Artigo de método

Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

DOI:

10.3791/64090

⸱

28 de julho de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A reconstituição livre de células tem sido uma ferramenta fundamental para entender a montagem do citoesqueleto, e o trabalho na última década estabeleceu abordagens para estudar a dinâmica dos septins em sistemas mínimos. Aqui apresentados estão três métodos complementares para observar a montagem de septina em diferentes contextos de membrana: bicamadas planares, suportes esféricos e suportes de hastes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A maioria das células pode sentir e mudar sua forma para realizar processos celulares fundamentais. Em muitos eucariotes, o citoesqueleto de septina é um componente integral na coordenação de mudanças de forma como citocinese, crescimento polarizado e migração. Os septinas são proteínas formadoras de filamentos que se reúnem para formar diversas estruturas de alta ordem e, em muitos casos, são encontradas em diferentes áreas da membrana plasmática, mais notavelmente em regiões de curvatura positiva em escala de mícon. O monitoramento do processo de montagem de septina in vivo é dificultado pelas limitações da microscopia de luz nas células, bem como pela complexidade das interações com membranas e elementos citoesqueléticos, dificultando a quantificação da dinâmica do septino nos sistemas vivos. Felizmente, houve progressos substanciais na última década na reconstituição do citoesqueleto de septina em um sistema livre de células para dissecar os mecanismos que controlam a montagem de septinas em altas resoluções espaciais e temporais. Os passos centrais da montagem de septina incluem associação de heterooligomeres de septina e dissociação com a membrana, polimerização em filamentos, e a formação de estruturas de alta ordem através de interações entre filamentos. Aqui, apresentamos três métodos para observar a montagem de septina em diferentes contextos: bicamadas de planar, suportes esféricos e suportes de hastes. Esses métodos podem ser usados para determinar os parâmetros biofísicos dos septinos em diferentes estágios de montagem: como octamers únicos que ligam a membrana, como filamentos, e como conjuntos de filamentos. Utilizamos esses parâmetros emparelhados com medidas de amostragem de curvatura e adsorção preferencial para entender como o sensor de curvatura opera em uma variedade de escalas de comprimento e tempo.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As formas das células e muitos de seus compartimentos internos dependem das membranas lipídicas que as cercam. As membranas são estruturas viscoelásticas que podem ser deformadas através de interações com proteínas, triagem lipídica e atuação de forças internas e externas para gerar uma variedade de formas 1,2,3,4. Essas formas são frequentemente descritas em termos de curvatura de membrana. As células utilizam um conjunto diversificado de proteínas capazes de se reunir preferencialmente, ou "sensoriamento", curvaturas de membrana específicas para garantir o controle espátula-temporal definido sobre processos como tráfico celular, citocinas e migração 5,6. A dinâmica do maquinário celular na membrana é notavelmente difícil de observar devido à dificuldade de equilibrar o tempo e a resolução espacial com a saúde celular. Embora as técnicas de superrespeição possam oferecer uma visão detalhada de tais estruturas, elas exigem aquisições longas que não são favoráveis às escalas de tempo de montagem/desmontagem para a maioria das máquinas. Além disso, a complexidade molecular desses conjuntos em seu ambiente nativo e a multiplicidade de papéis que um único componente pode desempenhar fazem dos sistemas mínimos de reconstituição uma ferramenta valiosa para estudar a capacidade funcional das moléculas.

A mímética de membrana mínima foi desenvolvida para estudar propriedades de membrana e interações proteína-membrana fora da célula. Os miméticos de membrana variam de bicamadas lipídicas de pé livre, como lipossomos ou vesículas unilamellar gigantes, até bicamadas lipídicas suportadas (SLBs)7,8,9,10. SLBs são membranas biomiméticas ancoradas ao suporte subjacente, tipicamente composto de vidro, mica ou sílica 11,12. Uma variedade de geometrias pode ser usada, incluindo superfícies planares, esferas, hastes e até substratos ondulantes ou micropatterados para sondar interações proteína-membrana em curvaturas côncavas e convexas simultaneamente1 3,14,15,16,17,18 . A formação de bicamadas começa com a adsorção de vesículas em uma superfície hidrofílica, seguida de fusão e ruptura para formar uma bicamada contínua (Figura 1)19. Bicamadas suportadas são particularmente favoráveis à microscopia de luz e elétrons, fornecendo melhor tempo e resolução espacial do que muitas vezes é alcançável nas células. Os SLBs curvos fornecem especialmente um meio atraente para sondar a sensibilidade à curvatura da proteína na ausência de deformação significativa da membrana, permitindo que se distingue entre sensor de curvatura e indução de curvatura, que muitas vezes são impossíveis de separar em sistemas autônomos.

Os septinos são uma classe de proteínas citoesqueletal formadoras de filamentos bem conhecidas por sua capacidade de se reunir em membranas positivamente curvas 6,18,20. Ao longo do ciclo celular na levedura, os septinos se reúnem em um anel e devem reorganizar-se para formar as estruturas de ampulheta e anel duplo associadas ao surgimento de brotos e citocinese, respectivamente21. Embora belo trabalho tenha sido feito usando microscopia eletrônica de réplica de platina para observar a arquitetura de septina em diferentes estágios de ciclo celular22, assistir ao conjunto de septina ao longo do tempo usando microscopia de luz na levedura encontrou-se com resolução espacial limitada. Trabalhos anteriores em septinas usando monocamadas lipídicas visualizadas pela microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi capaz de reconstituir várias estruturas de septina interessantes, como anéis, feixes e gazes23. No entanto, as técnicas EM também são limitadas em sua resolução temporal, ao contrário da microscopia de fluorescência. A fim de melhor resolver os parâmetros cinéticos do processo multies em escala da montagem de septina, recorremos a miméticas de membrana suportadas, onde podemos controlar cuidadosamente a geometria da membrana, as condições amostrais e a modalidade de imagem.

Os protocolos descritos aqui usam SLBs planar ou curvos, proteína purificada e uma combinação de técnicas de microscopia. A microscopia de fluorescência quantitativa e a microscopia total de fluorescência interna (TIRFM) foram utilizadas para medir tanto a ligação de proteína a granel em várias curvaturas de membrana, quanto para medir a cinética vinculante de moléculas únicas. Além disso, este protocolo foi adaptado para ser usado com microscopia eletrônica de varredura (SEM) para examinar a ultraestrutura proteica em diferentes curvaturas de membrana. Embora o foco desses protocolos esteja no citoesqueleto septino, os protocolos podem ser facilmente modificados para investigar a sensibilidade da curvatura de qualquer proteína que o leitor ache interessante. Além disso, aqueles que trabalham em áreas como endocitose ou tráfico vesicular podem achar essas técnicas úteis para sondar os conjuntos dependentes da curvatura de complexos multiprofissionais.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Formar bicamadas lipídicas suportadas requer a preparação de pequenas vesículas unilamellar monodisperadas (SUVs). Consulte um protocolo24 publicado anteriormente na formação de SUV. Resumidamente, todos os SUVs são formados por sônica de sonda por 12 min no total a 70% de amplitude através de períodos de sônica de 4 min seguidos por períodos de descanso de 2 min em água gelada. As soluções de SUV devem ser bem esclarecidas e monodisperadas em tamanho. As distribuições de tamanho dos SUVs podem ser medidas, por exemplo, por dispersão dinâmica de luz25.

1. Bicamas lipídicas de Planar

  1. Limpeza plasmática dos slides
    NOTA: A limpeza plasmática remove contaminantes orgânicos e aumenta a hidrofilialidade do vidro, garantindo uma adsorção lipídica eficiente. As etapas a seguir podem mudar ou precisam ser otimizadas dependendo do limpador de plasma e das tampas de vidro utilizadas.
    1. Limpe o limpador de plasma por 5 minutos com oxigênio para remover o ar das linhas e da câmara. Isto é para garantir que, quando o limpador de plasma é executado, há principalmente oxigênio nas linhas e câmara, fornecendo preparações bicamadas mais consistentes.
    2. Durante a purga, flua um gás inerte, como n2 ou Ar, sobre as lâminas de vidro de micro tampa para remover poeira e partículas.
      OPCIONAL: As lâminas de vidro podem ser lavadas pulverizando cada lado com isopropanol 100%, seguido de água. Repita a lavagem isopropanol-água 3x e depois seque com um fluxo N2 .
    3. Disponha deslizamentos de vidro de cobertura seca em um berço de cerâmica. Coloque o berço na parte de trás da câmara de plasma para que as manchas sejam paralelas à borda longa da câmara (isso as mantém no lugar durante a limpeza do plasma). Execute o limpador de plasma por 15 minutos com oxigênio na potência máxima.
  2. Preparação da câmara
    NOTA: O método descrito aqui utiliza câmaras caseiras de tubos de PLÁSTICO PCR para suportar os volumes de reação, mas outros materiais de baixa adesão, como poços de silicone, também podem ser adequados.
    1. Usando uma lâmina de barbear ou uma tesoura, corte a tampa logo abaixo da parte foscarada de um tubo PCR de 0,2 mL (Figura 2).
    2. Pinte a borda do tubo PCR com adesivo ativado por UV, evitando o interior do tubo. Coloque suavemente a cola do tubo PCR no centro de uma mancha de cobertura limpa por plasma.
      NOTA: Para evitar cola dentro da câmara, use a quantidade mínima de cola para obter um selo e trate prontamente com UV sem bater ou perturbar a câmara.
    3. Coloque a câmara sob luz UV de comprimento de onda longa por 5-7 min para curar o adesivo.
  3. Formação de bicamadas
    NOTA: Os SUVs monodispersados devem ser usados nesta etapa para uma formação de bicamadas eficiente. A Tabela 1 fornece receitas para todos os buffers usados na formação de bicamadas, incluindo estoque e concentrações finais de buffer.
    1. Adicionar 40 μL de tampão bicamado lipídeca suportado (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl2; Tabela 1), 10 μL de SUVs de 5 mM e 1 μL de 100 mM CaCl2 para o poço. Agite suavemente as câmaras de um lado para o outro para interromper os SUVs e, em seguida, incubar a 37 °C por 20 min.
      NOTA: Para limitar a evaporação, incubar em uma placa de Petri coberta com um lenço molhado.
  4. Lavar o excesso de lipídios
    NOTA: Esta etapa remove o excesso de SUVs e atua como uma etapa de troca de buffer. É muito importante não raspar a bicameta com a ponta da pipeta durante a lavagem; se o vidro for exposto, septinas e muitas outras proteínas se ligarão irreversivelmente, reduzindo a concentração proteica eficaz.
    1. Após a incubação, enxágue o bicamado 6x com 150 μL de SLBB, pipetando para cima e para baixo para misturar cada vez, evitando bolhas.
      NOTA: Adicione 150 μL diretamente aos 50 μL de buffer e SUVs já presentes para um total de 200 μL na reação bem.
    2. Quando estiver pronto para começar a incubar com os septinos ou uma proteína diferente de escolha, lave a bicamada 6x com 150 μL de tampão de reação (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1,4 mg/mL BSA, 0,14% metilcelulose, 1 mM BME).
      NOTA: Para obter melhores resultados, faça o tampão de reação fresco e tenha muito cuidado ao misturar bem a reação para evitar bolhas.
    3. Na última etapa de lavagem, remova 125 μL de tampão de reação, deixando 75 μL no poço. Adicione 25 μL de septinas diluídas no tampão de armazenamento de septina (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM BME) na concentração e imagem desejadas pela microscopia TIRF26.
      NOTA: Ao configurar este ensaio pela primeira vez ou incorporar uma nova composição lipídica, é uma boa prática garantir que os lipídios estejam se difundindo livremente na superfície usando recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Embora a taxa de recuperação seja diferente para diferentes composições lipídicas e inerentemente inferiores aos sistemas autônomos, os lipídios não devem ser imóveis.

Tampão de bicamada lipídica suportado (SLBB)
EstoqueVolumeConcentração final
2 M KCl1,5 mL300 mM
1 M HEPES200 μL20 mM
500 mM MgCl2 20 μL1 mM
Água8 mL
Tampão de pré-reação (PRB)
EstoqueVolumeConcentração final
2 M KCl166 μL33,3 mM
1 M HEPES500 μL50 mM
Água9,33 mL
Tampão de reação
EstoqueVolumeConcentração final
2 M KCl166 μL33,3 mM
1 M HEPES300 μL50 mM
10 mg/mL BSA1,39 mL1,39 mg/mL
1% metilcelulose1,39 mL0.0014
ÁguaAté 10 mL
Bme0,7 μL1 mM
Tampão de armazenamento de septina (SSB)
EstoqueVolumeConcentração final
2 M KCl1,5 mL300 mM
1 M HEPES500 μL50 mM
ÁguaAté 10 mL
Bme0,7 μL1 mM

Tabela 1: Componentes tampão para preparação de bicamadas lipídicas suportadas e reações. Volumes de soluções de estoque que são incorporadas em buffers e as concentrações finais de cada componente são mostrados. SLB e PRB podem ser armazenados à temperatura ambiente e reutilizados entre experimentos. Tampão de reação e SSB são frescos para cada experimento.

2. Bicamas lipídicas suportadas esféricas

NOTA: Este protocolo utiliza microesferas de sílica suspensas em água ultrauso com 10% de densidade. Para qualquer trabalho sobre os parâmetros cinéticos da montagem de proteínas, é importante controlar estritamente a área total da superfície da membrana entre experimentos e curvaturas. A Tabela 2 mostra os volumes corrigidos de contas e tampão para manter 5 mm2 da superfície total da membrana. Este protocolo se expande em um método publicado anteriormente 8,18.

  1. Formação de bicamadas
    NOTA: Quanto às bicamadas planar, é importante ter SUVs de alta qualidade para formação robusta de bicamadas. A Tabela 2 lista o volume de contas de uma solução de densidade de 10% e seus respectivos volumes SLBB que são usados para obter uma área de superfície final de 5 mm2 para uma gama de diâmetros de contas.
    1. Microesferas de sílica (também referidas como contas) tendem a se estabelecer e se agrupar; para misturar as contas e quebrar quaisquer aglomerados, vórtice da garrafa para 15 s, depois banho-sonicato por 1 min, e vórtice novamente para 15 s.
    2. Misture o volume apropriado de contas (Tabela 2) com o volume correspondente de SLBB e 10 μL de SUVs de 5 mM em um tubo de microcentrifuge de baixa adesão de 0,5 mL.
    3. Balance a mistura de lipídios por 1h à temperatura ambiente. Certifique-se de que esta incubação seja feita em uma rotadora para evitar sedimentação.
  2. Prepare câmaras em tampas PEGylated
    NOTA: Quanto às bicamadas planar, câmaras caseiras de tubos PCR de plástico são usadas para suportar os volumes de reação, mas outros materiais de baixa adesão, como poços de silicone, podem funcionar tão bem.
    1. Enquanto as contas estão balançando, descongele uma tampa pegylated à temperatura ambiente. Corte um tubo PCR de 0,2 mL e cole-o no deslizamento de tampas conforme descrito na etapa 1.2. Para lâminas de 24 mm x 50 mm, até 10 câmaras podem caber de forma viável em um slide.
      NOTA: Este protocolo utiliza tampas de vidro pegylated de 24 mm x 50 mm que são preparadas com antecedência. Resumidamente, as tampas de vidro são completamente limpas através da sônica em acetona, metanol e 3 M KOH. As manchas são então funcionalizadas com n-2-aminoetil-3-aminopropyltrimethoxysilane e covalently ligadas ao valerate de succinimidyl mPEG. As tampas pegylated terminadas são armazenadas a vácuo seladas a −80 °C. Para um protocolo de passivação semelhante, consulte o trabalho de Gidi et al.27. Embora as tampas de vidro PEGylated sejam sugeridas aqui, outros meios de passivação, como os métodos BSA ou poli-L-lysine, podem ser eficazes.
  3. Lavar o excesso de lipídios
    NOTA: Esta etapa funciona para remover SUVs em excesso e realizar uma troca de buffer. As contas são lavadas 4x no total com tampão de pré-reação (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4). A Tabela 3 lista as velocidades de giro em RCF para uma gama de diâmetros de contas.
    1. Gire contas no RCF designado para 30 s (Tabela 3). Se usar vários tamanhos de contas, mantenha as contas balançando até que seja a hora de serem lavadas.
      NOTA: Não vale a pena sedimentar contas maiores no mesmo giro que contas menores com a menor velocidade de sedimentação de contas para economizar tempo. Isso pode fazer com que as contas grudem umas nas outras e comprometam a integridade da bicameta.
    2. Após o primeiro giro, remova 50 μL de supernascente e adicione 200 μL de PRB. Após a segunda e terceira rodadas, remova 200 μL e adicione 200 μL de PRB. Após o quarto giro, remova 200 μL e adicione 220 μL de PRB. Pipeta vigorosamente para cada lavagem.
      NOTA: O volume final de resuspensão é diferente das lavagens. Não vórtice as contas após a incubação com os lipídios, pois isso pode deixar lacunas nas bicamadas. Para evitar a sedimentação enquanto trabalha com os outros tamanhos de contas ou configuração de outras partes do ensaio, coloque as misturas de contas de volta no rotador end-over-end.
  4. Preparando a reação
    NOTA: Esta reação foi projetada para preservar a área total da superfície da membrana da reação em 5 mm2 e produzir uma condição de reação final de 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0,1% de metilcelulose e 1 mM BME.
    1. Se fizer um ensaio de competição com vários tamanhos de contas, faça uma mistura de 1:1 misturando volumes iguais de cada tamanho de contas juntos. Em seguida, misture 29 μL da mistura de contas desejada (ou de uma única conta) com 721 μL de tampão RXN.
      NOTA: É importante misturar completamente as contas em cada etapa com uma pipeta para evitar agrupamentos densos de contas; isso resultará em uma distribuição mais uniforme e área de superfície total precisa.
    2. Misture 75 μL de contas diluídas e 25 μL de proteína diluída em SSB para os poços.
      NOTA: Os autores tipicamente imagem complexos de septina de levedura a 1-50 nM.
    3. Se medir septinas em estado estável, incubar à temperatura ambiente por 1h e, em seguida, imagem por microscopia próxima de TIRF ou confocal.
Diâmetro da contas (μm)Volume de contas bem misturadas (μL)Volume de tampão SLB (μL)Volume de SUVs (μL)
6.468.9461.110
5.0676310
3.174.3965.610
0.961.3368.710
0.540.7569.310
0.310.4369.610

Tabela 2: Volumes normalizados de microesferas. A fim de manter uma área de superfície igual de cada tamanho de contas e manter a área total da superfície da membrana consistente entre experimentos, foram calculados volumes para cada tamanho de contas e tampão que normalizou a área total da superfície.

Diâmetro da conta (μm)Velocidade de sedimentação (RCF)
0.314.5
0.544.5
0.962.3
3.170.8
5.060.3

Tabela 3: Velocidades de sedimentação para microesferas de diâmetros variados. Para cada diâmetro das contas, as velocidades mínimas de sedimentação foram utilizadas para pastar as contas para lavar lipossomos não ligados.

3. Rod suportava bicamadas lipídicas

NOTA: Em contraste com os outros ensaios aqui apresentados, o ensaio da haste não permite um controle cuidadoso da área total da superfície da membrana. Pode-se ser consistente em quantidades e volumes entre experimentos, mas como isso resulta em varas de diferentes comprimentos e diâmetros, é difícil extrapolar a área total da superfície da membrana na reação. Assim, embora este seja um excelente ensaio para explorar a curvatura com múltiplas curvaturas em uma única superfície e tenha sido útil para explorar a ultraestrutura de septina, não é recomendado para medidas cinéticas. Este método foi relatado anteriormente18 e está sendo expandido aqui.

  1. Obtenção de hastes borossilicatos a partir de filtros de microfibra de vidro
    1. Rasgue um único filtro de microfibra de vidro GF/C de 42,5 mm em pedaços pequenos e coloque-os em um béquer de 100 mL com 60 mL de 100% de etanol. Banho-sonicate até que a solução se torne opaca; isso pode levar apenas 20-30 min com um filtro finamente desfiado.
      NOTA: Sonicate completamente para quebrar grandes pedaços; quanto mais dissociado/opaco, melhor.
    2. Cubra a solução com filme e armazene a solução à temperatura ambiente durante a noite.
  2. Formando bicamadas nas hastes
    NOTA: Esta etapa é realizada com excesso de lipídios para alcançar a cobertura completa da haste, pois é impossível quantificar a área total da superfície neste método.
    1. No dia seguinte, a solução de etanol será resolvida (etapa 3.1.2.), por isso misture-a bem antes de usar. Combine 10 μL de solução de haste e 70 μL de SLBB.
    2. Gire em velocidade máxima em uma mini centrífuga para 30 s e remova 50 μL do supernatante. Resuspend em outros 50 μL de SLBB e repita o giro para um total de quatro lavagens para diluir o etanol.
      NOTA: Os suportes da haste não formarão uma pelota sólida na parte inferior do tubo. Em vez disso, eles são manchados ao longo da lateral do tubo; isso os torna difíceis de preservar completamente ao lavar. Uma vez que a área total da superfície neste ensaio não é controlada, é bom se eles são perturbados.
    3. Combine 10 μL de solução de haste bem mista com 50 μL de SUVs de 5 mM e 20 μL de SLBB. Incubar por 1h à temperatura ambiente, girando de ponta a ponta como ao formar bicamadas nas microesferas.
  3. Lavar o excesso de lipídios
    1. Semelhante ao passo 3.2.2., gire a solução de varídio em velocidade máxima em uma mini centrífuga por 30 s para pellet as hastes revestidas de membrana fora da solução.
    2. Após o primeiro giro, remova 50 μL do supernante e adicione 200 μL de PRB. Após a segunda e terceira rodadas, remova 200 μL e adicione 200 μL de PRB. Após o quarto giro, remova 200 μL, adicione 220 μL de PRB e pipeta vigorosamente para misturar.
  4. Preparando a reação
    1. Em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL, misture 721 μL de tampão de reação com 29 μL de solução de haste. Misture bem.
    2. Em um tubo PCR de 0,2 mL, combine 75 μL de hastes em tampão de reação e 25 μL de septinas na concentração desejada, diluída em SSB. Deixe incubar à temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
  5. Preparando-se para a microscopia eletrônica de varredura
    1. Após a incubação, adicione a mistura de 100 μL de septin-rod em uma tampa redonda de 12 mm revestida de PEG e incubar à temperatura ambiente por 1h em uma placa de Petri fechada.
    2. Fixar a amostra preenchendo o fundo da placa de Petri (10 mL deve ser suficiente) com 2,5% de glutaraldeído em 0,05 M de cacodilato de sódio (NaCo), pH 7,4, por 30 min. Aspire o líquido com uma pipeta de vidro. Lave a amostra incubando-a com 10 mL de 0,05 M NaCo por 5 min e repita para um total de duas lavagens.
    3. Postfix em 0,5% Tampão de cacodilato OsO4 por 30 min e, em seguida, lave 3x em 0,05 M NaCo (5 min/lavagem).
    4. Incubar a amostra com 1% de ácido tânnico por 15 minutos e depois lavar em NaCo 3x. Incubar por 15 min em 0,5% OsO4 e lavar 3x com NaCo.
    5. Desidratar as amostras utilizando concentrações crescentes de etanol: 30% EtOH por 5 min, 2x; 50% EtOH por 5 min; 75% EtOH por 5 min; e 100% EtOH por 5 min, 2x. Siga com mais 10 minutos de incubação.
    6. Incubar em fluido de transição (hexametiledisilazane) 3x (5 min, 10 min, depois 5 min).
    7. Deixe secar o ar e coloque as amostras em um desiccador até o revestimento de sputter. Sputter-coat a camada de 4 nm com uma a totalidade de ouro/paládio e, em seguida, imagem em um microscópio eletrônico de varredura.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Após a preparação de cada SLB, os septinos ou a proteína de interesse podem ser incubados com o suporte desejado e imageados via TIRFM, microscopia confocal ou SEM. Os resultados aqui apresentados utilizam septinas recombinantemente expressas e purificadas de E. coli17. Utilizando o TIRFM em SLBs planar, é possível determinar o comprimento dos filamentos e sua flexibilidade, medir os coeficientes de difusão e observar a montagem ao longo do tempo 28,29

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As membranas celulares assumem muitas formas diferentes, curvaturas e propriedades físico-químicas. Para estudar o maquinário em escala de nanômetros através do qual as células constroem conjuntos em escala de micrômetros, é necessário projetar sistemas mínimos de reconstituição de mimetéticas de membrana. Este protocolo apresenta técnicas que controlam precisamente a curvatura e a composição da membrana, permitindo ao usuário facilmente tomar medidas quantitativas de fluorescência usando técnicas de microscopia amplamen...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) Grant no. R01 GM-130934 e Fundação Nacional de Ciência (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V., e K.S.C. foram apoiados em parte por uma bolsa do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais sob o prêmio T32 GM1199999.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de PCR de 0,2 mL com tampa plana, NaturalWatson137-211C(EX)
Tubos de baixa adesão de 0,5 mL USAScientific1405-2600
Beta mercaptoetanol (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA4612-25G
Coverglass para fazer lamínulas PEGylatedThermo Scientific152450Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Tampa de Vidro 24x50 #1.5
DOPCAvanti Polar Lipids850375
Egg Liss Rhodamine PEAvanti Polar Lipids810146
EMS Glutaraldeído Aquoso 25%, Grau EMVWR16220
EMS Cacodilato de Sódio BufferVWR11652
Etanol, 200 provasFisher Scientific04-355-223EA
HEPESSigma AldrichH3375-1KG
HexametildisilazaneSigma-Aldrich440191
Cloreto de magnésioVWR7791-18-6
Metilcelulose 4000cpSigma-AldrichM052-100G
Lamínulas de microvidro para bicamadas planaresMatsunamiMini
descontinuada Microesferas de sílica não funcionalizadaBangs Laboratories, Inc.Depende do tamanho: SS0200*-SS0500*Sílica em suspensão aquosa
Adesivo ópticoNorland ThorlabsNOA 68Adesivo flexível para vidro ou plásticos
Tetróxido de ósmioMillipore Sigma20816-12-0
ParafilmVWR52858-000
Limpador de plasmaPlasma EtchPE-25Voltagem: 120V, 60Hz. Corrente: 15 AMPS
Cloreto de potássioVWR0395-1kg
Tampa de lamínula redonda, #1.5 12mm   VWR64-0712
Sonicator bathBranson1510R-MTBransonic Limpador ultrassônico. 50-60 Hz. Saída: 70W
Soja PIAvanti Polar Lipids840044
Centrífuga de mesaEppendorf22331
Lâmpada UVSpectrolineENF-260C115 Volts, 60 Hz, 0,20 AMPS
Papel de filtro de microfibra WhatmanGlassVWR28455-03042,5 mm de diâmetro, grau GF/C
centrífuga 22x22

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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