Uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-Induced Focal Demyelination Modelo em camundongos

Resumo

O presente protocolo descreve uma injeção de dois pontos de linfosfatilcolina através de um quadro estereotaxico para gerar um modelo de desmielinização estável e reprodutível em camundongos.

Resumo

A sinalização linfosfolipídida mediada por receptores contribui para a fisiopatologia de diversas doenças neurológicas, especialmente a esclerose múltipla (EM). Lisofosphatidylcholina (LPC) é uma lisofosfosfolipídio endógena associada à inflamação, e pode induzir danos rápidos com toxicidade aos lipídios de mielina, levando à desmielinização focal. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para injeção estereotática de LPC de dois pontos que poderia causar diretamente desmielinização grave e replicar a lesão de desmielinização experimental rapidamente e stably em camundongos por procedimento cirúrgico. Assim, esse modelo é altamente relevante para as doenças de desmielinização, especialmente a ESM, podendo contribuir para o avanço clínico da pesquisa. Além disso, os métodos de coloração azul rápido e imunofluorescência e Luxol foram usados para retratar o curso do tempo da desmielinização no caloso corpus de camundongos injetados com LPC. Além disso, o método comportamental foi utilizado para avaliar a função cognitiva dos camundongos após a modelagem. No geral, a injeção de dois pontos de linfosfatidylcholina através de um quadro estereotaxico é um método estável e reprodutível para gerar um modelo de dessalinização em camundongos para estudos posteriores.

Introdução

A sinalização linfosfolipídica mediada por receptores envolve diversos processos fisiológicos de quase todos os sistemas^{de órgãos 1}. No sistema nervoso central (SNC), essa sinalização desempenha um papel crítico nas patógenias de doenças neurológicas autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). A esclerose múltipla é uma doença imunomediada crônica caracterizada por desmielinização patológica e resposta inflamatória, causando disfunção neurológica e comprometimento cognitivo ^2,3. Após uma recaída contínua e a remissão durante a doença precoce, a maioria dos pacientes eventualmente evolui para o estágio secundário-progressivo, o que poderia causar danos irreversíveis ao cérebro e incapacidade^{resultante 4}. Acredita-se que a marca patológica do curso secundário-progressivo é a desmielinização de placas causadas por lesões inflamatórias⁵. Os tratamentos existentes para ESM podem reduzir significativamente o risco de recaída. No entanto, ainda não há terapia eficaz para danos desmielinizados de longo prazo causados pela ESM^{progressiva 6}. Assim, é necessário um modelo estávelmente estabelecido e facilmente reprodutível para estudar terapêuticas pré-clínicas que se concentrem na degeneração da matéria branca.

Demielinização e remiellinação são dois grandes processos patológicos no desenvolvimento da esclerose múltipla. A demyelinação é a perda da baia de mielina em torno de axônios induzidos por microglia com fenótipos pró-inflamatórios⁷, e leva à condução lenta de impulsos nervosos e resulta na perda de neurônios e distúrbios neurológicos. A remielinação é uma resposta endógena de reparo mediada por oligodenrócitos, onde distúrbios podem levar à neurodegeneração e comprometimento cognitivo⁸. A resposta inflamatória é crucial para todo o processo, afetando tanto o grau de dano e reparação da mielina.

Portanto, um modelo animal estável de desmielinização inflamatória persistente é significativo para a exploração de estratégias terapêuticas para MS. Devido à complexidade da ESM, vários tipos de modelos animais foram estabelecidos para imitar lesões desmielinizadoras in vivo, incluindo encefalomielite autoimune experimental (EAE), modelos tóxicos-desmielinizadores, cuprizone (CPZ) e linfosfatilina (LPC)⁹ . LPC é um lysofosfolipídio endógeno associado à inflamação, e pode induzir danos rápidos com toxicidade aos lipídios de mielina, levando à dessalinização focal. Com base em relatórios anteriores e pesquisas^10,11, é fornecido um protocolo detalhado de injeção de dois pontos com algumas modificações. Geralmente, o modelo clássico de injeção LPC de um ponto só produz desmielinização local no local da injeção e é frequentemente acompanhado de remielinização espontânea^12,13. No entanto, o modelo LPC de injeção de dois pontos pode demonstrar que o LPC pode induzir diretamente a desmielinização no calosum do corpus do mouse e causar desmielinização mais durável com pouca regeneração de mielina.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Tongji Medical College, Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong, China. Foram utilizados para o presente estudo camundongos adultos C57BL/6 masculinos e femininos (tipo selvagem, WT; 20-25 g; 8-10 semanas de idade). Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Os camundongos foram alojados em uma instalação animal específica sem patógenos (SPF) com água e alimentos fornecidos ad libitum. Eles foram mantidos em um período alternado de 12h de ciclo claro e escuro nas condições padrão de temperatura de 22 °C e umidade relativa de 55%-60%.

1. Preparação da solução LPC

1. Dissolva 25 mg de pó LPC (ver Tabela de Materiais) com 250 μL de solução mista de clorofórmio e metanol (1:1) para fazer uma solução LPC de 10% e transferi-la para um tubo de centrífuga de 500 μL.
   NOTA: Se o LPC não estiver completamente dissolvido, coloque o tubo centrífuga em um limpador ultrassônico e ultrassônico a 40 kHz por ~1h para obter uma solução uniforme.
2. Divida a solução em 3 μL/tubo e armazene a −80 °C.
   NOTA: A solução pode ser armazenada por ~2 anos.
3. Antes da cirurgia, diluir a solução (passo 1.2.) com 27 μL de solução naCl de 0,9% e manter a solução em um banho de água de temperatura constante a 37 °C.
   NOTA: Prepare a solução pouco antes de iniciar a injeção.

2. Preparação cirúrgica

1. Use uma agulha de 32 G, 2 na agulha para conectar a uma seringa de 5 μL (ver Tabela de Materiais). Certifique-se de que a seringa microliter está desobstruída. Retire 5 μL da solução LPC para a preparação da injeção.
2. Anestesiar o rato em uma câmara de indução conectada a um vaporizador de isoflurano com 3% de isoflurane misturado com 100% de oxigênio a uma taxa de cerca de 0,3 L/min.
3. Confirme a profundidade da anestesia pela falta de reflexo do dedo do sol enquanto a respiração está lisa.
4. Raspe a cabeça do mouse entre as orelhas usando uma máquina de barbear elétrica. Aplique colírios lubrificantes para evitar o ressecamento da córnea durante o procedimento.
5. Em seguida, posicione o mouse em uma estrutura estereotaxic (ver Tabela de Materiais) com o lado dorsal para cima, e fixe a cabeça com um cone de nariz e grampo de dente. Mantenha a anestesia com 1,2%-1,6% isoflurane pelo nariz.
   NOTA: A concentração de isoflurano pode ser ajustada de acordo com o estado respiratório dos camundongos.

3. Procedimento cirúrgico

NOTA: Os animais são colocados em uma almofada de aquecimento durante todos os procedimentos.

1. Fixar o mouse no aparelho estereotaxico com barras de ouvido bilaterais. Certifique-se de que as barras de ouvido estão nivelados e a cabeça está horizontal e estável.
2. Desinfete a pele na cabeça limpando várias vezes com iodophor seguido de álcool em movimento circular. Em seguida, use um bisturi para cortar uma pequena incisão de cerca de 1,5 cm ao longo da linha média do couro cabeludo para expor o crânio.
3. Limpe o crânio com um cotonete mergulhado em peróxido de hidrogênio de 1% até que a bregma, lambda e fontanelle posterior sejam expostas. Coloque a seringa no aparelho estereotaxic.
   NOTA: Use peróxido de hidrogênio com cuidado e evite tocar nos tecidos circundantes.
4. Certifique-se de posicionamento horizontal da cabeça do animal (tanto dianteira quanto traseira e esquerda e direita).
   1. Ajuste o botão do eixo Z do quadro estereotaxico para que a ponta da agulha e o crânio toquem sem dobrar e, em seguida, meça a coordenada do eixo Z. Verifique as coordenadas Z de bregma e fontanelle posterior.
   2. Ajuste a barra de ouvido para que a diferença entre as coordenadas Z de bregma e fontanelle posterior não seja superior a 0,02 mm. Em seguida, siga o mesmo método para medir as coordenadas Z das posições correspondentes nos lados esquerdo e direito da linha média. Ajuste a barra de ouvido para garantir que a esquerda e a direita estejam no mesmo nível.
5. Localize o corpus calosum. Defina a origem XYZ como bregma.
   NOTA: O primeiro local de injeção é 1,0 mm lateral para o bregma, 2,4 mm de profundidade e 1,1 mm anterior. O segundo local de injeção é 1,0 mm lateral para o bregma, 2,1 mm de profundidade e 0,6 mm anterior. Por exemplo, a coordenada do bregma é (0,0,0). Meça a coordenada Z do local correspondente marcado como (-1, 1.1, X) e (-1, 0,6, Y). Pode-se determinar que a primeira coordenada do local de injeção do corpus callosum é (-1, 1.1, −[X + 2.4]), e o segundo local de injeção é (-1, 0,6, −[Y + 2.1]).
6. Uma vez que o local de injeção é determinado, faça uma marca com um marcador estéril no crânio e registe as coordenadas.
7. Perfurar suavemente o local marcado com uma broca de crânio (ver Tabela de Materiais). Tome cuidado para evitar qualquer sangramento.
8. Mova lentamente a agulha para as coordenadas dadas e inicie a injeção. Para induzir a desmielinização do corpus callosum, injete 2 μL de solução LPC (etapa 1.) em cada local de injeção (etapa 3,5.) a uma taxa de 0,4 μL/min.
9. Após a injeção, mantenha a agulha em cada local por mais 10 minutos.
   NOTA: Certifique-se de que o intervalo de duas injeções não seja superior a 20 minutos.
10. Suture a pele com uma sutura 4-0 e espere o animal acordar dentro de 10 minutos. Administrar analgésicos no pós-operatório de acordo com as normas institucionais de cuidados com animais.
    NOTA: O tempo recomendado para eutanásia pode ser determinado de acordo com o propósito do experimento.

4. Extração amostral para desmielinização focal

NOTA: Para obter detalhes sobre esta etapa, consulte o relatório publicado anteriormente¹⁴.

1. Dissolver corante vermelho neutro (ver Tabela de Materiais) em uma solução de 1% em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
2. horas antes de sacrificar os camundongos (para detalhes, ver referência anterior¹⁰), injetar 500 μL de corante vermelho neutro de 1% em PBS por injeção intraperitoneal para cada rato.
3. Realizar perfusão cardíaca¹² com 30 mL de 0,1% PBS pré-cozido a 4 °C.
4. Corte o cérebro em 1 mm com um molde cerebral (ver Tabela de Materiais).
5. Visualize a lesão manchada com vermelho neutro sob o microscópio e dissociar a lesão.
   NOTA: Remova o máximo possível de tecido normal ao redor para melhorar a precisão da análise subsequente. O tecido da lesão pode ser examinado com RT-PCR, microscopia eletrônica e análises de manchas ocidentais.

5. Coloração histológica e imunofluorescência

1. Para coloração histológica e imunofluorescência¹², após perfusão cardíaca (passo 4.3.), remover o cérebro¹⁰, fixar em 4% PFA durante a noite (a 4 °C) e desidratar completamente em 30% de sacarose.
2. Corte em seções cerebrais coronais de 20 mm usando um cortador congelado¹⁰ em temperatura constante (−20 °C).
3. Use as fatias para coloração azul rápido luxol (LFB), imunofluorescência e mancha ocidental¹⁰.

Resultados

A injeção de dois pontos do LPC resultou em uma dessalinização mais durável
LPC leva principalmente a danos rápidos com toxicidade à mielina e decote da integridade do axônio¹⁵. O dia da injeção foi considerado como o dia 0. Os camundongos foram mantidos por um período de 10 a 28 dias (10 dpi e 28 dpi). A coloração¹⁰ do azul rápido luxol (LFB) foi utilizada para avaliar a área de desmielinização em camundongos nesses pontos de tempo. No modelo de injeção...

Discussão

A ESM, doença desmielinização crônica do SNC, é uma das causas mais comuns de disfunção neurológica em adultos jovens²⁰. Clinicamente, aproximadamente 60%-80% dos pacientes com ES experimentam o ciclo de recaídas e remissões antes de desenvolver uma^{ESM 21,22} secundária-progressiva, e isso eventualmente leva a prejuízos de movimento cumulativos e déficits cognitivos ao longo do tempo²³. Atualmente, nenhum modelo expe...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
L-α-Lisofosfatidilcolina de gema de ovo	Sigma-Aldrich	L4129-25MG
	HAMILTON	7762-05
10 μ l seringa	HAMILTON	80014
broca de alta velocidade do crânio	forte, coreia	strong204
broca	Hager & Meisinger, Alemanha	REF 500 104 001 001 005
Ventilador de Anestesia Animal Matrx	MIDMARK	VMR
Instrumento Estereotáxico Portátil para Mouse	Reward	68507
Micro seringa	Reward	KDS LEGATO 130
Isoflurano	VETEASY
Paraformaldeído	Servicebio	G1101
Tampão de fosfato	BOSTER	PYG0021
LuxoL rápido bLue	Servicebio	G1030-100ML
Sutura	FUSUNPHARMA	20152021225
molde	Recompensa	68707
Fixador	de microscópio eletrônicoServicebio	G1102-100ML
Vermelho Neutro (C.I. 50040), para microscopia Certistain	Sigma-Aldrich	1.01376
Anticorpo Básico Anti-Mielina	Millipore	#AB5864
Anti-GST-P pAb	MBL	#311
Ki-67 Anticorpo Monoclonal (SolA15)	Thermo Fisher  Anticorpo Monoclonal Beta	Actina Scientific 14-5698-95
	Proteintech	66009-1-Ig
Anticorpo Policlonal de Proteína Básica de Mielina	Proteintech	10458-1-AP
OLIG2 Anticorpo Policlonal	Proteintech	13999-1-AP
Alexa Fluor 488  AffiniPure  Burro anti-coelho  IgG (H+L)	YEASEN	34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rato IgG (H+L)	YEASEN	34412ES60
Alexa Fluor 594  AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	YEASEN	34212ES60
HRP IgG Anti-Coelho para Cabras (H+L)	abclonal	AS014
HRP IgG Anti-Rato para Cabras (H+L)	abclonal	AS003
Adulto C57BL / 6 camundongos machos e fêmeas	Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd