O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
CRISPR/Cas9 é uma ferramenta de edição de genes altamente versátil e eficiente adotada amplamente para corrigir várias mutações genéticas. A viabilidade da manipulação gênica de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) in vitro torna os HSPCs uma célula-alvo ideal para a terapia gênica. No entanto, os HSPCs perdem moderadamente seu potencial de enxerto e repovoamento de multilinhagem em cultura ex vivo. No presente estudo, são descritas condições ideais de cultura que melhoram o enxerto de HSPC e geram um aumento do número de células geneticamente modificadas in vivo. O relatório atual exibe condições de cultura in vitro otimizadas, incluindo o tipo de meio de cultura, suplementação exclusiva de coquetéis de pequenas moléculas, concentração de citocinas, placas de cultura celular e densidade de cultura. Além disso, um procedimento otimizado de edição de genes do HSPC, juntamente com a validação dos eventos de edição de genes, são fornecidos. Para validação in vivo , a infusão de HSPCs editados por genes e a análise pós-enxerto em receptores de camundongos são exibidas. Os resultados demonstraram que o sistema de cultura aumentou a frequência de HSCs funcionais in vitro, resultando em enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.
Introdução
A inacessibilidade a doadores pareados com antígeno leucocitário humano (HLA) em ambientes de transplante alogênico e o rápido desenvolvimento de ferramentas de engenharia genética altamente versáteis e seguras tornam o transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TCTH) uma estratégia de tratamento curativo para os hemodistúrbios hereditários 1,2. A terapia gênica autóloga com células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) envolve a coleta de HSPCs dos pacientes, manipulação genética, correção de mutações causadoras de doenças e transplante de HSPCs corrigidos por genes no paciente
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Experimentos in vivo em camundongos imunodeficientes foram aprovados e realizados seguindo as diretrizes do Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, Índia. Amostras de sangue periférico mobilizadas pelo fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) foram coletadas de doadores humanos saudáveis com consentimento informado após a aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB).
1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) e purificação de células CD34+
- Execute o isolamento PBMNC seguindo as etapas abaixo.
NOTA: Para a cu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O presente estudo identifica condições ideais de cultura HSPC que facilitam a retenção de HSCs CD34+CD133+CD90+ em cultura ex vivo. Para demonstrar o enriquecimento cultural de HSCs, juntamente com a geração aprimorada de HSCs modificadas por genes, são fornecidos os procedimentos otimizados para isolamento de PBMNC, purificação de células CD34+, cultura, edição de genes, transplante, caracterização de enxerto e células modificadas por genes in vivo (
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O resultado bem-sucedido da terapia gênica com HSPC depende predominantemente da qualidade e quantidade de HSCs enxertáveis no enxerto. No entanto, as propriedades funcionais das HSCs são altamente afetadas durante a fase preparatória dos produtos de terapia gênica, inclusive pela cultura in vitro e toxicidade associada ao procedimento de manipulação gênica. Para superar essas limitações, identificamos condições ideais de cultura de HSPCs que retêm a caule de HSCs CD34+CD133+CD90+
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não existem interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores querem reconhecer a equipe da instalação de citometria de fluxo e da instalação animal da CSCR. A. C. é financiado por uma bolsa ICMR-SRAF, K. V. K. é financiado por uma bolsa DST-INSPIRE e P. B. é financiado por uma bolsa CSIR-JRF. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia (subvenção n.º BT/PR26901/MED/31/377/2017 e BT/PR31616/MED/31/408/2019)
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4D-Nucleofector® X Unidade | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ Kit X (16-well Nucleocuvette™ Tiras) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiótico-Antimicótico (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-humano CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-humano CD13 PE | BD BIOSCIENCE | ||
| Anti-humano CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | ||
| Anti-humano CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-humano CD90 APC | BD BIOSCIENCE | ||
| Anti-humano CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-humano CD34 PE | BD BIOSCIENCE | ||
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Irradiador de Sangue-2000 | BRIT (Departamento de Biotecnologia, Índia) | BI 2000 | |
| Placa de cultura de células (placas de 6 poços tratadas com superfície delta) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | ||
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinante Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Tubo de centrífuga-15ml | CORNING | 430790 | |
| Tubo de centrífuga-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | ||
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′ s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Kit de Seleção Positiva Humana CD34 II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| Ímã EasySep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Unidade de eletroforese | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | ||
| Citômetro de fluxo - ARIA III | BD BIOCIÊNCIA- | ||
| FlowJo | BD BIOSCIENCE& | nbsp;- | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Sistema de imagem em gel | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| Reagente HighPrep DTR | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Bloco BD Fc Humano | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM mídia | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Lâmpada infravermelha | Seringa | de | |
| insulina MURPHY 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | ||
| Cetamina | KETMIN 50-Carregamento | ||
| corante 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Restritor de camundongos | AVANTOR | TV-150 | |
| THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | ||
| Câmara de contagem de células Neubauer | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD. Cg-Prkdcscid Il2RGTM1Wjl/SzJ (NSG) | O Laboratório Jackson | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6. SCID Il2rγ &menos;/&menos; KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Placa de 6 poços Nunc delta | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Tubo de fundo redondo de poliestireno | BD | 352008 | |
| P3 solução de nucleofecção de células primárias | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pipeta Pasteur | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| Kit de limpeza de PCR | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Gaiola de torta de rato | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| tubo de fundo redondo de poliestireno (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| Extração rápida™ Solução de Extração de DNA | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| Ferramenta de análise ICE | SYNTHEGO | a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA tampão solução (TE) 1X | SYNTHEGO | Fornecido com gRNA | |
| Termociclador | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Azul de tripano | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xilazina | XILAXINA - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - |
Referências
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).
- Naldini, L. G....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
