Artigo de método

Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética

DOI:

10.3791/64082

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24 de fevereiro de 2023

 ,  ,  , 
1La Jolla Institute for Immunology

Neste artigo

Resumo

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O protocolo apresenta um modelo de imunoterapia contra o câncer utilizando a vacinação tumoral baseada em células com melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Este protocolo demonstra os procedimentos, incluindo a preparação de células tumorais cultivadas, implantação tumoral, irradiação celular, medição do crescimento tumoral, isolamento de células imunes intratumorais e análise de citometria de fluxo.

Resumo

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O ligante tirosina quinase 3 semelhante ao Fms (Flt3L) é uma citocina hematopoiética que promove a sobrevivência e diferenciação de células dendríticas (DCs). Tem sido usado em vacinas tumorais para ativar a imunidade inata e melhorar as respostas antitumorais. Este protocolo demonstra um modelo terapêutico usando vacina tumoral baseada em células que consiste em células de melanoma B16-F10 expressando Flt3L, juntamente com análise fenotípica e funcional de células imunes no microambiente tumoral (TME). Procedimentos para preparação de células tumorais cultivadas, implantação de tumor, irradiação celular, medição do tamanho do tumor, isolamento intratumoral de células imunes e análise de citometria de fluxo são descritos. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um modelo pré-clínico de imunoterapia de tumores sólidos e uma plataforma de pesquisa para estudar a relação entre células tumorais e células imunes infiltrantes. O protocolo de imunoterapia aqui descrito pode ser combinado com outras modalidades terapêuticas, como bloqueio de checkpoint imunológico (anticorpos anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) ou quimioterapia, a fim de melhorar o efeito terapêutico do melanoma sobre o câncer.

Introdução

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A imunoterapia contra o câncer tem sido reconhecida como uma estratégia terapêutica promissora com base em seus efeitos colaterais menos tóxicos e respostas mais duráveis. Vários tipos de imunoterapias foram desenvolvidos, incluindo terapias com vírus oncolíticos, vacinas contra o câncer, terapias com citocinas, anticorpos monoclonais, transferência de células adotivas (células CAR-T ou CAR-NK) e bloqueio de ponto de verificação imune1.

Para vacinas contra o câncer, existem diferentes formas de vacinas terapêuticas, como vacinas baseadas em células inteiras, vacinas de proteínas ou peptídeos e vacinas de RNA ou DNA. ....

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Protocolo

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Todos os camundongos utilizados no estudo foram mantidos e alojados no biotério do Instituto de Imunologia de La Jolla (LJI) em condições específicas livres de patógenos com temperatura e umidade controladas. Experimentos em animais foram realizados com camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-14 semanas de idade de acordo com diretrizes e protocolos aprovados pelo LJI Animal Care Committee.

1. Preparação de células tumorais cultivadas para implantação

  1. Cultura de células de melanoma B16-F10 no meio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) contendo 10% de FBS inativado pelo calor, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 1....

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Resultados

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Um ponto preto visível das células B16-F10 implantadas é geralmente observado na superfície da pele ~ 3 dias após o implante do tumor. Os ratos são tratados com a vacina tumoral 3, 6 e 9 dias após o nódulo tumoral ter atingido um tamanho de ≥2 mm. Observamos uma redução significativa no crescimento tumoral no grupo de camundongos vacinados ~2 semanas após o implante do tumor (Figura 1). Ao final do experimento, isolamos as células imunes intratumorais e analisamos seu número e expressão de m.......

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Discussão

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O protocolo aqui descrito é baseado no estudo do grupo de Allison. Eles demonstraram que a combinação da vacina B16-Flt3L com o bloqueio CTLA-4 mostrou um efeito sinérgico na taxa de sobrevivência e no crescimento do tumor, enquanto nenhuma redução do crescimento tumoral foi observada em camundongos que receberam a vacina B16-Flt3L ou o tratamento com anticorpos anti-CTLA-4 isoladamente7. Estudos recentes revelaram uma nova via de sinalização CTLA4-PKCη intrínseca ao Treg que desempenha um importa.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Dr. Stephen Schoenberger por fornecer células B16-Flt3L e à equipe das instalações de citometria de fluxo e animal LJI pelo excelente suporte.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina-EDTA Gibco25200-056
10% inativado por calor FBSOmega ScientificFB-02 Lote# 209018
Agulha 30GBD Biosciences305106
placa inferior em forma de V de 96 poçosSARSTEDT83.3926.500
Linha celular B16 expressando tirosina quinase 3 ligante semelhante a Fms (B16-Flt3L)Presente do Dr. Stephen Schoenberger, LJI Os cDNAs Flt3L foram clonados no vetor retroviral pMG-Lyt2, como na referência 5, Figura suplementar 1
Linhas celulares B16-F10ATCCCRL-6475
Centrifuge 5810REppendorf
Cytofix fixation buffer BD BiosciencesBDB554655Tampão de fixação celular (4,2% PFA) 
Kit Cytofix/Cytoperm Biosciences554714Kit de Solução de Fixação/Permeabilização
DNase ISigma11284932001
Meio Eagle Modificado de Dulbecco  (DMEM) Corning10013CV
Fisherbrand14-648-17
Software FlowJo dados do citômetro TreeStar
GolgiStop (inibidor do transporte de proteínas)BD Biosciences554724diluição 1: 1500
HEPES (1M)Gibco15630-080
IonomicinaSigmaI0634
Iscove ' s Dulbecco modificado » s medium (IMDM)Thermo Fisher12440053
citômetros LSR-II BD BiosciencesCitômetro de fluxo
MEM aminoácidos não essenciaisGibco11140-050
penicilina e estreptomicina Gibco15140-122
Percoll GE Healthcare Life SciencesGE17-0891-02gradiente de densidade específico médio
PMASigmaP1585
Tampão de lise de glóbulos vermelhos Hybri-Max líquidoSigmaR7757-100ML
RPMI 1640 médioCorning10-040-CV
RS2000 Irradiador de raios-XRad Source Technologies
piruvatode sódioGibco11360-070
Filtro de células estéreis 40 μ mFisherbrand22-363-547
Filtro de células estéreis 70 μ mFisherbrand22-363-548
TL LiberaseRoche477530
Zombie Aqua kit de viabilidade fixávelBioLegend423101
Anticorpos
Anti-mCD45BioLegend103135Clone: 30-F11
Fluoróforo: BV570
Diluição: 1:200
Anti-mCD3εBioLegend100327Clone: 145-2C11
Fluoróforo: PerCP-Cy5.5
Diluição: 1:200
Anti-mCD8 BioLegend100730
100724		Clone: 53-6.7
Fluoróforo: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647
Diluição: 1:200
Anti-mCD4BioLegend100414Clone: GK1.5
Fluoróforo: APC-Cy7
Diluição: 1:200
Anti-mFoxp3de 11577382Thermo Fisher Scientific: FJK-16s
Fluoróforo: FITC
Diluição: 1:100
Clonede 372208Anti-m/hGzmB: QA16A02
Fluoróforo: PE
Diluição: 1:100
de 505826Anti-mIFNg: XMG1.2
Fluoróforo: PE-Cy7
Diluição: 1:100
Anti-mCD19BioLegend115543Clone: 6D5
Fluoróforo: BV785
Diluição: 1:100
Anti-mGr1BioLegend108423Clone: RB6-8C5
Fluoróforo: APC/Cy7
Diluição: 1:200
Anti-mCD11bBioLegend101223Clone: M1/70
Fluoróforo: Pacific blue
Diluição: 1:100
Anti-mF4/80BioLegend123114Clone: BM8
Fluoróforo: PECy7
Diluição: 1:100
Anti-mCD11cBioLegend117328Clone: N418
Fluoróforo: PerCP Cy5.5
Diluição: 1:100
Anti-mMHCIIBioLegend107622Clone: M5/114.15.2
Fluoróforo: AF700
Diluição: 1:400
Anti-mCD103BioLegend121410Clone: 2E7
Fluoróforo: Alexa Fluor 647
Diluição: 1:200
Anti-mCD86BioLegend105007Clone: GL-1
Fluoróforo: PE
Diluição: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)BD Biosciences553141Clone: 2.4G2
Diluição: 1:200
BD Paquímetro digital eletrônico Análise de Flow Clone da Clone

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M.

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