Ensaio gravitaxis em larga escala de Larvas de Caenorhabditis Dauer

Resumo

O presente protocolo descreve métodos para a realização de um ensaio gravitaxis em larga escala com larvas dauer Caenorhabditis . Este protocolo permite uma melhor detecção do comportamento gravitaxis em comparação com um ensaio baseado em placas.

Resumo

A sensação da gravidade é um processo importante e relativamente subestudado. A percepção da gravidade permite que os animais naveguem em seus arredores e facilite o movimento. Além disso, a sensação gravitacional, que ocorre no ouvido interno dos mamíferos, está intimamente relacionada à audição - assim, entender esse processo tem implicações para pesquisas auditivas e vestibulares. Ensaios gravitaxis existem para alguns organismos modelo, incluindo drosophila. Worms únicos já foram avaliados por sua preferência de orientação à medida que se instalam em solução. No entanto, um ensaio confiável e robusto para caenorhabditis gravitaxis não foi descrito. O presente protocolo descreve um procedimento para a realização de ensaios gravitaxis que podem ser usados para testar centenas de dauers caenorhabditis de cada vez. Este ensaio de longa distância e em larga escala permite a coleta detalhada de dados, revelando fenótipos que podem ser perdidos em um ensaio padrão baseado em placas. O movimento de Dauer ao longo do eixo vertical é comparado com controles horizontais para garantir que o viés direcional seja devido à gravidade. A preferência gravitactic pode então ser comparada entre cepas ou condições experimentais. Este método pode determinar requisitos moleculares, celulares e ambientais para gravitaxis em vermes.

Introdução

Sentir a atração gravitacional da Terra é crucial para a orientação, movimento, coordenação e equilíbrio de muitos organismos. No entanto, os mecanismos moleculares e o neurocircuito da sensação gravitacional são mal compreendidos em comparação com outros sentidos. Em animais, a sensação de gravidade interage e pode ser superada por outros estímulos para influenciar o comportamento. Pistas visuais, feedback proprioceptivo e informações vestibulares podem ser integrados para gerar uma sensação de consciência corporal em relação ao entorno de um animal ^1,2. Por outro lado, a preferência gravitactica pode ser alt....

Protocolo

As cepas utilizadas no presente estudo são C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (ver Tabela de Materiais). Uma população de dauers de sexo misto foi usada para cada ensaio.

1. Preparação da câmara

1. Trabalhe em um capuz de fumaça. Configure o espaço de trabalho com um queimador Bunsen, 1-2 lâminas de barbear, alicates, pinças e uma superfície de corte de plástico (ver Tabela de Materiais).
2. Para cada câmara, reúna duas pipetas sorológicas de 5 mL. Remova o plugue de algodão de uma pipeta com pinça. Segure uma lâmina de barbear sobre o queimador Bunsen até ....

Resultados

Comparando gravitaxis entre espécies
Seguindo o procedimento descrito acima, C. briggsae dauer gravitaxis pode ser comparado com C. elegans gravitaxis e controles horizontais. A distribuição vertical (marrom) de dauers C. briggsae é inclinada em direção ao topo das câmaras, com uma grande porcentagem de vermes atingindo +7 (Figura 2A). Contrastada com controles horizontais (aqua), em que os dauers são distribuídos em uma curva em forma de sino a.......

Discussão

Comparação com métodos anteriores
Ao contrário da quimiotaxis, a gravitaxis em Caenorhabditis não pode ser observada de forma confiável usando um design experimental tradicional de placa de ágar. Uma placa de Petri padrão tem 150 mm de diâmetro, resultando em apenas 75 mm disponíveis em qualquer direção para dauers demonstrarem preferência gravitaxis. Embora a preferência orientacional de C. elegans possa ser avaliada na solução¹², este método é de baixa produ.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
		Dodecil Sulfato de Sódio a 1%	Do estoque 10% (p/v) SDS em água DI
15 mL Tubos de centrífuga	Falcon	14-959-53A
3 mm Chave			Outras ferramentas de metal de tamanho semelhante podem ser usadas
4% Agar em Meio de Crescimento Normal (NGM) - 1 L			Antes da autoclavagem: 3 g de NaCl, 40 g de ágar, 2,5 g de peptona, 2 g de dextrose, 10 mL de uracila (2 mg / mL), 500 μ L Colesterol (10 mg/mL), 1 mL de CaCl2, 962 mL DI de água; Após autoclavagem: 24,5 mL de tampão fosfato, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL de estreptomicina (200 mg/mL)
5 mL de pipetas sorológicas	Fisherbrand	S68228C	poliestireno, não vidro borossilicato
60% Solução			60% sacarose (p/v) em água DI; esterilizar por filtração (0,45 μ m). Manter em 4 ° C
AF16 C. briggsae ou outra cepa			Disponível no CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bico
Filme plástico	Fisherbrand	22-305654
Centrífuga
Lâminas de barbear descartáveis	Fisherbrand	12-640
		de Faraday	Pode ser construída usando papelão e folha de alumínio; 30" L x 6" W x 26" H ou maior
Marcadores			Sharpie ou outra marca para marcação em plástico
Fita de rotulagem	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans cepa			CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
com ágar OP50			1,7% (p/v) em NGM (ver descrição: ágar 4% em NGM). Semente com filme de parafina OP50
	Bemis	13-374-10
Tábua
Alicate
Misturador vertical rotativo	BTLab SYSTEMS	BT913	Com barra de tubo de 22 x 15 mL
Pipetador sorológico	Corning	357469
Microscópio Estéreo	Laxco	S2103LS100
Contador	de contas ULINE	H-7350
Espessura NGM/meio de placa de ágar - 1 L			Ver 4% de ágar na receita NGM; substitua 40 g de ágar por 20 g
de pinça de

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