O protocolo apresenta um modelo de imunoterapia contra o câncer utilizando a vacinação tumoral baseada em células com melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Este protocolo demonstra os procedimentos, incluindo a preparação de células tumorais cultivadas, implantação tumoral, irradiação celular, medição do crescimento tumoral, isolamento de células imunes intratumorais e análise de citometria de fluxo.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ligante tirosina quinase 3 semelhante ao Fms (Flt3L) é uma citocina hematopoiética que promove a sobrevivência e diferenciação de células dendríticas (DCs). Tem sido usado em vacinas tumorais para ativar a imunidade inata e melhorar as respostas antitumorais. Este protocolo demonstra um modelo terapêutico usando vacina tumoral baseada em células que consiste em células de melanoma B16-F10 expressando Flt3L, juntamente com análise fenotípica e funcional de células imunes no microambiente tumoral (TME). Procedimentos para preparação de células tumorais cultivadas, implantação de tumor, irradiação celular, medição do tamanho do tumor, isolamento intratumoral de células imunes e análise de citometria de fluxo são descritos. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um modelo pré-clínico de imunoterapia de tumores sólidos e uma plataforma de pesquisa para estudar a relação entre células tumorais e células imunes infiltrantes. O protocolo de imunoterapia aqui descrito pode ser combinado com outras modalidades terapêuticas, como bloqueio de checkpoint imunológico (anticorpos anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) ou quimioterapia, a fim de melhorar o efeito terapêutico do melanoma sobre o câncer.
Introdução
A imunoterapia contra o câncer tem sido reconhecida como uma estratégia terapêutica promissora com base em seus efeitos colaterais menos tóxicos e respostas mais duráveis. Vários tipos de imunoterapias foram desenvolvidos, incluindo terapias com vírus oncolíticos, vacinas contra o câncer, terapias com citocinas, anticorpos monoclonais, transferência de células adotivas (células CAR-T ou CAR-NK) e bloqueio de ponto de verificação imune1.
Para vacinas contra o câncer, existem diferentes formas de vacinas terapêuticas, como vacinas baseadas em células inteiras, vacinas de proteínas ou peptídeos e vacinas de RNA ou DNA. A vacinação baseia-se na capacidade das células apresentadoras de antígenos (APCs) de processar antígenos tumorais, incluindo antígenos específicos do tumor, e apresentá-los de forma imunogênica às células T. Sabe-se que as células dendríticas (DCs) são as APCs mais potentes e acredita-se que desempenhem um papel importante na imunidade antitumoral 2,3. Essas células absorvem e processam antígenos tumorais e, em seguida, migram para os gânglios linfáticos drenantes (dLN) para preparar e ativar células efetoras T específicas do tumor (Teff) através do envolvimento do receptor de células T (TCR) e moléculas costimulatórias. Isso resulta na diferenciação e expansão das células T citotóxicas específicas do tumor (CTL), que se infiltram no tumor e matam as células tumorais4. Consequentemente, a ativação e a maturação das DO representam estratégias atraentes para estimular a imunidade contra antígenos tumorais.
Sabe-se que o Flt3L promove a maturação e expansão de CDs funcionalmente maduras que expressam as proteínas MHC classe II, CD11c, DEC205 e CD865. A administração intratumoral, mas não intravenosa, de um vetor de adenovírus incorporando o gene Flt3L (Adv-Flt3L) demonstrou promover atividade imunoterapêutica contra tumores ortrotópicos6. O Flt3L também tem sido usado em vacinas baseadas em células tumorais que consistem em células B16-F10 irradiadas expressando de forma estável o Flt3L transduzido retroviralmente como forma de melhorar a apresentação cruzada de antígenos tumorais por CDs e, assim, aumentar as respostas antitumorais. O protocolo de vacinação contra o tumor B16-Flt3L descrito aqui é baseado em um estudo publicado pelo grupo7 do Dr. James Allison. Neste artigo, eles relataram que uma vacina B16-Flt3L combinada com o bloqueio CTLA-4 induziu sinergicamente a rejeição do melanoma estabelecido, resultando em aumento da sobrevida.
O objetivo deste protocolo é fornecer um modelo de imunoterapia pré-clínica para melanoma. Aqui, procedimentos detalhados de como preparar e implantar vacinas tumorais e como analisar a composição e a função das células imunes intratumorais do tumor sólido são descritos.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os camundongos utilizados no estudo foram mantidos e alojados no biotério do Instituto de Imunologia de La Jolla (LJI) em condições específicas livres de patógenos com temperatura e umidade controladas. Experimentos em animais foram realizados com camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-14 semanas de idade de acordo com diretrizes e protocolos aprovados pelo LJI Animal Care Committee.
1. Preparação de células tumorais cultivadas para implantação
- Cultura de células de melanoma B16-F10 no meio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) contendo 10% de FBS inativado pelo calor, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 1 mM de aminoácidos não essenciais MEM e 100 U/mL de penicilina e estreptomicina. Manter a linhagem celular a 37 °C a 5% de CO2.
- Sementes 1,5-2 x 106 células B16-F10 em balão de 175T e cultura durante 2 dias. Colha as células quando elas são 75%-80% confluentes.
- Retire o meio de cultura e lave o balão uma vez com PBS. Aspirar PBS e adicionar 5 mL de tripsina-EDTA a 0,25%, seguido de bater duramente na borda do frasco de cultura.
- Adicionar 15 ml de meio de cultura para neutralizar o EDTA de tripsina e deitar o conteúdo do balão num tubo de centrífuga de 50 ml. Lave a superfície do prato com 10 mL de PBS e despeje no mesmo tubo de 50 mL.
- Centrifugar as células durante 5 min a 200 x g. Descarte o sobrenadante e quebre a pastilha celular batendo com o dedo no fundo do tubo.
- Adicionar frio 10 mL de PBS e pipetar suavemente a suspensão celular; em seguida, conte manualmente as células usando hemocitômetro. Mantenha as células no gelo antes da injeção.
2. Implantação do tumor
- O gás anestesia camundongos com isoflurano a 5% a uma taxa de fluxo de gás de 1,0 L por minuto no exaustor. Altere a taxa de fluxo para a dose de manutenção de isoflurano a 2%, uma vez que os ratos estejam totalmente anestesiados. Para este protocolo, a anestesia foi realizada pelo médico veterinário seguindo as diretrizes institucionais de cuidados e uso dos animais.
- Raspe o cabelo no flanco esquerdo dos ratos e esterilize o local da injeção usando lenços umedecidos com álcool. Implante intradérmico (i.d.) células tumorais B16-F10 em 5 x 105 células em 50 μL de PBS frio no flanco esquerdo usando uma agulha 30 G.
NOTA: A dose de células tumorais B16-F10 implantadas pode precisar ser ajustada na faixa de 0,5-5 x 105 células para o desenvolvimento bem-sucedido do tumor. - Após o implante, meça o comprimento e a largura do tumor três vezes por semana usando um paquímetro digital eletrônico. Calcule o volume do tumor (mm3) usando a fórmula:
Volume do tumor (mm3) = largura2 × comprimento × 0,5
Trate ratos com vacina contra tumores quando os tumores atingirem um tamanho de ≥2 mm.
NOTA: Os tumores geralmente podem ser medidos no dia 3 após a implantação de 5 x 105 células tumorais. Maior taxa de crescimento do tumor B16-F10 foi observada em camundongos machos C57BL/6, Rag1-/-, ou Rag2-/-γc-/-. Observação semelhante foi descrita em outros estudos8. Recomenda-se manter o gênero dos ratos consistente. No entanto, note que o NIH coloca ênfase no sexo como uma variável biológica importante na pesquisa biomédica.
3. Preparação e injeção da vacina de células B16-F10 (B16-Flt3L) que expressam Flt3L
- Manter as células B16-Flt3L em DMEM contendo 8% de FBS inativado pelo calor, 2 mM de glutamina e 100 U/mL cada de penicilina e estreptomicina a 37 °C sob 5% de CO2.
- Sementes 1 x 106 células B16-Flt3L num balão de 175T e cultura durante 2 dias. Colhem as células quando estiverem 75%-80% confluentes, conforme descrito nas etapas 1.3 a 1.6, e suspendam em 1 mL de PBS frio.
- Irradiar células na dose de 150 Gy de raios gama utilizando Irradiador de Raios X com parametrização de 160 kV e 25 mA. Conte e verifique a viabilidade celular por coloração azul de tripano antes da injeção.
- O gás anestesia os ratos conforme descrito anteriormente e esteriliza o local da injeção usando lenços umedecidos com álcool. Injetar intradermicamente os camundongos com 1 x 10 6 células B16-Flt3L irradiadas em 50 μL de PBS frio no mesmo flanco do implante tumoral original, ~1 cm de distância do local do tumor primário nos dias 3,6 e 9 após o implante celular inicial.
- Marque os locais de injeção da vacina com uma caneta colorida para distingui-la do tumor primário.
NOTA: Se 0,5 x 105 células B16-F10 forem inicialmente implantadas, recomenda-se realizar o tratamento vacinal nos dias 8, 11 e 14.
4. Isolamento intratumoral de células imunes
- Sacrificar camundongos usando CO2 e luxação cervical no exaustor no final do experimento (no dia 15 após o implante do tumor; Figura 1).
- Remova cirurgicamente o tumor com a pele de cada rato e coloque-o em placa de 24 poços com 1 mL de meio FBS/RPMI-1640 a 10%. Seque os tumores usando uma toalha de papel antes de pesá-lo.
- Corte os tumores em pequenos pedaços. Adicionar 2 mL de tampão de digestão (100 μg/mL TL Liberase e 200 μg/mL DNase I em meio RPMI-1640) e incubar por 25 min a 37 °C.
- Adicione 10 mL de 10% de meio FBS/RPMI-1640 para interromper a digestão. Transfira as células usando uma pipeta sorológica de 25 mL e use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer o tecido em um filtro celular de 40 μm.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspender o pellet em 5 mL de meio específico de gradiente de densidade de 40% em PBS, diluído para concentração de 1x).
- Adicione a suspensão celular lentamente em cima de 5 mL de meio específico de gradiente de densidade de 80% contendo PBS. Centrifugar as células a 325 x g com travagem baixa durante 23 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Após a centrifugação, coletar cuidadosamente a camada de leucócitos na interface entre 40% e 80% de meio específico de gradiente de densidade e passá-la através de um filtro celular de 40 μm. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Incubar o pellet em 2 mL de tampão de lise de hemácias (hemácias) por 5 min no RT. Após a incubação, adicione 10 mL de meio FBS/RPMI-1640 a 10% para extinguir o tampão de lise RBC.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspender as células em 0,5 mL de meio FBS/RPMI-1640 a 10% e contar o número total de células antes do uso para análise posterior.
NOTA: Coletar o baço ou dLN como controles para a estratégia de gating de subconjuntos de células imunes por análise de citometria de fluxo. Siga o método de isolamento celular descrito acima com as seguintes alterações: Use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer o tecido em um filtro de malha de 70 μm. Lave o tecido com 10% de meio FBS/RPMI-1640 para obter suspensões unicelulares. Lyse o RBC como descrito.
5. Análise da citometria de fluxo
NOTA: As células coletadas da camada de leucócitos contêm células imunes e células tumorais. Recomendam-se dois painéis de coloração independentes.
- Coloração de superfície
- Transfira as células para uma placa inferior em forma de V de 96 poços. Lave as células com PBS e manche-as com corante de viabilidade celular (50-100 μL/poço) por 15 min no RT.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Coloração dos marcadores de superfície com anticorpos mistos (diluição detalhada é fornecida na Tabela de Materiais) em tampão FACS (1% FBS e 0,05% NaN3 em PBS) por 30 min em gelo (50-100 μL / poço).
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 minutos e lavá-las com tampão FACS duas vezes.
- Fixe as células com tampão de fixação celular (50-100 μL / poço) por 35 min no gelo. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min e lavá-las duas vezes com tampão FACS.
- Armazenar as amostras em tampão FACS (150-200 μL/tubo) a 4 °C e proteger da luz. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo. Para a população de CDs e células T, siga as estratégias de gating fornecidas na Figura 2B e na Figura 3A.
NOTA: Para a coloração de CDs mielóides, recomenda-se a incubação do bloqueador FC (Rat anti-rato CD16/CD32) durante 15 minutos no gelo antes da incubação dos anticorpos de superfície (passo 5.1.2).
- Análise de citocinas na reestimulação ex vivo
- Chapear as células em meio completo (RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, HEPES 10 mM, pH 7,2-7,6, aminoácido não essencial 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM, 100 U/mL cada penicilina e estreptomicina, 50 μM 2-mercaptoetanol e 2 mM L-glutamina) e estimular com 50 ng/mL de PMA mais 1 μM de ionomicina na presença de inibidor de transporte de proteínas por 4 h a 37 °C sob 5% de CO2.
- Efectuar a coloração da superfície para os marcadores de superfície, conforme descrito acima no passo 5.1.
- Adicionar a solução de permeabilização (50-100 μL/poço) e incubar por 5 min no RT para coloração intracelular. Incubar as células com anticorpos específicos para citocinas ou proteínas nucleares em solução de permeabilização (50-100 μL/poço) durante 60 min no gelo ou durante a noite a 4 °C.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 minutos e lavá-las com tampão FACS duas vezes. Conservar as amostras a 4 °C e proteger da luz. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo.
NOTA: A diluição de anticorpos pode ter que ser ajustada conforme necessário para realizar a coloração ideal.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Um ponto preto visível das células B16-F10 implantadas é geralmente observado na superfície da pele ~ 3 dias após o implante do tumor. Os ratos são tratados com a vacina tumoral 3, 6 e 9 dias após o nódulo tumoral ter atingido um tamanho de ≥2 mm. Observamos uma redução significativa no crescimento tumoral no grupo de camundongos vacinados ~2 semanas após o implante do tumor (Figura 1). Ao final do experimento, isolamos as células imunes intratumorais e analisamos seu número e expressão de m...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo aqui descrito é baseado no estudo do grupo de Allison. Eles demonstraram que a combinação da vacina B16-Flt3L com o bloqueio CTLA-4 mostrou um efeito sinérgico na taxa de sobrevivência e no crescimento do tumor, enquanto nenhuma redução do crescimento tumoral foi observada em camundongos que receberam a vacina B16-Flt3L ou o tratamento com anticorpos anti-CTLA-4 isoladamente7. Estudos recentes revelaram uma nova via de sinalização CTLA4-PKCη intrínseca ao Treg que desempenha um importa...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Stephen Schoenberger por fornecer células B16-Flt3L e à equipe das instalações de citometria de fluxo e animal LJI pelo excelente suporte.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% de tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% inativado por calor FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lote# 209018 |
| Agulha 30G | BD Biosciences | 305106 | |
| placa inferior em forma de V de 96 poços | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| Linha celular B16 expressando tirosina quinase 3 ligante semelhante a Fms (B16-Flt3L) | Presente do Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Os cDNAs Flt3L foram clonados no vetor retroviral pMG-Lyt2, como na referência 5, Figura suplementar 1 | |
| Linhas celulares B16-F10 | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Tampão de fixação celular (4,2% PFA) |
| Kit Cytofix/Cytoperm | Biosciences | 554714 | Kit de Solução de Fixação/Permeabilização |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Fisherbrand | 14-648-17 | ||
| Software FlowJo | dados do citômetro Tree | Star | |
| GolgiStop (inibidor do transporte de proteínas) | BD Biosciences | 554724 | diluição 1: 1500 |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomicina | Sigma | I0634 | |
| Iscove ' s Dulbecco modificado » s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| citômetros LSR-II | BD Biosciences | Citômetro de fluxo | |
| MEM aminoácidos não essenciais | Gibco | 11140-050 | |
| penicilina e estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | gradiente de densidade específico médio |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos Hybri-Max líquido | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 médio | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 Irradiador de raios-X | Rad Source Technologies | ||
| piruvato | de sódioGibco | 11360-070 | |
| Filtro de células estéreis 40 μ m | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Filtro de células estéreis 70 μ m | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua kit de viabilidade fixável | BioLegend | 423101 | |
| Anticorpos | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluoróforo: BV570 Diluição: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluoróforo: PerCP-Cy5.5 Diluição: 1:200 |
| Anti-mCD8 BioLegend | 100730 100724 | Clone: 53-6.7 Fluoróforo: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Diluição: 1:200 | |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluoróforo: APC-Cy7 Diluição: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | de 11577382 | Thermo Fisher Scientific | : FJK-16s Fluoróforo: FITC Diluição: 1:100 |
| Clone | de 372208 | Anti-m/hGzmB | : QA16A02 Fluoróforo: PE Diluição: 1:100 |
| de 505826 | Anti-mIFNg | : XMG1.2 Fluoróforo: PE-Cy7 Diluição: 1:100 | |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluoróforo: BV785 Diluição: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluoróforo: APC/Cy7 Diluição: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluoróforo: Pacific blue Diluição: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluoróforo: PECy7 Diluição: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluoróforo: PerCP Cy5.5 Diluição: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluoróforo: AF700 Diluição: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluoróforo: Alexa Fluor 647 Diluição: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluoróforo: PE Diluição: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Diluição: 1:200 |
Referências
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280(2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938(2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792(2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
