Artigo de método

Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis

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DOI:

10.3791/64075

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3 de março de 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

As células T e ILC2 que expressam IL-9 são induzidas durante a infecção por N. brasiliensis , mas sua caracterização tem sido amplamente negligenciada no intestino infectado devido à sua baixa frequência e cinética diferencial. Este protocolo descreve o isolamento dessas células de diferentes órgãos-alvo e a confirmação de sua identidade via citometria de fluxo em diferentes estágios de infecção.

Resumo

A IL-9 é uma citocina pleiotrópica associada a vários processos, incluindo imunidade antitumoral, indução de patologias alérgicas e resposta imune contra infecções por helmintos, onde desempenha um papel importante na expulsão do parasita. Em um modelo murino de infecção por Nippostrongylus brasiliensis, a IL-9 é produzida principalmente por linfócitos T CD4+ e células linfoides inatas encontradas no pulmão, intestino delgado e linfonodos drenantes. Dadas as dificuldades técnicas envolvidas na coloração intracelular da IL-9, bem como a complexidade de isolar células hematopoiéticas do intestino delgado após a infecção, há uma necessidade premente de um protocolo abrangente, mas direto, para analisar a expressão de IL-9 em diferentes tecidos linfoides e não linfoides neste modelo. O protocolo aqui descrito descreve a cinética da IL-9 produzida pelas células T CD4+ e pelas células linfoides inatas no pulmão e intestino delgado, os principais órgãos visados pelo N. brasiliensis, bem como nos linfonodos mediastinais e mesentéricos, durante toda a infecção. Além disso, detalha o número de larvas necessárias para a infecção, dependendo do tipo de célula e órgão de interesse. Este protocolo tem como objetivo auxiliar na padronização de ensaios para economizar tempo e recursos, oferecendo a oportunidade de focar nas células, órgãos e estágios específicos da doença de interesse no modelo de infecção por N. brasiliensis.

Introdução

Os ancilostomídeos são parasitas intestinais que infectam aproximadamente 700 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente em áreas tropicais em países subdesenvolvidos. Infecções de alta intensidade por Ancylostoma duodenale e Necator americanus, os parasitas ancilostomídeos mais comuns em humanos, causam anemia e deficiência proteica que podem resultar em atraso no crescimento e desenvolvimento mental1. N. americanus e o parasita roedor Nippostrongylus brasiliensis induzem uma resposta imune prototípica tipo 2 em seu hospedeiro e compartilham semelhanças em seu ciclo de vida. Assim, a infecção de camundongos com N. brasiliensis é o modelo mais comumente utilizado para infecções por ancilostomídeos humanos. Larvas infecciosas de N. brasiliensis em estágio 3 (L3) movem-se da pele para o pulmão nas primeiras horas pós-infecção. Uma vez no pulmão, eles se tornam L4 e migram para cima da traqueia para serem engolidos, passam pelo estômago e atingem o intestino para se tornarem adultos (L5) dentro de 4-5 dias. No intestino, os vermes L5 põem ovos que são excretados nas fezes para reiniciar o ciclo de vida do parasita2.

A resposta imune induzida por N. brasiliensis é caracterizada por um aumento em várias citocinas tipo 2, incluindo IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, juntamente com eosinofilia, basofilia, hiperplasia caliciforme e mastócitos e aumento da produção de IgG1 e IgE. A maioria dos estudos que tentam identificar e definir as respostas imunes provocadas na infecção por N. brasiliensis está centrada no papel da IL-4 ou IL-13 nesse modelo3. No entanto, a identificação e caracterização de células que expressam IL-9 e a função desta citocina foram amplamente negligenciadas, até que Licona-Limón et al. publicaram o primeiro estudo demonstrando um papel crítico para a IL-9 na resposta imune contra N. brasiliensis. Usando camundongos repórteres, este estudo descreveu as células T (principalmente o T helper 9) e as células linfoides inatas do tipo 2 (ILC2s) como os principais subconjuntos celulares que expressam IL-9 após a infecção4.

O isolamento e a caracterização de células imunes de pulmões infectados por helmintos são viáveis e têm sido amplamente relatados 3,4. No entanto, devido ao inerente remodelamento tecidual e à produção de muco, fazê-lo no intestino infectado mostrou-se um desafio técnico, até a recente publicação de Ferrer-Font et al.5. O grupo delineou um protocolo para isolar e analisar suspensões unicelulares de subconjuntos imunológicos de intestinos murinos infectados por Heligmosomoides polygyrus. Com base nisso, padronizamos agora um protocolo para isolamento e análise citométrica de células linfoides expressas de IL-9 do intestino infectado por N. brasiliensis. Além disso, estabelecemos a cinética da IL-9 a partir de diferentes fontes celulares e locais anatômicos durante toda a infecção.

Caracterizar as distintas populações celulares envolvidas nesta infecção é vital para uma compreensão mais ampla da resposta imune ao parasita e sua interação com o hospedeiro. Este protocolo abrangente fornece uma rota clara para isolar e analisar células produtoras de IL-9 dos órgãos desejados em estágios de doença de interesse, permitindo uma melhoria acentuada do conhecimento sobre o papel dessas células na infecção por N. brasiliensis e infecções parasitárias em geral.

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Protocolo

Todos os experimentos em animais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Interno de Manejo Animal (CICUAL) do Instituto de Fisiologia Celular da Universidade Nacional Autônoma do México.

NOTA: Um fluxograma de todo o protocolo é mostrado na Figura 1.

1. Alojamento de ratos

  1. Use grupos de camundongos de 8 a 10 semanas de idade, fêmeas ou machos, alojados em instalações para animais com temperatura e umidade constantes em ciclos claros/escuros de 12 h, com acesso ad libitum a água e alimentos.
    NOTA: Este protocolo utiliza uma estirpe de rato reportador IL-9 em fundo C57BL/6, conforme descrito anteriormente4; no entanto, outras cepas de IL-9 reportadoras poderiam ser utilizadas 6,7,8, bem como a coloração intracelular de IL-9, com resultados variáveis 9.

2. Infecção de camundongos

  1. Raspe as costas dos ratos do meio do corpo para perto da base da cauda 1 dia antes da infecção. O uso de anestésicos não é essencial.
  2. Inocular por via subcutânea cada camundongo com 200 larvas viáveis de N. brasiliensis (L3) de terceiro estágio em 100 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS)10 na parte inferior das costas, conforme descrito anteriormente 2,11, ou injetar 100 μL de PBS isoladamente como controle. Sacrifique os animais no dia 4, dia 7 ou dia 10 pós-infecção.

3. Isolamento dos linfonodos pulmonares, intestino delgado, mediastinal e mesentérico

  1. Eutanasiar o rato por luxação cervical. Coloque o rato de costas e pulverize-o com etanol a 70%. Faça uma incisão na linha média usando uma tesoura e abra a pele para expor as áreas abdominal e torácica.
    NOTA: O isoflurano pode ser utilizado como método alternativo de eutanásia12. Câmaras de dióxido de carbono não são recomendadas, pois o CO2 leva a danos nos tecidos pulmonares e hemorragia13.
  2. Isolamento de linfonodos mediastinais e pulmões
    1. Faça uma incisão no esterno e corte em forma de "V" para remover as costelas e os músculos torácicos. Uma vez que a cavidade torácica esteja exposta, localize os linfonodos mediastinais próximos ao esôfago, abaixo do coração (ver Figura 1 Suplementar).
    2. Extrair os linfonodos mediastinais e coletá-los em 1 mL de meio R-10 (Tabela 1) em placa de cultura de 12 poços. Manter no gelo, protegido da luz até o processamento.
      NOTA: As amostras devem ser protegidas da luz, para evitar diminuir o sinal fluorescente dos ratos repórteres usados nesses experimentos.
    3. Extraia os pulmões e colete-os em 1 mL de meio R-10 em uma placa de cultura de 12 poços por rato. Manter no gelo, protegido da luz até o processamento.
  3. Isolamento das cadeias linfonodais mesentéricas e do intestino delgado
    1. Exponha a cavidade peritoneal e mova cuidadosamente o intestino delgado para a direita para expor a cadeia do linfonodo mesentérico (MLN) ao longo do cólon.
    2. Usando fórceps, remova o MLN, enrole-o suavemente em uma toalha de papel e retire a gordura.
    3. Transfira o MLN para 1 mL de meio R-10 em uma placa de cultura de 12 poços. Manter no gelo, protegido da luz até o processamento.
    4. Corte o intestino delgado logo abaixo do esfíncter pilórico e acima do ceco. Puxe o intestino para fora lentamente com a ajuda de fórceps, removendo o mesentério e o tecido adiposo ligados.
    5. Coloque o intestino delgado em uma toalha de papel e umedeça-o generosamente com PBS. Remova as manchas de Peyer do intestino delgado com uma tesoura.
      NOTA: Para manter a viabilidade, remova o tecido adiposo restante e mantenha o intestino delgado úmido com PBS durante todo o processo.
    6. Corte o intestino delgado longitudinalmente usando uma tesoura e deslize suavemente a pinça sobre o intestino aberto para remover o conteúdo fecal e o muco.
    7. Segure o intestino delgado com fórceps e lave-o em 5 mL de PBS no gelo, submergindo-o cuidadosamente algumas vezes. Repita duas vezes.
    8. Cortar o intestino delgado em pedaços curtos (aproximadamente 5 mm) e coletá-los em tubo cônico de 50 mL com 10 mL de HBSS14 com FBS a 2% (Tabela 1). Imediatamente continuar a isolar células intraepiteliais e lâmina própria.

4. Preparação de suspensões unicelulares do intestino delgado, pulmão e gânglios linfáticos

NOTA: É extremamente importante processar um máximo de seis ratos por pessoa ao preparar suspensões unicelulares do intestino delgado, pois a viabilidade celular diminui significativamente com períodos de processamento mais longos. Este método foi adaptado do Heligmosomoides polygyrus infection mouse modelo5.

  1. Pré-aqueça a incubadora de agitação, o meio R-20, o HBSS e o HBSS-2 mM EDTA (Tabela 1) a 37 °C.
  2. Preparar 10 mL de meio de digestão do intestino delgado (Tabela 1) por amostra.
  3. Agitar vigorosamente os pedaços do intestino do passo 3.3.8 com a mão.
  4. Filtrar cada amostra através de uma malha de nylon (aproximadamente 10 cm x 10 cm) sobre uma ampola de vidro. Lave a amostra adicionando 10 mL de HBSS pré-aquecido sobre a malha e descarte o fluxo. Repita mais uma vez.
    NOTA: Use uma nova malha para cada amostra e reutilize-a durante todo o procedimento.
  5. Retirar a tela do funil e coletar a amostra da tela em um tubo cônico de 50 mL com 10 mL de EDTA quente HBSS-2 mM (etapa 4.1). Incubar durante 10 min a 37 °C, com agitação a 200 rpm.
  6. Vórtice por 10 s na velocidade máxima (3.200 rpm) e filtre a amostra com a malha sobre um funil de vidro, recuperando o fluxo em um tubo cônico de 50 mL.
  7. Repita as etapas 4.5 e 4.6 duas vezes, recuperando o fluxo no mesmo tubo cônico de 50 mL. As células intraepiteliais estão localizadas nesta fração de 30 mL. Salve o tecido restante.
  8. Preparação de suspensão unicelular a partir de células intraepiteliais
    1. Centrifugar os 30 mL de suspensão celular, recuperados na etapa 4.7, a 450 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT). Descarte o sobrenadante.
    2. Adicionar 5 mL de PBS e centrifugar a 450 x g por 5 min no RT. Descarte o sobrenadante.
    3. Ressuspender o pellet celular em 3 mL de RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNase (Tabela 1). Manter no gelo, protegido da luz até a coloração celular.
  9. Preparação de suspensão unicelular a partir de células de lâmina própria
    1. Lave o tecido restante do intestino delgado da etapa 4.7 derramando mais de 10 mL de HBSS quente através da malha sobre o funil. Repita a lavagem. Coletar o tecido da tela em um tubo cônico de 50 mL com 10 mL de meio de digestão do intestino delgado.
    2. Incubar durante 30 min a 37 °C, com agitação a 200 rpm. Vórtice na velocidade máxima por 10 s a cada 5 min.
    3. Adicione 10 mL de tampão FACS-EDTA (Tabela 1) para interromper a reação de digestão e coloque-a no gelo.
    4. Filtrar cada amostra através de um filtro celular de 100 μm utilizando uma pipeta serológica, recuperando a suspensão num tubo cónico de 50 ml colocado sobre gelo.
    5. Centrífuga a 600 x g durante 6 min a 4 °C.
    6. Descarte o sobrenadante. Lavar o pellet celular com 5 mL de PBS e centrifugar a 600 x g por 6 min a 4 °C.
    7. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNase. Manter no gelo, protegido da luz até a coloração celular.
  10. Preparação da suspensão unicelular a partir do pulmão
    NOTA: Cada pulmão e intestino delgado deve ser processado em paralelo por duas pessoas para evitar tempos de manuseio prolongados, o que resulta em baixa viabilidade celular.
    1. Preparar 4 mL de meio de digestão pulmonar (Tabela 1) por amostra processada.
    2. Remova o meio RPMI do poço que contém os pulmões a partir da etapa 3.2.3. Corte o pulmão em pedaços pequenos com uma tesoura fina.
    3. Transfira as peças pulmonares para um tubo cônico de 15 mL com uma espátula. Adicionar 4 mL de meio de digestão pulmonar (Tabela 1).
    4. Incubar durante 30 min a 37 °C, com agitação a 250 rpm. Quando terminar, mantenha-se no gelo até que cada amostra seja processada.
    5. Filtrar cada amostra através de um filtro celular de 100 μm, posicionado em um único poço de uma placa de cultura de 6 poços. Dissociar o tecido com um êmbolo de seringa.
    6. Recuperar cada amostra em tubo cônico de 15 mL e adicionar 4 mL de meio R-2 (Tabela 1). Mantenha-se no gelo enquanto as outras amostras são processadas.
    7. Centrífuga a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio R-5 (Tabela 1).
    8. Durante a centrifugação, preparar 4 mL de solução de gradiente de densidade a 27,5% (Tabela 1) por amostra para enriquecer a fração de células hematopoiéticas15,16. Essa estratégia de separação unicelular é mais eficiente, econômica e menos tóxica em comparação com outros meios de gradiente de densidade semelhantes17.
    9. Adicionar 4 ml de solução de gradiente de densidade a 27,5% ao 1 ml de suspensão celular a partir da etapa 4.10.7 e agitar vigorosamente.
    10. Adicione lentamente 1 mL de meio R-5 (Tabela 1) em cima da suspensão mista para criar duas fases.
    11. Centrífuga a 1.500 x g por 20 min em RT, com baixa aceleração e freio desligado. Observe o anel formado entre as duas fases.
    12. Recuperar o anel formado entre as duas fases com uma micropipeta de 1 mL e ressuspender em 4 mL de meio R-2.
    13. Centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em 1 mL de tampão ACK (Tabela 1) e incubar por 1 min no RT.
    14. Adicionar 4 mL de meio R-5 e centrifugar a 450 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio R-10. Manter no gelo, protegido da luz até a coloração para citometria de fluxo.
  11. Preparação da suspensão unicelular a partir dos gânglios linfáticos
    1. Colocar os gânglios linfáticos das etapas 3.2.2 ou 3.3.3 entre dois pedaços de malha num poço a partir de uma placa de cultura de 6 poços e dissociar com um êmbolo de seringa.
    2. Recuperar a suspensão celular num tubo cónico de 1,5 ml e centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio R-10. Manter no gelo, protegido da luz até a coloração para citometria de fluxo.
      NOTA: Se os aglomerados estiverem visíveis, filtre a amostra através de um filtro celular de 100 μm.

5. Coloração celular para citometria de fluxo (Figura 2 e Figura 3)

NOTA: Centrifugar as suspensões de células linfonodais a partir do passo 4.11.3 a 450 x g durante 5 min a 4 °C e ressuspender o pellet celular em 500 μL de tampão FACS (Tabela 1).

  1. Coloração celular para identificação de ILC2s (Figura 3 e Figura 2 Suplementar)
    NOTA: Este procedimento de coloração é específico para a identificação de células ILC2 que expressam IL-9.
    1. Placa de 150 μL por amostra de pulmão (aproximadamente 1,8 x 10 6 células) da etapa 4.10.14 e 50 μL por amostra de linfonodo da etapa 4.11.3 (aproximadamente 0,7 x 10 6 e 2,2 x 106 células para amostras de linfonodos mediastinais e mesentéricos, respectivamente) em uma placa de cultura inferior cônica de 96 poços. Adicionar 100 μL de tampão FACS e centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    2. Placa de 100 μL por amostra de intestino delgado (aproximadamente 2,7 x 10 6 e 0,6 x 106 células para amostras intraepiteliais e de lâmina própria, respectivamente) das etapas 4.8.3 e 4.9.7 em uma placa de cultura de fundo cônica de 96 poços. Adicionar 150 μL de tampão FACS e centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda cada pellet celular em 50 μL do coquetel de anticorpos biotinilados (Tabela 2) diluído em tampão FACS. Incubar durante 30 min a 4 °C protegido da luz.
      NOTA: Use tampão FACS com 20 μg/mL de DNase para amostras intraepiteliais e lâmina própria.
    4. Adicione 150 μL de buffer FACS. Centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão FACS. Centrifugar novamente e descartar o sobrenadante.
    6. Ressuspender o pellet celular em 50 μL do cocktail anticorpo/mancha (Tabela 2) e incubar durante 30 minutos a 4 °C protegido da luz.
    7. Adicione 150 μL de buffer FACS. Centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão FACS. Centrifugar novamente e descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem (passo 5.1.7) e eliminar o sobrenadante.
    9. Ressuscite o pellet celular em 300 μL de tampão FACS e analise por citometria de fluxo.
    10. Para as amostras de intestino delgado e pulmão, use a estratégia de bloqueio: linfócitos, células únicas, células vivas, células hematopoiéticas, células CD90+Linhagem, células ST2+ e células IL-9+ (Figura 3A,B e Figura 2A Suplementar). Para as amostras de linfonodos, use a estratégia de deformação: células vivas, células únicas, células CD90+ de linhagem, células ST2+ e células IL-9+ (Figura suplementar 2B,C).
  2. Coloração celular para identificação de linfócitos produtores de IL-9 (Figura 2 e Figura 3 Suplementar)
    1. Transfira 800 μL por amostra de pulmão da etapa 4.10.14 para um tubo de 1,5 mL (aproximadamente 14,6 x 106 células). Centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
    2. Para amostras de linfonodos, placa de 400 μL da suspensão celular da etapa 4.11.3 (aproximadamente 5,6 x 10 6 e 17,5 x 106 células para amostras de linfonodos mediastinais e mesentéricos, respectivamente) em uma placa inferior cônica de 96 poços em duas etapas.
      1. Transferir primeiro 200 μL, centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
      2. Transfira mais 200 μL para o poço correspondente. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
    3. Ressuspender o pellet celular em 50-400 μL do cocktail anticorpo/mancha (Tabela 3) e incubar durante 30 minutos a 4 °C protegido da luz.
      NOTA: As amostras de pulmão devem ser ressuspensas em 400 μL, as amostras de linfonodos mediastinais em 50 μL e as amostras de linfonodos mesentéricos em 100 μL do coquetel de coloração.
    4. Adicionar 150 μL de tampão FACS às amostras de linfonodos mediastinais e 100 μL às amostras de linfonodos mesentéricos. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
    5. Lave as amostras de pulmão e linfonodos ressuspendendo os pellets em 1 mL e 200 μL de tampão FACS, respectivamente. Centrífuga a 450 xg durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e repita a lavagem.
    6. Ressuspender as amostras pulmonares em 600 μL de tampão FACS e analisá-las por citometria de fluxo. Use a estratégia de gating: linfócitos, células únicas, células vivas, células hematopoiéticas, células CD4+TCRβ+ e células IL-9+ (Figura 2A).
    7. Ressussuscite as amostras de linfonodos em 300 μL de tampão FACS e analise por citometria de fluxo. Use a estratégia de deformação: linfócitos, células únicas, células vivas, células CD4+ TCRβ+ e células IL-9+ (Figura 2B e Figura Suplementar 3A).

6. Determinação do número absoluto de células em suspensões unicelulares

  1. Diluir as amostras das etapas de isolamento 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 e 4.11.3 com PBS na proporção de 1:20 (10 μL de amostra + 190 μL de PBS).
  2. Misturar 10 μL de cada amostra diluída da etapa 6.1 com 10 μL de azul de tripano. Carregar 10 μL em um hemocitômetro e contar as células vivas, considerando cada diluição.
  3. Obter o número absoluto de células multiplicando a porcentagem da população de interesse de células vivas determinada por citometria de fluxo (células negativas de corante de viabilidade) pelo número total de células vivas na suspensão unicelular após o isolamento e dividindo esse número por 100 (Figura Suplementar 4, Figura Suplementar 5 e Figura Suplementar 6).
    Número absoluto = (Percentagem da população de interesse de células vivas determinada por citometria de fluxo x Número total de células vivas na suspensão unicelular)/100

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Resultados

Os camundongos foram injetados por via subcutânea com larvas de N. brasiliensis do estágio 200 L3 ou com PBS para controles simulados. O número de larvas utilizadas neste protocolo foi ajustado para isolar células viáveis dos pulmões, tecido linfoide e intestino delgado, ao contrário de relatos anteriores, onde cargas mais elevadas de vermes foram utilizadas para detectar células em tecidos linfoides e pulmões apenas4. Pulmões, linfonodos mediastinais, linfonodos mesentéricos e intestino ...

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Discussão

Uma compreensão completa das interações parasita-hospedeiro intestinal e das respostas imunes à infecção por helmintos requer a identificação e análise das diferentes populações celulares e moléculas efetoras que são fundamentais para a indução da remodelação tecidual e expulsão de vermes. As infecções por helmintos transmitidas pelo solo representam um grande problema nos países em desenvolvimento em todo o mundo. No entanto, até recentemente, nãoestava disponível um protocolo que permitisse a an...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a José Luis Ramos-Balderas pelo seu apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela seguinte subvenção à PLL da CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P e EO-M receberam uma bolsa da CONACYT (736162 e 481437, respectivamente). MCM-M recebeu uma bolsa da CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Buffer ACKCitômetro Attune
Thermofisher
B220Biolegend103204
CD11bBiolegend101204
CD11c Biolegend117304
CD19 Biolegend115504
CD4Biolegend100404
CD4 (BV421)Biolegend100443
CD45.2Biolegend109846
CD8 Biolegend100703
CD90.2Biolegend105314
Colagenase DRoche11088866001
DNAse IInvitrogen18068015Atividade específica: ≥ 10 000 unidades/mg     
Classificador FACS ARIA IIBD Biosciences
FACS Classificador de células MelodyBD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
Fcε RIeBioscience13589885
Soro fetal bovinoGibco26140079
FlowJo FlowJoSoftware de dados de análise de citometria de fluxo
Gr-1Tonbo305931
Hanks Solução salina balanceada (HBSS)
IL-9biolegend514103
NK1.1& nbsp;Biolegend108704
Malha de nylon  ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep Gradiente de Densidade MédioSigmaD1556
Solução salina tamponada com fosfato RPMI Gibco Caseiro
11875093
Siglec F Biolegend155512
StreptavidinBiolegend405206
TCR-β  Biolegend109203
TCR-β (PE/Cy7)Biolegend109222
TCR-&gama; δ  Biolegend118103
Ter119Biolegend116204
Tampão tricinal Corante de
Biolegend423101
Nxt caseiro Caseiro Viabilidade Fixável Aqua Zumbi Caseiro

Referências

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  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
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