Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca²⁺ em miócitos de roedores

A análise da função da bomba cardíaca geralmente requer uma série de abordagens para obter uma visão adequada, especialmente para modelos animais de insuficiência cardíaca (IC). A ecocardiografia ou as medidas hemodinâmicas fornecem informações sobre a disfunção cardíaca in vivo ¹, enquanto abordagens in vitro são frequentemente empregadas para identificar se a disfunção surge de alterações no miofilamento e/ou no transiente Ca²⁺ responsável pela excitação do acoplamento, ou o potencial de ação, com função contrátil (por exemplo, acoplamento excitação-contração [E-C]). As abordagens in vitro também oferecem uma oportunidade para rastrear a resposta funcional a neurohormônios, alterações genéticas induzidas por vetores, bem como potenciais agentes terapêuticos² antes de buscar estratégias de tratamento in vivo dispendiosas e/ou trabalhosas.

Várias abordagens estão disponíveis para investigar a função contrátil in vitro, incluindo medidas de força em trabéculas³ intactas ou miócitos permeabilizados⁴, bem como encurtamento descarregado e transientes de Ca²⁺ em miócitos intactos na presença e ausência de IC ^5,6. Cada uma dessas abordagens tem como foco a função contrátil dos miócitos cardíacos, que é diretamente responsável pela função da bomba cardíaca ^2,7. No entanto, a análise da contração e do acoplamento E-C é mais frequentemente realizada medindo o encurtamento do comprimento muscular e os transientes de Ca 2+ em miócitos adultos isolados e tolerantes a Ca²⁺. O laboratório utiliza um protocolo detalhado publicado para isolar miócitos de corações de ratos para esta etapa⁸.

Tanto o transiente de Ca²⁺ quanto os miofilamentos contribuem para o encurtamento e realongamento dos miócitos intactos e podem contribuir para a disfunção contrátil ^2,7. Assim, esta abordagem é recomendada quando a análise funcional in vitro requer um miócito intacto contendo a maquinaria de ciclagem Ca²⁺ mais os miofilamentos. Por exemplo, miócitos isolados intactos são desejáveis para o estudo da função contrátil após a modificação do miofilamento ou da função de ciclagem de Ca²⁺ via transferência gênica⁹. Além disso, uma abordagem de miócitos intactos é sugerida para analisar o impacto funcional dos neurohormônios ao estudar o impacto das vias de sinalização do segundo mensageiro a jusante e/ou a resposta a agentes terapêuticos². Uma medida alternativa da força dependente da carga em miócitos únicos é mais frequentemente realizada após a permeabilização da membrana (ou esfolamento) a baixas temperaturas (≤15 °C) para remover a contribuição transitória de Ca²⁺ e focar na função miofilamentar¹⁰. A medida da força dependente da carga mais transientes de Ca²⁺ em miócitos intactos é rara devido em grande parte ao desafio complexo e técnico da abordagem¹¹, especialmente quando é necessário maior rendimento, como para medir as respostas à sinalização neurohormonal ou como uma tela para agentes terapêuticos. A análise das trabéculas cardíacas supera esses desafios técnicos, mas também pode ser influenciada por não miócitos, fibrose e/ou remodelamento da matriz extracelular². Cada uma das abordagens descritas acima requer uma preparação contendo miócitos adultos porque os miócitos neonatais e miócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzíveis (iPSCs) ainda não expressam o complemento completo de proteínas de miofilamento adulto e geralmente não possuem o nível de organização de miofilamentos presente no miócito adulto em forma de bastonete². Até o momento, evidências em iPSCs indicam que a transição completa para isoformas adultas excede mais de 134 dias em cultura¹².

Dado o foco desta coleção na IC, os protocolos incluem abordagens e análises para diferenciar a função contrátil em miócitos intactos com falha versus não falha. Exemplos representativos são fornecidos a partir de miócitos de ratos estudados 18-20 semanas após uma coarctação suprarrenal, descrita anteriormente ^5,13. Comparações são então feitas com miócitos de ratos tratados com simulação.

O protocolo e a plataforma de imagem aqui descritos são utilizados para analisar e monitorar alterações no encurtamento e transientes de Ca²⁺ em miócitos cardíacos em forma de bastonete durante o desenvolvimento de IC. Para esta análise, miócitos em forma de bastonete tolerantes a 2 x 10 4⁴ Ca²+ são banhados em coberturas de vidro revestidas de laminina (CSs)^{de 22 mm 2} mm e cultivados durante a noite, conforme descrito anteriormente⁸. Os componentes montados para esta plataforma de imagem, juntamente com os meios e buffers usados para imagens ideais, são fornecidos na Tabela de Materiais. Um guia para análise de dados usando um software e os resultados representativos também são fornecidos aqui. O protocolo geral é dividido em subseções separadas, com as três primeiras seções se concentrando em miócitos isolados de ratos e análise de dados, seguidas por experimentos transitórios celulares de Ca²⁺ e análise de dados em miócitos.

Os estudos realizados em roedores seguiram a Política do Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanitários e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Para este estudo, os miócitos foram isolados de ratos Sprague-Dawley e F344BN de 3-34 meses de idade, pesando ≥ 200 g⁵. Foram utilizadas as taxas masculinas e femininas.

1. Estimulação miocitária para estudos da função contrátil

1. Faça meios frescos à base de M199 para cada conjunto de miócitos isolados (Tabela de Materiais). 1 dia antes da marcha, placa 2 x 10⁴ Ca 2+ tolerantes a miócitos em forma de bastonete em²² mm² lâminas de vidro revestidas de laminina (CSs), conforme descrito anteriormente⁸.
2. Para preparar as câmaras, mergulhe cada câmara em 10% de água sanitária por 1 h. Em seguida, lave as câmaras com água corrente da torneira por 30-45 min, seguida de água destilada substituída a cada 5 min por 30 min, seguida de água deionizada substituída a cada 5 min por 30 min e um enxágue final em água deionizada.
3. Secar as câmaras em uma superfície limpa por 20-30 min (Figura suplementar 1A-C). Em seguida, os UV tratam as câmaras em um armário de biossegurança por 5 min em cada direção (total = 20 min). Esta etapa não é necessária para câmaras pré-esterilizadas.
   CUIDADO: Deixe a área para minimizar a exposição aos raios UV.
4. Remova a tampa da câmara, adicione 3 mL de meio à base de M199 (ver Tabela de Materiais) a cada poço (Figura suplementar 1B), substitua a tampa e pré-aqueça a câmara em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO 2 e 20% de O₂.
5. Esterilizar fórceps em um esterilizador de contas quentes a 250 °C por 20-25 s. Transfira a câmara de estimulação pré-aquecida da incubadora para um gabinete de biossegurança.
6. Transfira cada coverslip (CS) contendo miócitos cardíacos para poços individuais na câmara de estimulação usando pinça estéril. Transfira CSs quatro de cada vez, seguido de aquecimento por 10 minutos antes da transferência dos quatro CSs restantes para manter a temperatura do meio.
7. Anexar macacos de banana à câmara de estimulação em uma extremidade (Figura suplementar 1C) e ao estimulador na outra extremidade (Figura suplementar 1D).
8. Defina a frequência do estimulador para 0,2 Hz e defina a tensão (~ 12 V) para alcançar a contração em ~10%-20% de todos os miócitos cardíacos em forma de bastonete dentro de um poço. Para determinar o número de miócitos em contração, coloque a câmara sob um microscópio invertido com ampliação de 4x a 10x.
9. Colocar a câmara de estimulação numa incubadora a 37 °C a 5% de CO₂ (Figura suplementar 1E). Troque o meio a cada 12 h usando o meio pré-aquecido em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ por 20-25 min. Continue a estimulação elétrica por até 3 dias com a mídia trocada a cada 12 h.

2. Análise da função contrátil de miócitos cardíacos de ratos adultos

1. Pré-aqueça uma embalagem de gel e um meio em uma incubadora de 37 °C por 30 minutos antes do experimento.
2. Ligue os componentes da plataforma de função contrátil listados na Tabela de Materiais e mostrados na Figura Suplementar 2, com especial atenção aos componentes-chave, que incluem uma tabela antivibração (Figura Suplementar 2A-1) com um microscópio invertido com um filtro vermelho profundo (590 nm) (Figura Suplementar 2A-2,3) e uma câmera CCD (Figura Suplementar 2A-4) conectada a um controlador CCD (Figura suplementar 2A-5 e Figura suplementar 2C-5) e integrada com um computador PC (Figura suplementar 2B-14).
3. Montar a tubulação na bomba peristáltica (Figura suplementar 2A-8; Figura suplementar 2A-8), transfira o pacote de gel pré-aquecido para o suporte do tubo (Figura suplementar 2A-9) e ligue o vácuo (Figura suplementar 2A-11) e a alimentação para o estimulador celular (Figura suplementar 2B-13).
4. Colocar um tubo de 50 mL com meio no suporte do tubo isolado (Figura suplementar 2A-9) e iniciar a perfusão a ~0,5 mL/min através do tubo da bomba peristáltica (Figura suplementar 2E-8).
5. Adicione uma pequena quantidade de meio pré-aquecido a um pequeno barco de pesagem (~ 2 mL). Transfira um CS contendo miócitos da câmara de estimulação para o barco de pesagem. Devolver a câmara de estimulação a 37 °C na incubadora de CO₂ a 5%.
6. Remova o CS do barco de pesagem e limpe suavemente a parte inferior. Transfira o CS para uma câmara CS recém-lubrificada (Figura suplementar 2A, F-10; seta preta) e adicione suavemente uma gota de mídia (~200 μL) ao CS.
7. Coloque um suporte de eletrodo de platina sobre o CS (Figura suplementar 2F; seta cinza) e coloque um novo CS por cima usando pinças. Coloque uma montagem superior (Figura 2F suplementar; seta branca) sobre o sanduíche CS e, em seguida, instale dois ou quatro parafusos de cabeça de panela #0 para terminar de montar a câmara.
8. Uma vez que o meio esteja presente em toda a tubulação da bomba, prenda a tubulação ao pré-aquecedor e, em seguida, conecte o pré-aquecedor à câmara CS montada na etapa 2.7. Comece a perfusão a 0,5 mL/min e coloque um lenço de papel abaixo da câmara para se certificar de que não há vazamentos.
9. Coloque a câmara CS no adaptador de palco. O meio perfundido é coletado na extremidade oposta da câmara com tubos conectados a um sistema de vácuo. Ligue o sistema de aquecimento (Figura suplementar 2A, D-7) e equilibre a câmara, a objetiva e o pré-aquecedor por ~5-10 min para atingir uma temperatura constante do meio de 37 °C. Visualize miócitos com a objetiva de imersão em água de 40x no microscópio durante esse tempo de equilíbrio.
10. Ative o estimulador de estimulação (Figura suplementar 2B-13) ajustando a tensão para 1,5x a configuração necessária para que 80% das células em forma de bastonete se contraiam, o que normalmente é de 35-40 V. Defina a frequência de estimulação para 0,2 Hz para otimizar a função contrátil e a sobrevivência dos miócitos.
11. Colete traços contráteis de encurtamento e realongamento de miócitos continuamente perfundidos e cadenciados. Para coletar medições de encurtamento, use uma câmera CCD (Figura suplementar 2A-4) conectada a um controlador CCD (Figura suplementar 2B-5,C) e um computador dedicado com uma placa controladora de E/S (Figura suplementar 2B-14; consulte Tabela de materiais). A plataforma mede o encurtamento do sarcômero em miócitos de ratos, embora resultados semelhantes sejam obtidos a partir de medições de miócitos coletadas das bordas longitudinais dos miócitos (ver Ecklerle et ^al.14).
12. Para coletar rastreamentos de encurtamento de sarcômero, abra o software no computador, selecione OK e Arquivo > Novo. Prepare um modelo de tela selecionando Rastreamentos > Editar Limites de Usuário > Comprimento do Sarcomere e, em seguida, definindo valores máximos e mínimos, que normalmente estão entre 2,0 μm e 1,5 μm. Calibrar a câmera CCD com uma gráticula de 0,01 mm antes de fazer medições nos miócitos (Figura 1D).
13. Para registrar rastreamentos de comprimento de sarcômero, selecione Arquivo > Novo. Identifique um miócito em contração e posicione-o ao longo do eixo longitudinal da câmera de modo que o padrão de estriação seja vertical (Figura 1B).
14. Use o mouse do computador para colocar a caixa da região de interesse (ROI) (caixa rosa) sobre o miócito (Figura 1C). Selecione Coletar e Iniciar para registrar a função contrátil. Recorde de encurtamento por 60 s de cada miócito em baixas frequências de estimulação (≤0,5 Hz).
15. Registre o encurtamento do sarcômero de 5-10 células por CS. Realize medições em 1 célula/CS se os estudos incluírem tratamento com agonistas/antagonistas. Prepare um meio pré-aquecido separado e uma peça de tubo de perfusão diferente e dedicada carregada em uma bomba peristáltica multicanal e siga as etapas 2.9.-2.14. para medir o impacto da administração de drogas ou neuro-hormônios na função contrátil dos miócitos.
16. Para medir o encurtamento em uma faixa de frequências, acelere os miócitos em cada frequência para obter o encurtamento em estado estacionário antes do registro⁵. Para esses estudos, dobre a taxa de perfusão e comece a gravar 15-20 s após a estimulação em uma nova frequência para obter respostas contráteis consistentes no estado estacionário para frequências na faixa de 0,2 Hz e 2 Hz. Normalmente, registre não mais do que 2 miócitos / CS para encurtamento em toda a faixa dada de frequências de estimulação.
17. Registre pelo menos 7 contrações/célula para obter dados confiáveis de média de sinal ao analisar as gravações (consulte a etapa 3).

3. Análise dos dados da função contrátil em miócitos isolados

1. Para começar, selecione Arquivo, escolha um rastreamento gravado e selecione Abrir. Selecione Tab 1 (lado esquerdo) do rastreamento base e defina o painel amarelo na parte superior do rastreamento como Sarc-Length. Selecione Rastreamentos e o modelo de tela preparado na etapa 2.12.
2. Para preparar um modelo de análise, selecione Operações, Opções de Análise Transiente Monotônica, Marca de Evento TTL na caixa Definição de t0, bem como as seguintes opções no menu: Linha de base (comprimento do sarcômero em repouso), Velocidade de partida em relação a t0 (dep v), Pico (altura do pico e %altura do pico/linha de base ou bl%pico h), Velocidade de retorno relativa ao tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) usando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) usando tPeak. Salve essas opções de análise selecionando Modelos > Salvar modelo de análise com um identificador. Carregue esse modelo de análise antes de analisar cada rastreamento.
3. Para iniciar a análise de dados, selecione Marcas > Porta > Adicionar > Transitória Converter da Marca de Evento > Intervalo de Análise. Agora defina o intervalo de tempo de -0,01 s a 1,20 s para miócitos com ritmo de 0,2 Hz (Figura 2A, marcas vermelhas na porção inferior do traço bruto). Selecione um intervalo de tempo mais curto para miócitos estimulados em frequências mais altas.
4. Produza um rastreamento com média de sinal selecionando Operações > Eventos Médios. Uma gravação com média de sinal aparece abaixo do rastreamento de base original.
5. Selecione a guia 1 do rastreamento com média de sinal (lado esquerdo da tela) e selecione Marcas no menu superior, seguido de Adicionar transitório. Selecione Operações no menu superior e Análise Transiente Monotônica para exibir os valores médios de sinal para comprimento de sarcômero de linha de base, altura de pico, bl%pico h, dep v, ret v, TTP 50% e TTR_50% no painel de exibição com média de sinal.
6. Transfira cada análise transitória de sarcômero para uma planilha para a análise composta de miócitos múltiplos selecionando Exportar > Análise Transiente Monotônica > Corrente da Área de Transferência. Cole esses dados na planilha para cada rastreamento.
7. Para copiar o rastreamento com média de sinal, selecione Exportar > Opções da Área de Transferência > Área >de Transferência Atual e defina as casas decimais como 5, selecione Delimitador de Tabulações e clique em OK e OK. Cole os traços médios de sinal para cada registro de miócitos em uma segunda planilha.

4. Registo de transientes de Ca²⁺ em miócitos cardíacos adultos de ratos

1. Antes de medir os transientes de Ca 2+, ligue os componentes da plataforma descritos na etapa 2.2., juntamente com componentes adicionais de imagem de fluorescência (consulte componentes adicionais para análise de imagem de Ca²⁺ na Tabela de Materiais; Figura suplementar 2A-5,6; 2B-12).
2. Preparar a solução-mãe de Fura-2AM contendo 1 mM de Fura-2AM mais probenecida 0,5 M em dimetilsulfóxido (DMSO). A probenecida minimiza o vazamento de Fura-2AM¹⁵.
3. Diluir a solução-mãe a 5 μM de Fura-2AM e 2,5 mM de probenecida em 2,5 ml de meio (ver Tabela de Materiais) num poço de uma placa de 6 potes. Adicione apenas 2,5 mL de meio (sem Fura-2AM) a três poços adicionais na placa, cubra a placa com papel alumínio e pré-aqueça o meio a 37 °C.
4. Transfira um CS contendo miócitos da câmara de estimulação para o poço contendo Fura-2AM, cubra e devolva a placa à incubadora de 37 °C com 5% de CO₂ por 4 min. Montar a tubulação na bomba de perfusão e perfundir com o meio durante o período de carregamento da Fura-2AM, conforme descrito na etapa 2.4.
5. Desligue ou minimize as luzes da sala para reduzir o fotobranqueamento por fluorescência e otimizar o sinal de fluorescência. Remova a placa de 6 poços da incubadora e, em seguida, lave o CS por 10 s em cada um dos três poços contendo apenas o meio. Transfira o CS para um pequeno barco de pesagem contendo meios pré-aquecidos (sem adição de Fura-2AM).
6. Monte o CS na câmara CS recém-lubrificada depois de limpar suavemente a parte inferior do CS. Adicione suavemente uma gota de mídia ao CS e, em seguida, monte a montagem do eletrodo sobre o CS, seguido por um segundo CS e a montagem superior. Use parafusos de cabeça de panela #0 para terminar de montar a câmara celular, conforme descrito nas etapas 2.6.-2.7.
7. Conecte a tubulação da bomba cheia de mídia ao pré-aquecedor, conecte o pré-aquecedor à câmara CS e coloque em um adaptador de palco, conforme descrito na etapa 2.8. Recolher o meio com o sistema de tubos de vácuo e ligar o sistema de aquecimento (Figura suplementar 2A,D-7) para equilibrar a câmara a 37°C, conforme descrito nos passos 2.8.-2.9.
8. Ative o estimulador de estimulação (Figura suplementar 2B-13) ajustado para 35-40 V e 0,2 Hz, conforme descrito na etapa 2.10.
9. Antes de gravar um transiente Ca²⁺ , ligue uma pequena lanterna ou um booklight montado perto do teclado do computador para ajudar a ver o teclado. Além disso, registre o fundo de fluorescência em uma área sem miócitos cardíacos. Para iniciar, selecione Arquivo > Iniciar > Novo, conforme descrito na etapa 2.12.
10. Selecione um ROI e defina uma guia (ou barra de rastreamento, lado esquerdo) para o numerador bruto e uma segunda guia para o denominador bruto, definido no centro superior de cada guia. Registre o plano de fundo por 10-20 s. Clique com o botão direito do mouse e arraste sobre um painel da barra de rastreamento para obter os valores brutos do numerador e do denominador com média de sinal. Insira esses valores selecionando as Constantes de > de Operações e insira os valores brutos.
11. Prepare um novo modelo de tela para coletar transientes de encurtamento e Ca² +. Para o comprimento do sarcômero, selecione a guia 1 e use o mesmo processo descrito na etapa 2.13. Para imagens Ca² +, selecione Tab 2 > Ratio (centro superior da guia) > Rastreamentos > Editar Limites de Usuário para definir os níveis mínimo e máximo para a proporção, que normalmente são definidos entre 1 e 5. Use o mesmo processo para definir os intervalos de numerador e denominador para as guias 3 e 4 (lado esquerdo).
12. Posicione uma caixa de ROI sobre uma imagem de miócitos, conforme descrito na etapa 2.14. Selecione Arquivo > Nova > Coletar. Agora selecione Iniciar para coletar dados Ca²⁺ de encurtamento e ratiometric. Registre ≥7 contrações/célula para análise da média de sinal.
13. Repita a gravação de rastreamento em segundo plano descrita na etapa 4.10. após o registro de 2-4 miócitos. Normalmente, registre 4-5 miócitos / CS ou menos miócitos se houver alterações significativas na leitura de fundo.

5. Análise dos dados de transientes de Ca²⁺ em miócitos isolados.

1. Abra o arquivo desejado para análise e selecione Modelos > Modelo de tela para encurtamento mais transientes Ca² +. Em seguida, selecione as guias 1 e 2 (à esquerda) para mostrar o comprimento do sarcômero e a proporção Ca² +, respectivamente. Selecione Constantes de > de Operações e insira os valores do numerador e do denominador do rastreamento de plano de fundo Ca² +.
2. Prepare modelos de análise para encurtamento mais dados^{transitórios} Ca 2+. Selecione a guia 1 (lado esquerdo) e use o mesmo processo descrito na etapa 3.2. para definir o modelo de análise de comprimento do sarcômero.
3. Selecione a guia 2 (lado esquerdo) e selecione Operações, Opções de Análise Transiente Monotônica, Marca de evento TTL na caixa Definição de t0 e as seguintes opções no menu: Linha de base (razão basal), Velocidade de saída em relação a t0 (dep v), Pico (altura do pico e %altura do pico/linha de base ou bl%pico h), Velocidade de decaimento em relação ao tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) usando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) usando tPeak. Salve essas opções de análise selecionando Modelos e Salvar Modelo de Análise usando um novo nome de identificador. Carregue esse modelo de análise antes de analisar cada rastreamento.
4. Use o mesmo processo descrito nas etapas 3.3.-3.6. para calcular a média do sinal e, em seguida, analisar o comprimento do sarcômero, seguido pelos mesmos passos para os transientes Ca² +. Defina marcas separadas para o comprimento do sarcômero e para o traço da razão transitória Ca² +.

Estudos de função contrátil são realizados em miócitos de ratos a partir do dia seguinte ao isolamento (dia 2) até 4 dias após o isolamento. Embora os miócitos possam ser registrados no dia seguinte ao isolamento (ou seja, dia 2), tempos de cultura mais longos são frequentemente necessários após a transferência gênica ou tratamentos para modificar a função contrátil8. Para miócitos cultivados por mais de 18 h após o isolamento, o protocolo de estimulação descrito na seção 1 ajuda a manter os túbulos t e resultados consistentes de encurtamento e realongamento.

Uma porção representativa de um CS contendo miócitos para estudos de encurtamento é mostrada na Figura 1A, juntamente com um miócito adequadamente posicionado antes de definir o ROI (Figura 1B). Uma vez que um ROI é identificado (Figura 1C; caixa rosa), as informações do algoritmo mostradas abaixo do miócito também ajudam a otimizar o posicionamento dos miócitos antes do registro. Especificamente, a densidade óptica linear (LOD; linha preta) é um indicador para o número e espaçamento dos sarcômeros, e um espectro de potência nítido no traço rápido da transformada de Fourier (FFT, linha vermelha) ajuda a alcançar o alinhamento ideal para o registro de encurtamento e realongamento. O padrão de gratícula usado para a calibração do comprimento do sarcômero (e detecção de borda) é mostrado na Figura 1D. Um registro alinhado típico do encurtamento do comprimento do sarcômero é mostrado na Figura 2A (painel superior), juntamente com a análise da média de sinal descrita na seção 3 (painel inferior).

A disfunção é frequentemente detectada em miócitos quando há disfunção in vivo em modelos animais. Por exemplo, a disfunção sistólica observada pela ecocardiografia em resposta à sobrecarga pressórica (PO)13 também é detectada em estudos de encurtamento demiócitos5. Para ilustrar os traços dos dados, são mostrados traços representativos brutos (Figura 2; painel superior) e médios de sinal (Figura 2; painel inferior) obtidos a 0,2 Hz para miócitos de ratos sham- (Figura 2A) e tratados com PO (Figura 2B). Para testar se a função dos miócitos poderia ser resgatada após a PO, a transferência gênica mediada por vírus no momento do isolamento de miócitos também foi usada para substituir a troponina cardíaca endógena I (cTnI) por uma substituição fosfo-mimética de cTnI T144D (T144D) no sarcômero16. A análise inicial mostra que a redução da função contrátil induzida pelo PO (Tabela 1, painel superior) retornou aos níveis simulados nos miócitos PO 4 dias após a transferência gênica de cTnIT144D (Tabela 1; painel inferior).

Esta plataforma também pode ser usada para medir transientes de Ca2+, juntamente com o encurtamento em miócitos isolados. O encurtamento e o Ca 2+ não foram registrados após o PO, pois o PO reduz a aderência dos miócitos de ratos à laminina13, e um modelo comparável mostrou anteriormente que o manuseio alterado do Ca2+ se desenvolve em um ponto de tempo semelhante17. Em vez disso, experimentos representativos foram realizados em miócitos carregados de Fura-2AM isolados de ratos de 2-3 meses de idade. Um registro representativo e traços médios de sinal são mostrados na Figura 3, juntamente com a análise dos dados na Tabela 2. Para este conjunto de experimentos, miócitos isolados de ratos adultos foram estudados 4 dias após a transferência gênica mediada por adenovírus (multiplicidade de infecção = 100) de cTnIT144D ou cTnI do tipo selvagem. Tanto o encurtamento do sarcômero quanto os transientes de Ca 2+ foram medidos após a carga de miócitos comFura-2AM. A transferência gênica de cTnIT144D aumentou o encurtamento do pico e os níveis elevados de Ca2+ diastólico em comparação com cTnI nesses estudos iniciais (Tabela 2). Embora seja necessária uma análise mais extensa, os resultados iniciais sugerem que a substituição in vivo por cTnIT144D poderia produzir um fenótipo cardíaco complexo devido a mudanças na função contrátil e no manuseio do Ca2+ ao longo do tempo.

Figura 1: Miócitos cardíacos de ratos adultos utilizados para estudos funcionais. (A) Miócitos cardíacos isolados representativos de um rato adulto (barra de escala = 50 μm). A seta aponta para um miócito representativo fotografado para análise da função contrátil. (B) Miócito representativo com ROI (rosa) localizado na lateral (barra de escala = 20 μm). (C) Miócito representativo com ROI (painel superior), o padrão sarcômero para este miócito (painel inferior, azul; barra de escala = 20 μm) e o pico acentuado do espectro de potência (painel inferior, vermelho). (D) Captura de tela de gratícula de 0,01 mm para calibrar as medidas de encurtamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Registos representativos de miócitos de ratos. Um traço de gravação bruta (painel superior) e de média de sinal (painel inferior) registrado a 0,2 Hz em miócitos de ratos tratados com (A) sham e (B) sobrecarga de pressão (PO). Os miócitos foram isolados 18-20 semanas após a cirurgia, com PO produzido por coarctação suprarrenal13. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Registro e análise representativos do comprimento do sarcômero (SL) e dos transientes Ca 2+ de miócitos cardíacos adultos carregados de Fura-2AM. (A) Traços brutos para SL, razão transitória (razão) Ca 2+ e os traços do numerador e denominador usados para produzir a razão transitória Ca2+. (B) Um exemplo de traços médios de sinal para SL (traço superior) e a razão transitória Ca2+ (traço inferior). (C) Os traços são analisados quanto ao comprimento do sarcômero (SL) e à razão transitória de Ca2+ usando o algoritmo de traço monotônico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Comparação da função contrátil em miócitos cardíacos em resposta à sobrecarga pressórica (PO) e transferência gênica. Os resultados do encurtamento de miócitos são de corações de ratos simulados e PO 18-20 semanas após a cirurgia (painel superior)5,13 e miócitos de ratos simulados e PO 4 dias após a transferência do gene cTnIT144D (painel inferior). A função contrátil é medida 4 dias após o isolamento dos miócitos/transferência gênica em todos os grupos. Os resultados são expressos como ± SEM médio (n = número de miócitos). Cada conjunto de dados simulados e PO é comparado por um teste t de Student, com *p < 0,05 considerados estatisticamente significativos. Resultados de amplitude de pico para miócitos simulados e PO isolados foram relatados anteriormente em Ravichandran et al.5.

Tabela 2: Função contrátil e transientes de Ca2+ em miócitos de ratos adultos 4 dias após a transferência do gene cTnIT144D. Uma análise da função contrátil (painel superior) e dos transientes Ca2+ (painel inferior) é mostrada em miócitos após a transferência gênica de cTnIT144D em comparação com cTnI do tipo selvagem. Os miócitos são isolados de ratos adultos de 2-3 meses de idade, e os dados são apresentados como média ± MEV (n = número de miócitos). Comparações estatísticas da função contrátil (esquerda) e transientes Ca2+ (direita) são realizadas usando um teste t de Student não pareado com significância definida como *p < 0,05.

Figura suplementar 1: Componentes do sistema de estimulação para miócitos banhados em CSs revestidos de laminina. (A) Câmara de estimulação personalizada contendo eletrodos de platina em cada câmara. (B) Câmara de estimulação com as quatro primeiras câmaras cheias de suporte. (C) Câmara de estimulação ligada a cabos de banana-jack, que estão ligados à câmara e (D) ao estimulador. (E) A ligação entre o estimulador (à direita) e a incubadora a 37 °C (à esquerda). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: Componentes necessários para a função contrátil dos miócitos e/ou mediçõestransitórias de Ca 2+. (A) A plataforma de função contrátil mostrando cada componente, com os itens numerados explicados em mais detalhes na Tabela de Materiais. Os componentes da plataforma incluem uma mesa antivibração (1º), microscópio de campo brilhante invertido (#2,3), câmera CCD (4), controlador CCD e fonte de alimentação de xenônio (5), fonte de luz de emissão dupla (6), controlador de temperatura 7, bomba peristáltica (8º), suporte de tubo isolado (9º), câmara de perfusão montada em deslizamento de cobertura (nº 10) e sistema de vácuo (nº 11). (B) Componentes adicionais incluem a interface de fluorescência (#12), estimulador de câmara (#13) e computador PC (#14), que são explicados em mais detalhes na Tabela de Materiais. As exibições em close-up de itens numerados no painel A são mostradas em C-F. (C) Vista da fonte de alimentação de xenônio (esquerda) e do controlador CCD (direita). (D) Controlador de temperatura. (E) Bomba peristáltica. (F) Vista da base para a câmara de perfusão CS (seta preta), o suporte do eletrodo de platina (seta cinza) e o suporte superior (seta branca) com parafusos pan-head #0. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.