Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Este protocolo orientará aqueles que trabalham em proteínas de ligação de membrana para determinar como a forma da membrana desempenha um papel na organização de conjuntos proteicos. A principal vantagem dessa técnica é sua versatilidade para tipo de proteína, composição de membrana e geometria da membrana. Também permite o interrogatório de como um bicamheiro lipídico pode alterar propriedades de proteínas associadas.

Para identificar uma boa membrana para o experimento, sugerimos estabelecer uma lista de verificação que pode incluir taxas de difusão lipídica, mobilidade da proteína de interesse e se há lipossomos desexplosados ou lipossomos fundidos presos à superfície. Para iniciar a limpeza plasmática dos slides, purgue o limpador de plasma por cinco minutos com oxigênio para remover o ar das linhas e da câmara. Disponha deslizamentos de vidro de cobertura seca em um berço de cerâmica.

Durante a purga, flua um gás inerte sobre as lâminas de vidro de micro tampa para remover poeira e partículas. Coloque o berço na parte de trás da câmara de plasma para que as tampas sejam paralelas com a borda longa da câmara. Execute o limpador de plasma por 15 minutos com oxigênio na potência máxima.

Para preparação da câmara, corte a tampa logo abaixo da parte foscarada de um tubo PCR de 0,2 mililitro. Pinte a borda do tubo PCR com adesivo ativado por UV evitando o interior do tubo. Coloque suavemente a cola do tubo PCR no centro de uma mancha de cobertura limpa de plasma, em seguida, coloque a câmara sob luz UV de comprimento de onda longo por cinco a sete minutos para curar o adesivo.

Para formar uma bicamheira, adicione os reagentes ao poço. Agite suavemente as câmaras de um lado para o outro para interromper os SUVs e, em seguida, incubar a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, enxágue a bicamadas seis vezes com 150 microliters de SLBB por pipetar para lavar lipídios em excesso, em seguida, lave a bicamarina seis vezes com 150 microliters de tampão de reação antes de incubar com os septins.

Na última etapa de lavagem, remova o tampão de reação, deixando 75 microliters no poço. Adicione 25 microliters de septinas diluídas em SSB e imagem por microscopia TIRF. Primeiro, o vórtice da garrafa contendo microesferas de sílica por 15 segundos, depois banho sonicate por um minuto e vórtice novamente por 15 segundos para quebrar quaisquer aglomerados.

Misture as contas com SLBB e 10 microlitres de cinco SUVs mililitros em um tubo de microcentrifuge de baixa adesão. Incubar a mistura lipídica de contas por uma hora à temperatura ambiente em um agitador para evitar a sedimentação. Enquanto isso, descongele uma tampa pegylated e cole um tubo PCR de 0,2 mililitro cortado.

Após a incubação, centrifufique as contas por 30 segundos no RCF designado. Após o primeiro giro, remova 50 microliters de supernascer, depois adicione 200 microliters de PRB e misture por tubulação vigorosa. Para as próximas rodadas, remova 200 microliters de PRB e adicione outros 200 microliters após o segundo e terceiro giro e adicione 220 microliters de PRB após o quarto giro.

Se fizer um ensaio de competição com múltiplos tamanhos de contas, prepare a reação misturando volumes iguais de cada tamanho de esfera e diluindo 29 microliters desta mistura de contas com 721 microliters de tampão de reação, em seguida, adicione 75 microliters de contas diluídas e 25 microliters da proteína diluída em SSB para os poços e misture. Se medir septinas em um estado estável, incubar a mistura à temperatura ambiente por uma hora e, em seguida, imagem por perto de TIRF ou microscopia confocal. Os micrografos TIRF de SLBs planar incubados com septinas mostrados em verde mostraram distribuição de proteínas homogêneas.

SLBs feitos com tampas de vidro mal limpas mostraram buracos ou lacunas na bicamada em regiões de baixa septina. O desabafo e os lipossomos tubulados podem se acumular na superfície se os lipossomos antigos forem usados ou se as lavagens não forem rigorosas. Em micrografias de microesferas revestidas de lipídios visualizadas usando rhodamina PE mostraram deposição de bicamadas lisas.

Os suportes esféricos foram uniformemente revestidos pela membrana e havia poucos aglomerados de contas. A lavagem insuficiente de lipídios em excesso causou revestimento de membrana irregular, como observado por aglomerados lipídes e manuseio inadequado, causando lacunas na bicamadas. A mistura insuficiente de contas causou a aglomeração que não é ideal para medir a absorção total de proteínas.

Usando as bicamadas lipídicas suportadas aqui apresentadas, outros métodos como microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida, citometria de massa de membranas e microscopia de força atômica de alta velocidade podem ser realizados para examinar diferentes dinâmicas proteína-proteína ou membrana proteica.