O presente protocolo descreve uma injeção de dois pontos de linfosfatilcolina através de um quadro estereotaxico para gerar um modelo de desmielinização estável e reprodutível em camundongos.
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Artigo de método
Uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-Induced Focal Demyelination Modelo em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A sinalização linfosfolipídida mediada por receptores contribui para a fisiopatologia de diversas doenças neurológicas, especialmente a esclerose múltipla (EM). Lisofosphatidylcholina (LPC) é uma lisofosfosfolipídio endógena associada à inflamação, e pode induzir danos rápidos com toxicidade aos lipídios de mielina, levando à desmielinização focal. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para injeção estereotática de LPC de dois pontos que poderia causar diretamente desmielinização grave e replicar a lesão de desmielinização experimental rapidamente e stably em camundongos por procedimento cirúrgico. Assim, esse modelo é altamente relevante para as doenças de desmielinização, especialmente a ESM, podendo contribuir para o avanço clínico da pesquisa. Além disso, os métodos de coloração azul rápido e imunofluorescência e Luxol foram usados para retratar o curso do tempo da desmielinização no caloso corpus de camundongos injetados com LPC. Além disso, o método comportamental foi utilizado para avaliar a função cognitiva dos camundongos após a modelagem. No geral, a injeção de dois pontos de linfosfatidylcholina através de um quadro estereotaxico é um método estável e reprodutível para gerar um modelo de dessalinização em camundongos para estudos posteriores.
Introdução
A sinalização linfosfolipídica mediada por receptores envolve diversos processos fisiológicos de quase todos os sistemasde órgãos 1. No sistema nervoso central (SNC), essa sinalização desempenha um papel crítico nas patógenias de doenças neurológicas autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). A esclerose múltipla é uma doença imunomediada crônica caracterizada por desmielinização patológica e resposta inflamatória, causando disfunção neurológica e comprometimento cognitivo 2,3. Após uma recaída contínua e a remissão durante a doença precoce, a maioria dos pacientes eventualmente evolui....
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Protocolo
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Tongji Medical College, Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong, China. Foram utilizados para o presente estudo camundongos adultos C57BL/6 masculinos e femininos (tipo selvagem, WT; 20-25 g; 8-10 semanas de idade). Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Os camundongos foram alojados em uma instalação animal específica sem patógenos (SPF) com água e alimentos fornecidos ad libitum. Eles foram mantidos em um período alternado de 12h de ciclo claro e escuro nas condições padrão de temperatura de 22 °C e u....
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Resultados
A injeção de dois pontos do LPC resultou em uma dessalinização mais durável
LPC leva principalmente a danos rápidos com toxicidade à mielina e decote da integridade do axônio15. O dia da injeção foi considerado como o dia 0. Os camundongos foram mantidos por um período de 10 a 28 dias (10 dpi e 28 dpi). A coloração10 do azul rápido luxol (LFB) foi utilizada para avaliar a área de desmielinização em camundongos nesses pontos de tempo. No modelo de injeção.......
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Discussão
A ESM, doença desmielinização crônica do SNC, é uma das causas mais comuns de disfunção neurológica em adultos jovens20. Clinicamente, aproximadamente 60%-80% dos pacientes com ES experimentam o ciclo de recaídas e remissões antes de desenvolver umaESM 21,22 secundária-progressiva, e isso eventualmente leva a prejuízos de movimento cumulativos e déficits cognitivos ao longo do tempo23. Atualmente, nenhum modelo expe.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grants: 82071380, 81873743).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| L-α-Lisofosfatidilcolina de gema de ovo | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| HAMILTON | 7762-05 | ||
| 10 μ l seringa | HAMILTON | 80014 | |
| broca de alta velocidade do crânio | forte, coreia | strong204 | |
| broca | Hager & Meisinger, Alemanha | REF 500 104 001 001 005 | |
| Ventilador de Anestesia Animal Matrx | MIDMARK | VMR | |
| Instrumento Estereotáxico Portátil para Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro seringa | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurano | VETEASY | ||
| Paraformaldeído | Servicebio | G1101 | |
| Tampão de fosfato | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL rápido bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Sutura | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| molde | Recompensa | 68707 | |
| Fixador | de microscópio eletrônicoServicebio | G1102-100ML | |
| Vermelho Neutro (C.I. 50040), para microscopia Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anticorpo Básico Anti-Mielina | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Anticorpo Monoclonal (SolA15) | Thermo Fisher Anticorpo Monoclonal Beta | Actina Scientific 14-5698-95 | |
| Proteintech | 66009-1-Ig | ||
| Anticorpo Policlonal de Proteína Básica de Mielina | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Anticorpo Policlonal | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Burro anti-coelho IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rato IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP IgG Anti-Coelho para Cabras (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP IgG Anti-Rato para Cabras (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adulto C57BL / 6 camundongos machos e fêmeas | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
Referências
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet
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Reimpressões e permissões
