Uso de Bisection para reduzir DNA mitocondrial no Oócito Bovino

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para reduzir significativamente os números de cópia de DNA mitocondrial em um oócito bovino (P < 0,0001). Este método utiliza centrifugação e biseção para reduzir substancialmente mitocôndrias oócitos e pode permitir uma maior chance de desenvolvimento nos embriões de transferência nuclear de células somáticas de células somáticas reconstruídas.

Resumo

A transferência nuclear de células somáticas interespécies (iSCNT) pode ser usada para resgatar espécies ameaçadas de extinção, mas existem duas populações distintas de DNA mitocondrial (mtDNA) dentro do embrião reconstruído: uma dentro do ooplasma receptor e outra dentro da célula somática do doador. Essa heteroplasma mitocondrial pode levar a problemas de desenvolvimento no embrião e no feto. Protocolos de clonagem artesanal incluem biseção de oócito, que pode ser usada para diminuir o número de cópia de MTDNA, reduzindo o grau de heteroplasmia mitocondrial em um embrião reconstruído. Centrifugação de oócitos bovinos desnudos e maduros produziu uma fração visível mitocôndria-densa em um polo do oócito. A zonae pellucidae dos oócitos foi removida pela exposição a uma solução de pronase. A biseção foi realizada usando um microdílo para remover a fração de mitocôndrias visíveis. qPCR foi utilizado para quantificar o mtDNA presente em amostras de DNA extraídos de oócitos inteiros e ooplastos bisseccionados, proporcionando uma comparação dos números de cópias de MTDNA antes e depois da biseção. Os números de cópia foram calculados utilizando-se valores de limiar de ciclo, fórmula de linha de regressão de uma curva padrão e uma razão que incluía os respectivos tamanhos de produtos DE PCR mtDNA e produtos PCR genômicos. Um oócito bovino tinha um número médio de cópia mtDNA (± desvio padrão) de 137.904 ± 94.768 (n = 38). Um ooplasto empobrecido por mitocôndrias tinha um número médio de cópia mtDNA de 8.442 ± 13.806 (n = 33). As cópias médias de mtDNA presentes em um ooplasto rico em mitocôndrias foram de 79.390 ± 58.526 cópias mtDNA (n = 28). As diferenças entre essas médias calculadas indicam que a centrifugação e a biseção subsequente podem diminuir significativamente os números de cópias de MTDNA presentes no ooplasto empobrecido por mitocôndrias quando comparado com o oócito original (P < 0,0001, determinado pela ANOVA unidirecional). A redução do dNH deve diminuir o grau de heteroplasmia mitocondrial em um embrião reconstruído, possivelmente promovendo o desenvolvimento embrionário e fetal padrão. A suplementação com extrato mitocondrial da célula doador somática também pode ser essencial para alcançar o desenvolvimento embrionário bem sucedido.

Introdução

A transferência nuclear de células somáticas (SCNT) inclui a fusão de um oócito enucleado de um animal e uma célula somática de um animal da mesma espécie. Na maioria dos casos, o oócito e a célula somática são originários da mesma espécie, e as taxas de natalidade viva estão abaixo de 6%¹. Algumas pesquisas envolvem o uso de interespécies SCNT (iSCNT), que inclui a fusão de uma célula somática e oócito que se originam de duas espécies diferentes. Nesses estudos, as taxas de natalidade ao vivo são ainda menores do que no SCNT- tipicamente inferior a 1%¹. No entanto, o iSCNT tem a capacidade de ser usado como método de re....

Protocolo

O seguinte protocolo segue as diretrizes de cuidado e ética dos animais fornecidas pela Universidade Estadual de Utah.

1. Preparação da mídia

1. Antes do manuseio de oócitos, prepare as seguintes soluções, conforme descrito na Tabela 1: 400 μL da Solução Hyaluronidase, 500 μL de mídia T2, 1.020 μL de mídia T20 e 800 μL de mídia T10.
2. Divida a mídia T10 em dois poços de uma placa de quatro poços, 400 μL por poço. Rotule um bem com "M" e o segundo bem com "MR". Coloque em uma incubadora de CO_{2 de} 5% até depois da biseção.
3. Prepare 500 μL de Citochalasina B (CB)/Fluido Ovidu....

Resultados

Os resultados quantitativos de PCR (qPCR) são utilizados para determinar as quantidades relativas de mtDNA presentes em cada ooplasto. A reação descrita foi projetada para amplificar a região 12S do mtDNA bovino.

Se a biseção foi bem sucedida, as amostras de oócitos inteiros e ooplastos mitocôndrias-densas terão valores C_t semelhantes. As amostras de ooplastos reduzidos por mitocôndrias terão valores C_t mais elevados quando comparadas com as amostras dos outros dois grupo.......

Discussão

Métodos anteriormente utilizados para diminuir o número de cópias de MTDNA em oócitos têm suas respectivas desvantagens. A remoção baseada em micromanipulação de mitocôndrias de oócitos diminui os números de cópias de MTDNA em uma média de 64%²⁷. Um método único, anteriormente utilizado para a enucleação, envolve o uso de pipetas Pasteur de pequeno diâmetro e a divisão de um oócito zona pellucida na fronteira entre uma microdrop de mídia e o óleo mineral circundante. Juntamente com a utilização da.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de centrífuga de 1,5 mL	Fisher Scientific	5408129
prato de 60 mm	Sigma-Aldrich	D8054
Centrífuga	Eppendorf	5424
Citocalasina B	Sigma-Aldrich	C6762
Soro Fetal Bovino	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Mídia	Sigma-Aldrich	M4530
Óleo mineral	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrífuga	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Direto (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverso (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Espectrofotômetro	Thermo Scientific	ND2000
Bisturi Oftálmico com Cabo de Alumínio	PFM Medical	207300633	Microblade para bissecção
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 - 96-Poços 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Placa de busca	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Fluido Oviductal Sintético com HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Estágio de aquecimento