Medindo a sensibilidade de Caenorhabditis para o Receptor acetilcolina Agonista Levamisole

Resumo

O presente protocolo descreve um ensaio para determinar a resposta ao levamisole, um agonista farmacológico de uma classe de receptores de acetilcolina caenorhabditis . Neste ensaio de natação de leveisole líquido, os pesquisadores observam visualmente e quantificam a paralisia dependente do tempo de animais cultivados em placas de 24 poços.

Resumo

Na junção neuromuscular (NMJ), a ligação da acetilcolina neurotransmissor excitatória (ACh) aos receptores pós-sinápticos leva à contração muscular. Como no músculo esquelético vertebrado, a sinalização colinérgica nos músculos da parede corporal do organismo modelo Caenorhabditis elegans é necessária para locomoção. A exposição ao levamisole, um agonista farmacológico de uma classe de receptores ACh nos músculos da parede do corpo, causa paralisia dependente do tempo de animais do tipo selvagem. A sensibilidade alterada ao levamisole sugere defeitos na sinalização no NMJ ou função muscular. Aqui, é apresentado um protocolo para um ensaio líquido de leveisole realizado em C. elegans cultivados em placas de 24 poços. A natação vigorosa dos animais em líquido permite a avaliação e a quantitação da paralisia induzida por levamisole em centenas de vermes durante um período de uma hora sem exigir manipulação física. Este procedimento pode ser usado tanto com tipo selvagem quanto com mutantes que alteraram a sensibilidade ao levamisole para demonstrar as consequências funcionais da sinalização alterada no NMJ.

Introdução

A ativação de receptores pós-sinápticos de acetilcolina (AChRs) no músculo esquelético resulta em um sinal elétrico que leva à contração muscular. A interrupção da função neuromuscular resulta em síndromes miasthenic e distrofias musculares em humanos 1,2,3,4. O nematode Caenorhabditis elegans tem sido amplamente utilizado para aprender sobre processos biológicos fundamentais e mecanismos de doença evolutivamente conservados. Os músculos esqueléticos vertebrados e os músculos da parede corporal de C. elegans são funcionalmente equivalentes no controle da locomoção⁵. Aqui, é apresentado um simples ensaio que pode ser usado para comparar elegans tipo selvagem com mutantes que alteraram a sinalização neuromuscular ou a função muscular.

Insumos excitatórios e inibitórios recebidos de neurônios motores colinérgicos e GABAérgicos, respectivamente, fazem com que os músculos de um lado do corpo de C. elegans se contraam enquanto os músculos do outro lado relaxam, permitindo a locomoção coordenada⁶. Levamisole, um agente antelminético usado para tratar infecções de nematoide parasitas, liga-se e ativa constitutivamente uma classe de AChRs nos músculos da parede do corpo, resultando em paralisia dependente do tempo⁷. Assim, a sensibilidade alterada ao levamisole pode ser utilizada para identificar C. elegans com defeitos no equilíbrio da sinalização excitatória e inibitória 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Por exemplo, mutações em subunidades do AChR sensível ao levamisole (L-AChR), como o UNC-63, bem como o cojenco C. elegans de Cubilin, LEV-10, que é necessário para o agrupamento L-AChR na sinapse, sinalização excitatória de impacto e resultam em resistência ao levamisole ^7,8. Mutações no receptor GABA_A UNC-49 reduzem a sinalização inibitória e causam hipersensibilidade ao levamisole¹².

A hipersensibilidade ou resistência ao levamisole tem sido tradicionalmente avaliada transferindo animais para placas de ágar contendo levamisole e, em seguida, regularmente estimulando os vermes para determinar o ponto de tempo em que a paralisia ocorre 13,14,15. Desenvolvemos um ensaio de natação de leveisole líquido que elimina a necessidade de manipulação física dos animais e permite a triagem de centenas de animais em apenas 1h. Aqui, descreve-se o uso deste ensaio com animais do tipo selvagem, unc-63(x26), lev-10(x17)e unc-49(e407). No entanto, este protocolo também pode ser realizado em C. elegans expostos à RNAi, como foi feito para validar knockdowns identificados em uma tela RNAi em todo o genoma para sensibilidade de levamisole alterada¹¹.

Para este ensaio farmacológico, os vermes foram cultivados até a idade adulta em placas de 24 poços, 0,4 mM de levamisole em tampão M9 foi adicionado a cada poço, e o número de animais em movimento foi registrado a cada 5 minutos por 1 h. A paralisia induzida por levamisole foi observada visualmente ao longo do tempo e, após a conclusão do ensaio, os dados foram quantificados. A avaliação dos mutantes, juntamente com os tipos selvagens C. elegans , permite que os alunos primeiro façam previsões sobre potenciais efeitos fenotípicos e, em seguida, realizem experimentos para testar suas hipóteses. Em conclusão, este ensaio simples, barato e líquido de levamisola líquida é uma maneira ideal de demonstrar o impacto da perda de genes específicos na função NMJ.

Protocolo

1. Preparação de placas para o ensaio de levamisole

1. Prepare a mídia média de crescimento nematode (NGM) combinando 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone e 17 g de ágar com 1 L de água desionizada (DI) em um frasco com uma barra de mexida.
2. Depois de autoclaving, coloque a mídia em uma placa quente definida para 70 °C e mexa a uma velocidade moderada por 1h.
3. Adicione 1 mL de colesterol de 5 mg/mL em sentido gotílico para evitar a precipitação, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄ e 25 mL de 1 M pH 6.0 tampão fosfato de potássio para a mídia.
4. Transfira 2 mL de mídia NGM em cada poço de uma placa de 24 poços com uma pipeta sorológica estéril (Figura 1).
5. Deixe as placas secarem no banco por 2 dias antes de semear com bactérias. Para armazenamento a longo prazo, coloque-os a 4 °C.
6. Listra para fora OP50 E. coli em uma placa de caldo de lysogeny (LB) e crescer durante a noite a 37 °C.
7. Escolha uma única colônia OP50 em caldo B (10 g de triptona e 5 g de NaCl em 1 L de DI H₂O) e coloque a cultura tremendo a 37 °C durante a noite.
8. Usando uma tubulação estéril, solte 30 μL de suspensão OP50 no ágar no meio de cada poço (Figura 1).
   NOTA: Certifique-se de não danificar a superfície do ágar, pois isso levará à escavação de vermes.
9. Deixe as placas sentarem-se à temperatura ambiente por pelo menos 2 dias após a semeadura para permitir que um gramado bacteriano se forme.
   NOTA: Se a bactéria nos poços centrais não estiver seca após 2 dias, deixe as placas abertas no capô por 20 minutos (Figura 1). As placas devem ser derramadas e semeadas com bactérias de 1 a 2 semanas antes do ensaio.

2. Sincronizando C. elegans (dia 1)

1. Cresça do tipo selvagem, unc-63(x26), lev-10(x17), e unc-49(e407) C. elegans até a idade adulta em placas de 6 cm, preparando pelo menos oito placas por cepa. Confirme que há muitos adultos não famintos nas placas.
   NOTA: Esta é o dobro de placas que o necessário; no entanto, é importante ter placas de backup no caso do primeiro lote de ovos ser destruído durante o branqueamento.
2. Faça 10x M9 tampão dissolvendo 59,6 g de Na₂HPO₄ (dibasic), 29,9 g de KH₂PO₄ (monobásico), 12,8 g de NaCl e 2,5 g de MgSO₄ em 750 mL de água DI com agitação. Uma vez dissolvido, leve o volume até 1 L e o filtro seja esterilizado. Diluir 1:10 e autoclave para fazer 1x tampão M9.
   NOTA: O buffer 1x M9 pode ser feito semanas ou meses de antecedência.
3. Prepare a solução de branqueamento sob o capô no dia da sincronização. Misture 10 mL de alvejante (Tabela de Materiais), 2,5 mL de 10 N NaOH e 37,5 mL de água DI em um tubo cônico de 50 mL. Use óculos, luvas e um jaleco sempre que trabalhar com a solução de branqueamento.
4. Usando um tubo de transferência de plástico, lave vermes adultos gravid de pelo menos quatro placas com tampão 1x M9 e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL.
5. Gire a 716 x g por 1 min a temperatura ambiente e, em seguida, remova o supernante usando uma tubulação de transferência.
6. Adicione 10 mL da solução de branqueamento. Inverter ou agitar suavemente o tubo por ~4 min até que a maioria, mas não todas, as carcaças de vermes tenham dissolvido (Figura 1).
   NOTA: Tenha cuidado para não branquear demais os vermes, pois isso destruirá os ovos. Certas mutações podem aumentar a dificuldade de isolamento dos ovos.
7. Gire em 716 x g por 1 min.
8. Despeje a solução de alvejante em um movimento; enquanto o tubo não estiver abalado neste momento, os ovos grudarão na lateral do tubo.
9. Adicione 15 mL de tampão M9 1x e inverta. Gire a 716 x g por 1 min, e despeje o tampão M9 em um movimento suave.
10. Realize três lavagens no total com tampão M9 1x, conforme descrito na etapa 2.9.
11. Após a lavagem final, adicione 10 mL de 1x M9 fresco e coloque em um rotador durante a noite a 15 °C para isolar uma população sincronizada de animais de estágio primeiro larval (L1) famintos.
    NOTA: Antes de colocar no rotador, verifique se há ovos no buffer M9. Se não, repita a preparação com placas de backup e alvejante por um tempo menor.

3. Chapeamento sincronizado C. elegans (dia 2)

1. Imprima um mapa de placas de 24 poços e atribua cepas a lugares randomizados. Cada cepa deve ser representada na placa de 24 poços pelo menos seis vezes.
2. Aproximadamente 24 h após a preparação do alvejante, gire para baixo eclodidos vermes L1 famintos em tampão M9 a 716 x g por 1 min em temperatura ambiente.
3. Remova ~9 mL de tampão M9 com um tubo de transferência de plástico e, em seguida, misture suavemente os vermes de estágio larval famintos (L1s) no tampão M9 restante.
4. Insurrea imediatamente 3 μL dos worms no buffer M9 em um slide de microscópio e determine o número de L1s; o número desejado é de 20-30 L1s em 3 μL. Gire para baixo e remova M9 se a concentração do worm estiver muito baixa, e adicione M9 se a concentração for muito alta.
   NOTA: Verifique o número de worms por 3 μL pelo menos 2x, invertendo o tubo cada vez.
5. Pipet 3 μL de L1s (20-30 worms total) em cada poço de acordo com o mapa da placa pré-feita (passo 3.1; Figura 1).
   NOTA: Inverta o tubo com os L1s em M9 com frequência para manter uma distribuição uniforme de vermes, pois eles se estabelecerão até o fundo. Se isso não for feito, alguns poços terão poucos vermes, enquanto outros terão muitos. Além disso, não fure o ágar com a ponta pipeta, pois isso fará com que os animais se enterrem.
6. Deixe os vermes crescerem até a idade adulta por 3 dias a 20 °C.
   NOTA: O uso de diferentes temperaturas de crescimento e certas mutações podem afetar a velocidade de maturação, por isso não deixe de considerar o ciclo de vida C. elegans .

4. Realizando o ensaio de levamisole (dia 5)

1. Imprima uma folha de dados em branco, que será usada para registrar o número de worms movendo-se em cada poço a cada 5 minutos por 1 h.
   NOTA: Os alunos poderão contar os vermes em no máximo 12 poços a cada 5 minutos. Os 12 melhores poços são avaliados na primeira hora, com os 12 poços inferiores avaliados na hora seguinte.
2. Verifique os vermes nas placas de 24 poços. Usando um marcador, faça um "X" na tampa da placa sobre quaisquer poços que tenham contaminação, tenham passado fome ou tenham muitos vermes (>40), o que dificultará a contagem.
3. Faça solução de levamisole de 0,4 mM adicionando 200 μL de 100 mM de estoque de levamisole a 50 mL de 1x M9. Prepare 100 mM de caldo de levamisole dissolvendo 240,76 mg de cloridrato de levamisole em 10 mL de H₂O e armazene-o a −20 °C.
   NOTA: Levamisole deve ser diluído em M9; diluição em H₂O acelera a paralisia. Os alunos devem usar luvas. A ingestão de altas concentrações de levamisole é tóxica.
4. Inicie um temporizador e, em seguida, usando um pipet de transferência, adicione 1 mL de levamisole de 0,4 mM aos dois primeiros poços, de tal forma que os animais estão nadando livremente. Continue adicionando levamisole aos poços adjacentes, cambaleando o tempo de acordo com o número de poços a serem avaliados.
   NOTA: Por exemplo, se 10 poços forem avaliados, o levamisole será adicionado da seguinte forma: poços 1 e 2 no tempo 0, poços 3 e 4 após 1 min, poços 5 e 6 após 2 min, poços 7 e 8 após 3 min, e poços 9 e 10 após 4 min.
5. Em 5 min, comece contando manualmente apenas o número de vermes em movimento em cada poço, começando com o primeiro poço, e regise esse número na folha de dados (Figura 1). Contadores podem ser usados, mas não são necessários para determinar com precisão o número de worms em movimento.
   NOTA: Os alunos precisam ficar de olho no temporizador, pois às vezes ficam para trás durante os primeiros momentos antes que muitos vermes paralisem. O número de pontos de tempo pode ser ajustado, ou menos poços podem ser avaliados em cada ponto de tempo, se necessário.
6. Continue a contar o número de vermes em movimento em cada poço a cada 5 minutos por 1 h.
   NOTA: A imersão em M9 induz o movimento constante da natação ao longo deste ensaio de 1h, o que elimina a necessidade de prodding dos vermes para avaliar a paralisia (Figura 2A). A exposição à solução de levamisole de 0,4 mM induz paralisia dependente do tempo, conforme observado pela cessação da natação; vermes que paralisam não se recuperam.
7. Repetir as etapas 4.4.-4.6. para o resto dos poços na placa.
8. No final do ensaio, ou quando o tempo permitir, registo o número total de vermes em cada poço.

5. Análise de dados

1. Obtenha o mapa da placa (etapa 3.1.) e regise qual cepa corresponde a cada poço.
   NOTA: Devido à quantidade de dados coletados, a análise e discussão subsequentes dos dados levará pelo menos algumas horas.
2. Insira os dados em uma planilha, começando com o número total de worms em cada poço e organizando por genótipo.
3. Combinando dados dos poços, determine o número de vermes se movendo em cada ponto de tempo para cada cepa.
4. Use esses dados para criar uma "curva de sobrevivência" no software estatístico (Tabela de Materiais) para exibir visualmente a paralisia dependente do tempo da população (Figura 2B).
5. Faça uma tabela de dados de modo que a coluna da mão esquerda indique tempo e as colunas subsequentes contenham os dados de cada cepa. Para cada animal que está paralisado dentro dos primeiros 5 minutos, crie uma linha e digite um "1" por 5 min. Repita isso para cada ponto de tempo. Para todos os animais que não paralisam até o final do ensaio, digite um "0" por 60 min.
6. Realize comparações em pares usando o teste de log-rank (Mantel-Cox) no software estatístico (Tabela de Materiais) para determinar se há uma diferença estatisticamente significativa entre duas cepas diferentes.
7. Para análise adicional/alternativa, em vez de realizar a etapa 5.3. e passo 5.4., determinar a porcentagem de animais que se movem em cada poço em cada ponto de tempo. Plote a média com erro padrão em cada ponto de tempo para todas as cepas avaliadas usando um programa de planilha ou o software estatístico (Figura 2C).

Resultados

A sinalização através de AChRs e receptores GABA permite que os músculos de um lado do corpo de C. elegans se contraam enquanto os músculos do outro lado relaxam, permitindo locomoção coordenada ^6,16. A ligação de levamisole aos L-AChRs ionotrópicos causa contração, levando à paralisia dependente do tempo de animais do tipo selvagem. Aqui, avaliamos a sensibilidade do tipo selvagem, mutante unc-63 L-AChR, mutante de agrupamento lev-10 L-AChR, e unc-49 GABA_A receptor mutante C. elegans to levaisole. Mutações em subunidades do L-AChR, assim como em genes necessários para o tráfico de L-AChRs para a membrana plasmática muscular, agrupamento de L-AChRs postsínapticas, e sinalização ca²⁺ a jusante, causam resistência à paralisia induzida por levamisole 7,8,9,10,11,16,17, como observado nos mutantes unc-63 e lev-10 (Figura 2B (C). A perda do canal de íons porta-gab-gated UNC-49 causou hipersensibilidade de levamisole (Figura 2B,C) devido à interrupção do equilíbrio adequado da sinalização colinérgica e GABAérgica¹². Quando este ensaio foi recentemente realizado por graduandos em um laboratório de genética avançada, 100% dos alunos observaram resistência à levamisola com os mutantes unc-63 e lev-10, enquanto 88% observaram hipersensibilidade de levamisole com o mutante unc-49. Esses dados coletados com o ensaio de natação de leveisole líquido são consistentes com fenótipos observados nos ensaios tradicionais de levamisola à base de placas 7,8,11,12,13.

Figura 1: Esquema de preparação e implementação do ensaio de levamisole. Placas de GNL de 24 poços são derramadas; 2 dias depois, OP50 Escherichia coli é semeada nos poços. C. elegans são sincronizados através da preparação de alvejantes, e primeiro estágio larval (L1) animais para cada cepa a ser avaliada (tipo selvagem, preto; unc-63(x26), magenta; lev-10(x17), verde; unc-49(e407), azul) são pipetos nos poços de acordo com um mapa de placas predeterminada no dia seguinte. Após 3 dias de crescimento a 20 ºC, ou quando os animais atingem a idade adulta, 0,4 mM de levamisole em M9 tampão é adicionado a cada poço, e o número de animais em movimento é contado a cada 5 minutos por 1 h. Por favor clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Paralisia induzida por levamisole em tipo selvagem e mutante representativo C. elegans. (A) A exposição a levamisole de 0,4 mM causa paralisia dependente do tempo; isso não é observado para animais nadando em tampão M9 1x por 1 h. (B) Paralisia dependente do tempo de animais do tipo selvagem (preto), unc-63(x26) (magenta), lev-10(x17) (verde) e animais unc-49(e407) (azul) no ensaio de natação de leveisole. A perda da subunidade L-AChR UNC-63 ou L-AChR, proteína de agrupamento LEV-10, resultou na resistência ao levamisole, e a perda do receptor GABA_A UNC-49 causou hipersensibilidade de levamisole. n ≥ 50 por genótipo, p < 0,0001 para todos os mutantes em comparação com o tipo selvagem neste experimento representativo. (C) Utilizando os mesmos dados do painel (B), foi determinada a porcentagem de animais em movimento em cada ponto de tempo (média das porcentagens para cada poço ± SE) para cada cepa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A resposta alterada ao levamisole pode identificar genes necessários para sinalização colinérgica postiática e função muscular. O protocolo aqui descreve um ensaio líquido de levamisola usado para quantificar paralisia dependente do tempo durante um período de tempo de 1h. Os alunos fazem previsões sobre os efeitos de certas mutações genéticas, realizam um experimento com grande tamanho amostral e, em seguida, quantitam seus resultados. Este ensaio é uma maneira simples e eficiente de quantificar a paralisia induzida por levamisole sem colher ou cutucar animais, tornando-o adequado para laboratórios de graduação, bem como pesquisadores que estudam a transmissão neuromuscular. Aqui discutidos estão algumas das armadilhas mais comuns, as limitações do ensaio e uma variação ao protocolo que permite seu uso com animais de knockdown RNAi; também discutido aqui é como este ensaio pode ser incorporado em uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso.

A preparação adequada das placas de 24 poços é essencial. Primeiro, os gramados bacterianos devem estar completamente secos antes de detectar animais L1 nos poços. Se não estiver seca o suficiente, a bactéria se mistura com a solução de levamisole durante o ensaio, tornando o líquido nublado e impedindo que os indivíduos possam contar os vermes. Em segundo lugar, ao sincronizar vermes através da preparação de alvejante, os animais não devem ser expostos à solução alvejante por muito tempo, pois isso fará com que o revestimento protetor dos ovos se desinte com isso. Em terceiro lugar, é crucial detectar apenas 20-30 L1s por bem, já que muitos vermes nos poços tornam extremamente difícil contar com precisão o número se movendo no tempo atribuído. Por fim, é importante manter uma técnica asséptica durante a preparação das placas, pois os poços contaminados não podem ser avaliados.

Existem algumas limitações que devem ser consideradas ao realizar este ensaio. Primeiro, contar o número de vermes em movimento em cada poço a cada 5 minutos pode ser esmagador para indivíduos que não têm experiência de laboratório prévia, e isso pode levar a uma coleta de dados imprecisa. Quanto a outros ensaios usados para determinar a sensibilidade da droga^18,19, este experimento pode ser realizado com menos pontos de tempo. Em segundo lugar, o revestimento de L1s famintos isolados de uma preparação alvejante é um método fácil de obter uma população sincronizada; no entanto, ajustes devem ser feitos se o tempo de desenvolvimento difere entre as cepas que estão sendo avaliadas. É possível escolher animais de estágio quarto quarto (L4s) em uma placa de 24 poços para este ensaio; no entanto, ao preparar muitas placas, isso é muito trabalhoso. Alternativamente, deve-se determinar o tempo necessário para que cada cepa chegue a L4 e, em seguida, coloque os L1s nos poços em diferentes momentos para ajustar para diferenças na velocidade de maturação. Finalmente, enquanto este ensaio pode ser usado para identificar novos genes importantes para a função muscular não sináptica¹¹, a resposta de levamisole alterada também pode ser causada por mutação ou down RNAi de genes pré-sinápticos¹². Se observada a sensibilidade do levamisole alterado, devem ser realizados experimentos adicionais para determinar a razão deste fenótipo.

Ao fazer algumas modificações nas placas de 24 poços, o ensaio de natação de levamisole descrito também pode ser realizado em animais de knockdown RNAi¹¹. O knockdown genético através do RNAi pode ser alcançado alimentando bactérias C. elegans que expressam RNA de dupla encalhada correspondente ao gene de interesse²⁰. Para a preparação das placas RNAi, 1 mL de 1M IPTG e 1 mL de carbenicilina de 25 mg/mL devem ser adicionados por litro de mídia após a remoção da autoclave. As culturas bacterianas são cultivadas escolhendo uma única colônia em 3 mL de caldo LB mais 3 μL de 25 mg/mLcarbenicillin, e tremendo a 37 °C durante a noite, e o mapa da placa é feito quando as diferentes bactérias são vistas nos poços. C. elegans são sincronizados pela preparação de alvejante como descrito; no entanto, a cepa eri-1 (mg366) hipersensível RNAi deve ser usada em vez do tipo selvagem para aumentar o knockdown genético. Os knockdowns rnai resultam nos mesmos fenótipos de levamisole observados para mutantes de perda de função¹¹.

O protocolo aqui apresentado pode ser usado em pesquisas laboratoriais, como um experimento autônomo no laboratório de graduação, ou nas semanas de abertura de um curso avançado de graduação como introdução às técnicas básicas de C. elegans e função neuromuscular. Em um curso mais avançado baseado em descobertas, os alunos podem usar este ensaio para determinar se a perda de C. elegans homólogos de genes mutantes em indivíduos com síndromes miástênicas, distrofias musculares ou miopatias alteram a sensibilidade do levamisole. Em conclusão, este simples e barato ensaio de sensibilidade de levamisole fornece uma abordagem prática para aprender sobre sinalização no NMJ e ganhar experiência trabalhando com o sistema modelo C. elegans .

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri de 60 mm não ventiladas, borda afiada	TriTech Research	Cat #: T3308
BD Difco Bacto Agar	Fisher Scientific	Cat#: DF0140-01-0
BioLite 24 Well Multidish	Fisher Scientific	Cat#:12-556-006
Cloreto de Cálcio Dihidratado	Fisher Scientific	Cat#: BP510-500
Colesterol	MP Biomedicals	Cat#: 02101382-CF
em>eri-1(mg366)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	GR1373
Gibco Bacto Peptone	Fisher Scientific	Cat#: DF0118-17-0
Gibco Bacto Tryptone	Fisher Scientific	Cat#: DF0123-17-3
GraphPad Prism (Software estatístico)	GraphPad Software, Inc.
lev-10(x17)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	ZZ17
Cloridrato de levamisol	Fisher Scientific	Cat#: AC187870100
Alvejante regular de baixo respingo - 121 onças - para cima e para cima	Pesquisa	de alvos target.com
Sulfato de magnésio heptahidratado	Fisher Scientific	Cat#: BP213-1
Microsoft Excel	Microsoft, Inc
N2 tipo selvagem	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Bristol N2
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50
Fosfato de potássio dibásico Fisher	Scientific	Cat#: BP363-1
Fosfato de potássio monobásico	Fisher Scientific	Cat#: BP362-500
Cloreto de Sódio (NaCl)	Fisher Scientific	Cat#: BP358-1
Hidróxido de Sódio 10N	Fisher Scientific	Cat#: SS255-1
Fosfato de Sódio Dibásico	Fisher Scientific	Cat#: BP332-1
unc-49(e407)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	CB407
unc-63(x26)	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)	ZZ26