra extremidade (Figura suplementar 1D).
8. Defina a frequência do estimulador para 0,2 Hz e defina a tensão (~ 12 V) para alcançar a contração em ~10%-20% de todos os miócitos cardíacos em forma de bastonete dentro de um poço. Para determinar o número de miócitos em contração, coloque a câmara sob um microscópio invertido com ampliação de 4x a 10x.
9. Colocar a câmara de estimulação numa incubadora a 37 °C a 5% de CO₂ (Figura suplementar 1E). Troque o meio a cada 12 h usando o meio pré-aquecido em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ por 20-25 min. Continue a estimulação elétrica por até 3 dias com a mídia trocada a cada 12 h.

2. Análise da função contrátil de miócitos cardíacos de ratos adultos

1. Pré-aqueça uma embalagem de gel e um meio em uma incubadora de 37 °C por 30 minutos antes do experimento.
2. Ligue os componentes da plataforma de função contrátil listados na Tabela de Materiais e mostrados na Figura Suplementar 2, com especial atenção aos componentes-chave, que incluem uma tabela antivibração (Figura Suplementar 2A-1) com um microscópio invertido com um filtro vermelho profundo (590 nm) (Figura Suplementar 2A-2,3) e uma câmera CCD (Figura Suplementar 2A-4) conectada a um controlador CCD (Figura suplementar 2A-5 e Figura suplementar 2C-5) e integrada com um computador PC (Figura suplementar 2B-14).
3. Montar a tubulação na bomba peristáltica (Figura suplementar 2A-8; Figura suplementar 2A-8), transfira o pacote de gel pré-aquecido para o suporte do tubo (Figura suplementar 2A-9) e ligue o vácuo (Figura suplementar 2A-11) e a alimentação para o estimulador celular (Figura suplementar 2B-13).
4. Colocar um tubo de 50 mL com meio no suporte do tubo isolado (Figura suplementar 2A-9) e iniciar a perfusão a ~0,5 mL/min através do tubo da bomba peristáltica (Figura suplementar 2E-8).
5. Adicione uma pequena quantidade de meio pré-aquecido a um pequeno barco de pesagem (~ 2 mL). Transfira um CS contendo miócitos da câmara de estimulação para o barco de pesagem. Devolver a câmara de estimulação a 37 °C na incubadora de CO₂ a 5%.
6. Remova o CS do barco de pesagem e limpe suavemente a parte inferior. Transfira o CS para uma câmara CS recém-lubrificada (Figura suplementar 2A, F-10; seta preta) e adicione suavemente uma gota de mídia (~200 μL) ao CS.
7. Coloque um suporte de eletrodo de platina sobre o CS (Figura suplementar 2F; seta cinza) e coloque um novo CS por cima usando pinças. Coloque uma montagem superior (Figura 2F suplementar; seta branca) sobre o sanduíche CS e, em seguida, instale dois ou quatro parafusos de cabeça de panela #0 para terminar de montar a câmara.
8. Uma vez que o meio esteja presente em toda a tubulação da bomba, prenda a tubulação ao pré-aquecedor e, em seguida, conecte o pré-aquecedor à câmara CS montada na etapa 2.7. Comece a perfusão a 0,5 mL/min e coloque um lenço de papel abaixo da câmara para se certificar de que não há vazamentos.
9. Coloque a câmara CS no adaptador de palco. O meio perfundido é coletado na extremidade oposta da câmara com tubos conectados a um sistema de vácuo. Ligue o sistema de aquecimento (Figura suplementar 2A, D-7) e equilibre a câmara, a objetiva e o pré-aquecedor por ~5-10 min para atingir uma temperatura constante do meio de 37 °C. Visualize miócitos com a objetiva de imersão em água de 40x no microscópio durante esse tempo de equilíbrio.
10. Ative o estimulador de estimulação (Figura suplementar 2B-13) ajustando a tensão para 1,5x a configuração necessária para que 80% das células em forma de bastonete se contraiam, o que normalmente é de 35-40 V. Defina a frequência de estimulação para 0,2 Hz para otimizar a função contrátil e a sobrevivência dos miócitos.
11. Colete traços contráteis de encurtamento e realongamento de miócitos continuamente perfundidos e cadenciados. Para coletar medições de encurtamento, use uma câmera CCD (Figura suplementar 2A-4) conectada a um controlador CCD (Figura suplementar 2B-5,C) e um computador dedicado com uma placa controladora de E/S (Figura suplementar 2B-14; consulte Tabela de materiais). A plataforma mede o encurtamento do sarcômero em miócitos de ratos, embora resultados semelhantes sejam obtidos a partir de medições de miócitos coletadas das bordas longitudinais dos miócitos (ver Ecklerle et ^al.14).
12. Para coletar rastreamentos de encurtamento de sarcômero, abra o software no computador, selecione OK e Arquivo > Novo. Prepare um modelo de tela selecionando Rastreamentos > Editar Limites de Usuário > Comprimento do Sarcomere e, em seguida, definindo valores máximos e mínimos, que normalmente estão entre 2,0 μm e 1,5 μm. Calibrar a câmera CCD com uma gráticula de 0,01 mm antes de fazer medições nos miócitos (Figura 1D).
13. Para registrar rastreamentos de comprimento de sarcômero, selecione Arquivo > Novo. Identifique um miócito em contração e posicione-o ao longo do eixo longitudinal da câmera de modo que o padrão de estriação seja vertical (Figura 1B).
14. Use o mouse do computador para colocar a caixa da região de interesse (ROI) (caixa rosa) sobre o miócito (Figura 1C). Selecione Coletar e Iniciar para registrar a função contrátil. Recorde de encurtamento por 60 s de cada miócito em baixas frequências de estimulação (≤0,5 Hz).
15. Registre o encurtamento do sarcômero de 5-10 células por CS. Realize medições em 1 célula/CS se os estudos incluírem tratamento com agonistas/antagonistas. Prepare um meio pré-aquecido separado e uma peça de tubo de perfusão diferente e dedicada carregada em uma bomba peristáltica multicanal e siga as etapas 2.9.-2.14. para medir o impacto da administração de drogas ou neuro-hormônios na função contrátil dos miócitos.
16. Para medir o encurtamento em uma faixa de frequências, acelere os miócitos em cada frequência para obter o encurtamento em estado estacionário antes do registro⁵. Para esses estudos, dobre a taxa de perfusão e comece a gravar 15-20 s após a estimulação em uma nova frequência para obter respostas contráteis consistentes no estado estacionário para frequências na faixa de 0,2 Hz e 2 Hz. Normalmente, registre não mais do que 2 miócitos / CS para encurtamento em toda a faixa dada de frequências de estimulação.
17. Registre pelo menos 7 contrações/célula para obter dados confiáveis de média de sinal ao analisar as gravações (consulte a etapa 3).

3. Análise dos dados da função contrátil em miócitos isolados

1. Para começar, selecione Arquivo, escolha um rastreamento gravado e selecione Abrir. Selecione Tab 1 (lado esquerdo) do rastreamento base e defina o painel amarelo na parte superior do rastreamento como Sarc-Length. Selecione Rastreamentos e o modelo de tela preparado na etapa 2.12.
2. Para preparar um modelo de análise, selecione Operações, Opções de Análise Transiente Monotônica, Marca de Evento TTL na caixa Definição de t0, bem como as seguintes opções no menu: Linha de base (comprimento do sarcômero em repouso), Velocidade de partida em relação a t0 (dep v), Pico (altura do pico e %altura do pico/linha de base ou bl%pico h), Velocidade de retorno relativa ao tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) usando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) usando tPeak. Salve essas opções de análise selecionando Modelos > Salvar modelo de análise com um identificador. Carregue esse modelo de análise antes de analisar cada rastreamento.
3. Para iniciar a análise de dados, selecione Marcas > Porta > Adicionar > Transitória Converter da Marca de Evento > Intervalo de Análise. Agora defina o intervalo de tempo de -0,01 s a 1,20 s para miócitos com ritmo de 0,2 Hz (Figura 2A, marcas vermelhas na porção inferior do traço bruto). Selecione um intervalo de tempo mais curto para miócitos estimulados em frequências mais altas.
4. Produza um rastreamento com média de sinal selecionando Operações > Eventos Médios. Uma gravação com média de sinal aparece abaixo do rastreamento de base original.
5. Selecione a guia 1 do rastreamento com média de sinal (lado esquerdo da tela) e selecione Marcas no menu superior, seguido de Adicionar transitório. Selecione Operações no menu superior e Análise Transiente Monotônica para exibir os valores médios de sinal para comprimento de sarcômero de linha de base, altura de pico, bl%pico h, dep v, ret v, TTP 50% e TTR_50% no painel de exibição com média de sinal.
6. Transfira cada análise transitória de sarcômero para uma planilha para a análise composta de miócitos múltiplos selecionando Exportar > Análise Transiente Monotônica > Corrente da Área de Transferência. Cole esses dados na planilha para cada rastreamento.
7. Para copiar o rastreamento com média de sinal, selecione Exportar > Opções da Área de Transferência > Área >de Transferência Atual e defina as casas decimais como 5, selecione Delimitador de Tabulações e clique em OK e OK. Cole os traços médios de sinal para cada registro de miócitos em uma segunda planilha.

4. Registo de transientes de Ca²⁺ em miócitos cardíacos adultos de ratos

1. Antes de medir os transientes de Ca 2+, ligue os componentes da plataforma descritos na etapa 2.2., juntamente com componentes adicionais de imagem de fluorescência (consulte componentes adicionais para análise de imagem de Ca²⁺ na Tabela de Materiais; Figura suplementar 2A-5,6; 2B-12).
2. Preparar a solução-mãe de Fura-2AM contendo 1 mM de Fura-2AM mais probenecida 0,5 M em dimetilsulfóxido (DMSO). A probenecida minimiza o vazamento de Fura-2AM¹⁵.
3. Diluir a solução-mãe a 5 μM de Fura-2AM e 2,5 mM de probenecida em 2,5 ml de meio (ver Tabela de Materiais) num poço de uma placa de 6 potes. Adicione apenas 2,5 mL de meio (sem Fura-2AM) a três poços adicionais na placa, cubra a placa com papel alumínio e pré-aqueça o meio a 37 °C.
4. Transfira um CS contendo miócitos da câmara de estimulação para o poço contendo Fura-2AM, cubra e devolva a placa à incubadora de 37 °C com 5% de CO₂ por 4 min. Montar a tubulação na bomba de perfusão e perfundir com o meio durante o período de carregamento da Fura-2AM, conforme descrito na etapa 2.4.
5. Desligue ou minimize as luzes da sala para reduzir o fotobranqueamento por fluorescência e otimizar o sinal de fluorescência. Remova a placa de 6 poços da incubadora e, em seguida, lave o CS por 10 s em cada um dos três poços contendo apenas o meio. Transfira o CS para um pequeno barco de pesagem contendo meios pré-aquecidos (sem adição de Fura-2AM).
6. Monte o CS na câmara CS recém-lubrificada depois de limpar suavemente a parte inferior do CS. Adicione suavemente uma gota de mídia ao CS e, em seguida, monte a montagem do eletrodo sobre o CS, seguido por um segundo CS e a montagem superior. Use parafusos de cabeça de panela #0 para terminar de montar a câmara celular, conforme descrito nas etapas 2.6.-2.7.
7. Conecte a tubulação da bomba cheia de mídia ao pré-aquecedor, conecte o pré-aquecedor à câmara CS e coloque em um adaptador de palco, conforme descrito na etapa 2.8. Recolher o meio com o sistema de tubos de vácuo e ligar o sistema de aquecimento (Figura suplementar 2A,D-7) para equilibrar a câmara a 37°C, conforme descrito nos passos 2.8.-2.9.
8. Ative o estimulador de estimulação (Figura suplementar 2B-13) ajustado para 35-40 V e 0,2 Hz, conforme descrito na etapa 2.10.
9. Antes de gravar um transiente Ca²⁺ , ligue uma pequena lanterna ou um booklight montado perto do teclado do computador para ajudar a ver o teclado. Além disso, registre o fundo de fluorescência em uma área sem miócitos cardíacos. Para iniciar, selecione Arquivo > Iniciar > Novo, conforme descrito na etapa 2.12.
10. Selecione um ROI e defina uma guia (ou barra de rastreamento, lado esquerdo) para o numerador bruto e uma segunda guia para o denominador bruto, definido no centro superior de cada guia. Registre o plano de fundo por 10-20 s. Clique com o botão direito do mouse e arraste sobre um painel da barra de rastreamento para obter os valores brutos do numerador e do denominador com média de sinal. Insira esses valores selecionando as Constantes de > de Operações e insira os valores brutos.
11. Prepare um novo modelo de tela para coletar transientes de encurtamento e Ca² +. Para o comprimento do sarcômero, selecione a guia 1 e use o mesmo processo descrito na etapa 2.13. Para imagens Ca² +, selecione Tab 2 > Ratio (centro superior da guia) > Rastreamentos > Editar Limites de Usuário para definir os níveis mínimo e máximo para a proporção, que normalmente são definidos entre 1 e 5. Use o mesmo processo para definir os intervalos de numerador e denominador para as guias 3 e 4 (lado esquerdo).
12. Posicione uma caixa de ROI sobre uma imagem de miócitos, conforme descrito na etapa 2.14. Selecione Arquivo > Nova > Coletar. Agora selecione Iniciar para coletar dados Ca²⁺ de encurtamento e ratiometric. Registre ≥7 contrações/célula para análise da média de sinal.
13. Repita a gravação de rastreamento em segundo plano descrita na etapa 4.10. após o registro de 2-4 miócitos. Normalmente, registre 4-5 miócitos / CS ou menos miócitos se houver alterações significativas na leitura de fundo.

5. Análise dos dados de transientes de Ca²⁺ em miócitos isolados.

1. Abra o arquivo desejado para análise e selecione Modelos > Modelo de tela para encurtamento mais transientes Ca² +. Em seguida, selecione as guias 1 e 2 (à esquerda) para mostrar o comprimento do sarcômero e a proporção Ca² +, respectivamente. Selecione Constantes de > de Operações e insira os valores do numerador e do denominador do rastreamento de plano de fundo Ca² +.
2. Prepare modelos de análise para encurtamento mais dados^{transitórios} Ca 2+. Selecione a guia 1 (lado esquerdo) e use o mesmo processo descrito na etapa 3.2. para definir o modelo de análise de comprimento do sarcômero.
3. Selecione a guia 2 (lado esquerdo) e selecione Operações, Opções de Análise Transiente Monotônica, Marca de evento TTL na caixa Definição de t0 e as seguintes opções no menu: Linha de base (razão basal), Velocidade de saída em relação a t0 (dep v), Pico (altura do pico e %altura do pico/linha de base ou bl%pico h), Velocidade de decaimento em relação ao tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) usando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) usando tPeak. Salve essas opções de análise selecionando Modelos e Salvar Modelo de Análise usando um novo nome de identificador. Carregue esse modelo de análise antes de analisar cada rastreamento.
4. Use o mesmo processo descrito nas etapas 3.3.-3.6. para calcular a média do sinal e, em seguida, analisar o comprimento do sarcômero, seguido pelos mesmos passos para os transientes Ca² +. Defina marcas separadas para o comprimento do sarcômero e para o traço da razão transitória Ca² +.

Results

Estudos de função contrátil são realizados em miócitos de ratos a partir do dia seguinte ao isolamento (dia 2) até 4 dias após o isolamento. Embora os miócitos possam ser registrados no dia seguinte ao isolamento (ou seja, dia 2), tempos de cultura mais longos são frequentemente necessários após a transferência gênica ou tratamentos para modificar a função contrátil⁸. Para miócitos cultivados por mais de 18 h após o isolamento, o protocolo de estimulação descrito na seção 1 ajuda a manter os túbul...

Discussion

O protocolo de estimulação crônica descrito na etapa 1 estende o tempo útil para estudar miócitos isolados e avaliar o impacto de tratamentos mais longos. Em nosso laboratório, resultados consistentes foram obtidos até 4 dias após o isolamento ao medir a função contrátil usando o comprimento do sarcômero em miócitos cronicamente cadenciados. No entanto, a função contrátil dos miócitos se deteriora rapidamente ao usar meios com mais de 1 semana para acelerar os miócitos.

Para estudos de função ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MÉDIA
Albumina sérica bovina	Sigma (Roche)	3117057001	Concentração final = 0,2% (p/v)
Glutationa	Sigma	G-6529	Concentração final = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Concentração final = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 frasco rende 1 L; pH 7,45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Concentração final = 4 mM
Penicilina/estreptomicina	Fisher	15140122	Concentração final = 100 U/mL de penicilina, 100 μ g/mL de estreptomicina
REAGENTES ESPECÍFICOS PARA Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Sondas Moleculares)	F1221	50 μ g/frasco;   Prepare a solução estoque de 1 mM Fura-2AM + 0,5 M de probenicida em DMSO;   A concentração final de Fura2-AM em meios é  5 μ M
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Adicione 7,2 mg de probenicida (0,5 M) a 1 mM de estoque Fura-2AM; A concentração final na mídia é de 2,5
mMMATERIAIS PARA ESTIMULAÇÃO DE MIÓCITOS DE RATOS
#1 22  mm2 lamínulas de vidro	Corning	2845-22
Cabos de 3 x 36 polegadas com conectores banana Pomona	Electronics	B-36-2	Figura Suplementar 1, painel C
Incubadora 37oC  com 95% de O2:5% de CO2	Forma	3110	Suplementar Figura 1, painel E.  Vários modelos são apropriados
Gabinete de biossegurança Classe II A/B3 com lâmpada UV	Forma	1286	Vários modelos são apropriados
Fórceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Esterilizador de esferas quentes	Fine Science Tools	1800-45
Microscópio invertido de baixa ampliação	Leica	DM-IL	Posicione este microscópio adjacente à incubadora para monitorar a contração dos miócitos estimulados no início da estimulação e após as mudanças de mídia; Objetivas 4X e 10X recomendadas
Câmara de estimulação	Suplementar personalizado		Figura 1, painel A. O sistema Ionoptix C-pace é uma alternativa disponível comercialmente ou consulte 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Suplementar Figura 1, painel D.
MATERIAIS PARA FUNÇÃO CONTRÁTIL e/ou Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID na Figura Suplementar 2 & Alternativas/Opções Recomendadas
Componentes adicionais para análise de imagem Ca2+	Ionoptix	: -- Sistema de contagem de fótons                      --  Fonte de alimentação Xenon com fonte de luz de excitação dupla                      --  Interface de fluorescência	- O sistema de contagem de fótons contém um tubo fotomultiplicador (PMT) e um espelho dicróico e é instalado adjacente à câmera CCD. (painel A #4).                                                                                                                                          - A fonte de alimentação para a fonte de luz da lâmpada de xenônio (consulte o painel A #5 e o painel C, à esquerda) é integrada a uma interface de excitação dupla (excitação de 340/380 nm e emissão de 510 nm) mostrada no painel A #6.                                                                                                                                                                                                                                                               - A interface de fluorescência entre o computador e  a fonte de luz é mostrada no painel B, #12.
Câmera CCD com aquisição de imagem  hardware e software (240 quadros/s)	Ionoptix	Myocam com controlador CCD	O controlador Myocam e CCD são mostrados na Fig. 2 suplementar, painel A #4  e  painel A #5 & painel C #5 (direita), respectivamente.  O controlador é integrado a um sistema de computador PC (painel B #14).
Estimulador de câmara	Ionoptix	Painel B do Myopacer	, #13; Alternativa:  Câmara de
perfusão montada em lamínula	Câmara personalizada para lamínula de 22 mm2 com adaptador de silicone e 2-4 parafusos Phillips de cabeça cilíndrica #0  (seta, painel F)		Painel A #10 e painel F;     A temperatura da câmara é calibrada para 37oC usando uma sonda TH-10Km e o controlador de temperatura TC2BIP (ver controlador de temperatura).  Alternativas comerciais:  Ionoptix FHD ou célula C-stim Câmaras; Sistema de estimulação de cultura Cell MicroControls
Computador e software dedicados para coleta de dados e análise de transientes de função/Ca2+	PC Ionoptix	com placa de PC Ionwizard e software	Painel B, #14; A função contrátil é medida usando os módulos de aquisição SarcLen (comprimento do sarcômero) ou SoftEdge (comprimento do miócito) do software IonWizard. O software Ionwizard também inclui o software de aquisição PMT para raciométrica  Imagem Ca2+ em mioyctes carregados com Fura-2AM. - Um gabinete eletrônico de montagem em rack de 4 postes e prateleiras são recomendados para abrigar o somputer e o estimulador celular.  A interface de fluorescência para imagens de Ca2+ também está alojada neste gabinete (veja abaixo).
Fórceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Painel F
Suporte de tubo isolado para mídia	Painel personalizado		A #9; Este suporte é facilmente montado usando isopor e um pacote de gel pré-aquecido para manter a mídia aquecida
Microscópio de campo claro invertido	Nikon	TE-2000S	Instale uma torre rotativa para epifluorescência (Painel A #2) para imagens de Ca2+. Um filtro condensador vermelho escuro (590 nm) também é recomendado para minimizar o branqueamento por fluorescência durante a imagem de Ca2+.
Mesa Isoladora	Controle de Vibração TMC	30 x 36 polegadas	Painel A, #1; Desejável:  prateleiras elevadas, blindagem Faraday
Oculares e objetiva de microscópio	Nikon	10X CFI oculares 40X água CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objetiva:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  Um aquecedor de objetiva Cell MicroControls HLS-1 é montado ao redor da objetiva (veja o controlador de temperatura abaixo).                  NOTA:  Dispensadores de imersão em água também estão agora disponíveis para objetivas à base de água.
Bomba peristáltica	Gilson	Minipuls 3	Painel A #8 e painel E
pequeno barco de pesagem	Fisher	08-732-112
Controlador de temperatura	Cell MicroControls	TC2BIP	Painel A #7; Painel D. Este controlador de temperatura aquece a câmara de lamínula a 37oC.      Um pré-aquecedor e um aquecedor de objetiva são recomendados para esta plataforma.  A Cell MicroControls HPRE2 pré-aquecedor e  HLS-1 são controlados  pelo controlador de temperatura TC2BIP para nossos estudos.
Luz LED sob o armário com sensor de movimento	Luz LED Sylvania	#72423	Recomendado para coleta de dados durante Ca2+ imagens transitórias sob luz mínima da sala..   Alternativa:  Um clipe na lanterna / luz do livro com pescoço flexível - vários fornecedores estão disponíveis.
Linha de vácuo com frasco Ehrlenmeyer em linha e filtro de proteção	Tubulação Fisher	Tygon - E363;   frasco Ehrlenmeyer em polipropileno - 10-182-50B; Filtro de vácuo - 09-703-90	Painel A #11