As células T e ILC2 que expressam IL-9 são induzidas durante a infecção por N. brasiliensis , mas sua caracterização tem sido amplamente negligenciada no intestino infectado devido à sua baixa frequência e cinética diferencial. Este protocolo descreve o isolamento dessas células de diferentes órgãos-alvo e a confirmação de sua identidade via citometria de fluxo em diferentes estágios de infecção.
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Artigo de método
Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A IL-9 é uma citocina pleiotrópica associada a vários processos, incluindo imunidade antitumoral, indução de patologias alérgicas e resposta imune contra infecções por helmintos, onde desempenha um papel importante na expulsão do parasita. Em um modelo murino de infecção por Nippostrongylus brasiliensis, a IL-9 é produzida principalmente por linfócitos T CD4+ e células linfoides inatas encontradas no pulmão, intestino delgado e linfonodos drenantes. Dadas as dificuldades técnicas envolvidas na coloração intracelular da IL-9, bem como a complexidade de isolar células hematopoiéticas do intestino delgado após a infecção, há uma necessidade premente de um protocolo abrangente, mas direto, para analisar a expressão de IL-9 em diferentes tecidos linfoides e não linfoides neste modelo. O protocolo aqui descrito descreve a cinética da IL-9 produzida pelas células T CD4+ e pelas células linfoides inatas no pulmão e intestino delgado, os principais órgãos visados pelo N. brasiliensis, bem como nos linfonodos mediastinais e mesentéricos, durante toda a infecção. Além disso, detalha o número de larvas necessárias para a infecção, dependendo do tipo de célula e órgão de interesse. Este protocolo tem como objetivo auxiliar na padronização de ensaios para economizar tempo e recursos, oferecendo a oportunidade de focar nas células, órgãos e estágios específicos da doença de interesse no modelo de infecção por N. brasiliensis.
Introdução
Os ancilostomídeos são parasitas intestinais que infectam aproximadamente 700 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente em áreas tropicais em países subdesenvolvidos. Infecções de alta intensidade por Ancylostoma duodenale e Necator americanus, os parasitas ancilostomídeos mais comuns em humanos, causam anemia e deficiência proteica que podem resultar em atraso no crescimento e desenvolvimento mental1. N. americanus e o parasita roedor Nippostrongylus brasiliensis induzem uma resposta imune prototípica tipo 2 em seu hospedeiro e compartilham semelhanças em seu ciclo de vida. Assim, a infecção de camu....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Interno de Manejo Animal (CICUAL) do Instituto de Fisiologia Celular da Universidade Nacional Autônoma do México.
NOTA: Um fluxograma de todo o protocolo é mostrado na Figura 1.
1. Alojamento de ratos
- Use grupos de camundongos de 8 a 10 semanas de idade, fêmeas ou machos, alojados em instalações para animais com temperatura e umidade constantes em ciclos claros/escuros de 12 h, com acesso ad libitum a água e alimentos.
NOTA: Este protocolo utiliza uma estirpe de rato rep....
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Resultados
Os camundongos foram injetados por via subcutânea com larvas de N. brasiliensis do estágio 200 L3 ou com PBS para controles simulados. O número de larvas utilizadas neste protocolo foi ajustado para isolar células viáveis dos pulmões, tecido linfoide e intestino delgado, ao contrário de relatos anteriores, onde cargas mais elevadas de vermes foram utilizadas para detectar células em tecidos linfoides e pulmões apenas4. Pulmões, linfonodos mediastinais, linfonodos mesentéricos e intestino .......
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Discussão
Uma compreensão completa das interações parasita-hospedeiro intestinal e das respostas imunes à infecção por helmintos requer a identificação e análise das diferentes populações celulares e moléculas efetoras que são fundamentais para a indução da remodelação tecidual e expulsão de vermes. As infecções por helmintos transmitidas pelo solo representam um grande problema nos países em desenvolvimento em todo o mundo. No entanto, até recentemente, nãoestava disponível um protocolo que permitisse a an.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a José Luis Ramos-Balderas pelo seu apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela seguinte subvenção à PLL da CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P e EO-M receberam uma bolsa da CONACYT (736162 e 481437, respectivamente). MCM-M recebeu uma bolsa da CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Buffer ACK | Citômetro Attune | ||
| Thermofisher | |||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Colagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Atividade específica: ≥ 10 000 unidades/mg |
| Classificador FACS ARIA II | BD Biosciences | ||
| FACS Classificador de células Melody | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| Fcε RI | eBioscience | 13589885 | |
| Soro fetal bovino | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo FlowJo | Software de dados de análise de citometria de fluxo | ||
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Solução salina balanceada (HBSS) | |||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1& nbsp; | Biolegend | 108704 | |
| Malha de nylon | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Gradiente de Densidade Médio | Sigma | D1556 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | RPMI Gibco Caseiro | ||
| 11875093 | |||
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-&gama; δ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tampão tricinal | Corante de | ||
| Biolegend | 423101 |
Referências
- Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
- Mearns, H., et al.
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Reimpressões e permissões
