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Pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em Caenorhabditis elegans

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DOI:

10.3791/64091

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18 de maio de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Caenorhabditis elegans servem como um excelente sistema de modelos com métodos robustos e de baixo custo para levantamento da vida saudável, vida útil e resiliência ao estresse.

Resumo

A descoberta e desenvolvimento de Caenorhabditis elegans como organismo modelo foi influente na biologia, particularmente no campo do envelhecimento. Muitos estudos históricos e contemporâneos identificaram milhares de paradigmas que alteram a vida útil, incluindo mutações genéticas, expressão genética transgênica e hormesis, uma exposição benéfica e de baixo grau ao estresse. Com suas muitas vantagens, incluindo uma vida útil curta, manutenção fácil e de baixo custo, e genoma totalmente sequenciado com homologia a quase dois terços de todos os genes humanos, C. elegans foi rapidamente adotado como um modelo excepcional para o estresse e a biologia do envelhecimento. Aqui, vários métodos padronizados são pesquisados para medir a vida útil e a vida saudável que podem ser facilmente adaptados em quase qualquer ambiente de pesquisa, especialmente aqueles com equipamentos e fundos limitados. Destaca-se a incrível utilidade de C. elegans , destacando a capacidade de realizar análises genéticas poderosas na biologia do envelhecimento sem a necessidade de uma ampla infraestrutura. Por fim, são discutidas as limitações de cada análise e abordagens alternativas.

Introdução

Desde a época da publicação de "A genética de Caenorhabditis elegans", um dos artigos mais influentes de Sydney Brenner em 1974, este verme microscópico tem sido considerado um excelente sistema modelo para estudar mistérios biológicos1. Em 1977, Michael R. Klass publicou o método para medir a vida útil de C. elegans e estabeleceu este sistema modelo para estudar o envelhecimento2. A investigação para entender a relação entre estresse e longevidade começou com a identificação de uma única mutação no gene da idade-1, o que resultou em uma extensão de vida útil em C. elegans3. Além disso, estudos contemporâneos identificaram outras mutações que aumentam a vida útil, que revelaram vermes mutantes de longa duração que exibem maior resistência ao estresse 4,5,6. Com suas muitas vantagens, incluindo uma vida útil curta, fácil manutenção, genoma completamente sequenciado contendo homologia a cerca de dois terços de todos os genes causadores de doenças humanas, disponibilidade e facilidade de usar bibliotecas de interferência de RNA (RNAi) e semelhança fisiológica com humanos 7,8,9, C. elegans foi rapidamente adotado como um modelo excepcional para o estresse e a biologia do envelhecimento.

Talvez as maiores utilidades de C. elegans sejam seu custo extremamente baixo de manutenção, facilidade de experimentação e a variedade de ferramentas genéticas disponíveis para estudos. C. elegans são tipicamente cultivados em um meio de ágar sólido com uma fonte de alimento E. coli. Duas cepas de E. coli comumente usadas são op50 padrão, uma cepa B que é talvez a10 mais usada, e HT115, uma cepa K-12 que é usada principalmente para experimentos RNAi11,12. A cepa HT115 K-12 carrega uma exclusão em RNAIII RNase, uma mutação que é essencial para os métodos RNAi, onde plasmídeos expressando dsRNA correspondentes aos genes C. elegans individuais são usados. Os vetores de alimentação dsRNA permitem um knockdown robusto de genes C. elegans sem a necessidade de cruzes complexas ou edição de genomas, pois as bactérias que carregam esses plasmídeos podem ser alimentadas diretamente com nematoides. Milhares desses vetores rnai bacterianos existem no fundo HT115, incluindo a biblioteca Vidal RNAi mais popular com >19.000 construções rnai individuais13 e a biblioteca Ahringer RNAi com 16.757 RNAi construtos14. No entanto, as dietas bacterianas OP50 e HT115 têm grandes diferenças no perfil metabólico, incluindo diferenças na Vitamina B1215,16. Portanto, recomenda-se realizar todos os experimentos em uma única fonte de bactérias, se possível, para evitar interações gene-diet que possam introduzir múltiplos fatores de confusão como descrito anteriormente 17,18,19. Devido à sua facilidade, os animais são mantidos em OP50 para todas as condições experimentais descritas aqui, mas todos os experimentos são realizados em HT115 como descrito anteriormente20. Resumidamente, os animais são mantidos em OP50 e transferidos para ht115 pós-sincronização (após branqueamento) para consistência entre experimentos RNAi vs. não-RNAi. Alternativamente, uma cepa OP50 competente rnai carregando uma exclusão semelhante de RNAIII RNase encontrada na cepa E. coli K12 HT115 também pode ser usada21.

Talvez uma grande limitação aos experimentos rnai em C. elegans é a preocupação da eficiência de knockdown. Embora a eficiência do knockdown possa ser validada via qPCR ou mancha ocidental, estes exigem equipamentos e reagentes caros e são limitados à análise em massa. Isso é ainda mais preocupante olhar para células específicas, como neurônios, que são refratários (menos sensíveis) ao RNAi. Embora a eficiência rnAi em células específicas possa ser aprimorada através da superexpressão do SID-1, a proteína transmembrana essencial para a absorção de dsRNA22, isso ainda está limitado aos padrões de expressão específicos do tipo celular dos promotores usados para essas construções, e, portanto, nocautes genéticos e mutações são os meios mais infalíveis de esgotar as funções genéticas. Além do knockdown mediado pela RNAi, os elegans C. também são altamente favoráveis à edição de genomas com estratégias baseadas em CRISPR 23,24,25 e sobreexpressão transgênica através de microinjeções, com a opção de integrar construções transgênicas por meio de irradiação ou integração baseada em transposon 26,27,28,29 . No entanto, esses métodos exigem equipamentos de microinjeção caros, e o alto custo da enzima guia RNAs ou Cas9 pode proibir esses métodos em instituições com financiamento limitado. Em vez disso, milhares de linhas transgênicas e mutantes estão prontamente disponíveis por alguns dólares, tanto no Centro genético de Caenorhabditis (CGC) quanto no National Bioresource Project (NBRP). O NBRP oferece mutantes isolados para um grande número de genes C. elegans, incluindo cepas mutantes publicadas e, portanto, verificadas, mutantes derivados de projetos piloto, e mutantes que ainda não foram caracterizados. Em contraste, o CGC é um depositário de linhas C. elegans publicadas e estabelecidas da comunidade de pesquisa. Ambos enviam cepas em todo o mundo a taxas muito razoáveis e oferecem uma grande variedade de opções para aqueles com capacidade limitada para sintetizar cepas internamente.

Aqui, é oferecida uma coleção de métodos curados, que provavelmente serão os métodos de menor custo para avaliar a vida útil e a vida útil em C. elegans. Todos os métodos aqui apresentados exigem equipamentos e suprimentos de baixo custo, e utilizam apenas cepas prontamente disponíveis do CGC. Talvez o mais proibitivo para ensaios de longevidade e sobrevivência em C. elegans é o custo das placas de Nematode Growth Media (NGM). Uma vez que C. elegans são hermafroditas e auto-fertilizar, ensaios padrão de sobrevivência exigem que animais adultos sejam continuamente afastados de sua descendência para evitar a contaminação da prole. Não só esse processo é demorado, como pode se tornar caro devido à necessidade de aproximadamente 100 placas por condição para executar um único ensaio de vida útil. Aqui, duas alternativas são fornecidas: utilização do mutante sem germinal sensível à temperatura, glp-4(bn2), ou esterilização química usando 5-fluoro-2'-desoxyuridina (FUDR). glp-4 codifica uma sitetase de rna de aminoacyl valyl, e o glp-4(bn2) sensível à temperatura são reprodutivamente deficientes a temperaturas restritivas devido à diminuição da tradução deproteínas 30,31. FUDR é um método robusto para esterilizar quimicamente C. elegans, impedindo a replicação do DNA, inibindo assim a reprodução32. Embora o FUDR possa ser proibitivamente caro para alguns laboratórios, apenas uma pequena quantidade é necessária para esterilizar quimicamente vermes, e sua estabilidade na forma de pó pode torná-lo viável para a maioria dos grupos. Utilizar o mutante glp-4(bn2) sensível à temperatura é certamente a opção mais barata, pois o único requisito é uma incubadora para deslocar os animais para os restritivos 25 °C; no entanto, deve-se notar que o crescimento a 25 °C pode causar leve estresse térmico33,34. Independentemente do método, o uso de animais estéreis pode diminuir significativamente os custos de consumíveis necessários para ensaios relacionados à idade.

Para estudar o envelhecimento, os ensaios padrão da vida útil são convencionais, pois paradigmas que alteram a longevidade têm impactos diretos no envelhecimento. No entanto, as medidas de saúde e tolerância ao estresse apresentam informações adicionais sobre a saúde do organismo. Aqui, são oferecidos diversos métodos para medir a saúde: 1) fecundidade como medida de saúde reprodutiva; 2) tamanho da ninhada como medida de saúde do desenvolvimento e viabilidade de descendentes colocados; e 3) comportamento locomotório como medida de função muscular e motilidade, ambos diretamente correlacionados com o envelhecimento. Além disso, são oferecidos ensaios de tolerância ao estresse: sobrevivência ao estresse er, estresse mitocondrial/oxidativo e sobrevivência do estresse térmico. De fato, animais com maior resistência ao estresseer 35,36, estresse mitocondrial37 e estresse térmico38 apresentam aumento da vida útil. O estresse do ER é aplicado expondo C. elegans à tunicamicina, que bloqueia a glicosição ligada a N e causa o acúmulo de proteínas desdobradas39. O estresse mitocondrial/oxidativo é induzido pela exposição ao paraquat, que induz a formação de superóxido especificamente nas mitocôndrias40. O estresse térmico é aplicado através da incubação de animais a 34-37 °C33,41. Todos os ensaios descritos aqui podem ser realizados com equipamentos e fundos mínimos, e oferecem uma variedade de ferramentas para estudar o envelhecimento em diversos grupos.

Protocolo

1. Crescimento e manutenção de C. elegans

  1. Despejando placas de Mídia de Crescimento de Nematode (NGM)
    1. Grow C. elegans em placas de ágar padrão de 2% com Nematode Growth Media (NGM) consistindo de 1 mM CaCl2, 5 μg/mL de colesterol, 25 mM KPO4 (pH 6.0), 1 mM MgSO4, 0,25% w/v Peptone e 51,3 mM NaCl.
    2. Para 1 L de placas de NGM-ágar, meça 2,5 g de Peptone, 3,0 g de NaCl e 20 g de ágar em um frasco de 1 L com uma barra de mexida.
      NOTA: Recomenda-se padronizar uma fonte específica de ágar, pois temos visto variabilidade na rigidez entre as marcas, o que pode afetar a reprodutibilidade. Aqui, Bacto-Agar é estritamente usado. Além disso, recomenda-se adicionar ágar diretamente no frasco que está sendo autoclaved, pois o ágar não se dissolverá completamente sem aquecimento, e a transferência de solução contendo ágar resultará em perda de ágar e erros de concentração.
    3. Adicione dH2O até 970 mL.
      NOTA: 30 mL de aditivos líquidos pós-esterilização levará o volume final para 1 L. Em nossas mãos, ~951 mL de dH2O será necessário para atingir 970 mL do volume final.
    4. Esterilizar a solução NGM-ágar utilizando uma autoclave padrão ou esterilizador de mídia para esterilização eficiente.
      NOTA: Neste ponto, o NGM-ágar estéril pode ser armazenado por vários meses à temperatura ambiente. Se armazenado, o NGM-ágar pode ser reliquefeito em um micro-ondas com pulsos de 15-45 s para evitar que a solução ebulhe sobre, ou em um banho de água aquecido.
    5. Deixe a solução mexer até esfriar a 60-75 °C. Mexer durante o resfriamento é importante para evitar o resfriamento desigual, o que pode fazer com que alguns ágars se solidifiquem.
    6. Enquanto a solução esfria, aqueça um banho de água ou banho de contas a 65-70 °C.
    7. Uma vez que a solução esfrie para 60-75 °C, adicionar aditivos líquidos: 2,0 mL de 0,5 M CaCl2, 1 mL de colesterol 5 mg/mL, 25 mL de 1 M KPO4 (pH 6.0) e 0,5 M MgSO4 (ver Tabela 1 para receitas para todos os reagentes), e permitir que a solução misture por ~5 min para garantir a mistura completa.
      NOTA: As drogas também podem ser incluídas nas placas aqui (por exemplo, adicionar 1 mL de carbenicilina de 100 mg/mL e 1 mL de 1 M IPTG; adicionar 10 mL de 2,5 mg/mL de tunicamycina; adicionar 10 mL de 400 mM paraquat).
    8. Frasco submerso contendo NGM-ágar em um banho de água de 65-70 °C para evitar que NGM-ágar se solidifique enquanto derrama em placas.
    9. Pipeta 9-11 mL de solução em cada placa de 60 mm, ou 20-30 mL de solução em cada placa de 100 mm.
      NOTA: Recomenda-se o uso do menor volume de pipeta disponível para evitar vazamentos de GNM causados pela expansão do ar na pipeta. A pipetação de 1-2 mL de mídia a mais do que será adicionada a cada placa para evitar esvaziar completamente a pipeta ajudará a evitar a formação de bolhas. Alternativamente, as placas podem ser derramadas à mão diretamente da garrafa em uma placa, mas a tubulação é altamente recomendada para garantir placas com o mesmo volume. Placas de volume iguais são importantes para garantir concentrações semelhantes de soluções ao usar métodos onde as soluções são aplicadas diretamente em cima de uma placa (ver passo 1.1.17). Volumes iguais também permitem uma microscopia fácil para manter um plano focal semelhante entre as placas.
    10. Coloque a pipeta de volta na solução aquecida para manter a temperatura e evitar que o NGM-ágar se solidifique.
    11. Repita os dois passos acima para todas as placas.
    12. Permita que as placas de NGM-ágar se solidifiquem durante a noite.
    13. Depois que as placas se solidificarem, armazene as placas por até 3 meses a 4 °C ou passe para a etapa 1.1.14 para semear placas com bactérias. Armazene placas em recipientes lacrados para ajudar a reter a umidade para manter a qualidade da placa.
    14. Cresça uma cultura de OP50 em caldo de lysogeny (LB) ou meio equivalente de escolha para 24-48 h a temperatura ambiente (~22-25 °C) ou cresça uma cultura de HT115 em LB + antibióticos (ampicilina/carboidrato + tetraciclina é recomendado para HT115) com agitação a 37 °C para 12-16 h.
      NOTA: Recomenda-se cultivar OP50 à temperatura ambiente porque um crescimento mais agressivo do OP50 foi encontrado a 37 °C, o que afeta a vida útil de C. elegans . Em contraste, o HT115 tem uma taxa de crescimento mais lenta e torna culturas menos densas; assim, recomenda-se cultivar HT115 a 37 °C com agitação.
    15. Semente um volume de 100-200 μL de uma cultura OP50/HT115 saturada em uma placa de 60 mm, ou 1 mL para uma placa de 100 mm.
    16. Deixe as placas secarem durante a noite em um banco e deixe um dia adicional para secar se as placas ainda estiverem molhadas. Armazene as placas em recipientes lacrados a 4 °C por ~2 meses.
    17. Opcional: Adicione drogas diretamente em placas de GNL semeadas (por exemplo, 100 μL de solução FUDR de 10 mg/mL) para esterilizar quimicamente os vermes.
  2. Manutenção de estoques C. elegans
    1. Rotule corretamente a parte inferior de uma placa de Ágar NGM semeada. Rotule as bordas na parte inferior da placa para evitar obstruir a passagem da luz nos microscópios de dissecção padrão.
    2. Usando um microscópio de dissecção padrão, colher bactérias escolhidas em C. elegans escolher.
      NOTA: Neste protocolo, foi utilizada uma palheta composta por um fio de platina/irídio de 90%/10% preso à extremidade de uma pipeta Pasteur de vidro.
    3. Usando as bactérias, colete 10-20 ovos, animais L1, L2 ou L3, e transfira-os para uma placa de NGM-ágar recém-rotulada.
      NOTA: É melhor coletar animais mais jovens; na experiência dos autores, para animais de tipo selvagem padrão, mover 10-20 ovos/animal jovem permitirá que a placa cresça a 15 °C sem fome. Para animais transgênicos ou mutantes com fecundidade reduzida, mais animais devem ser movidos para a placa.
    4. Para animais com fecundidade do tipo selvagem e cultivados a 15 °C, repita as etapas 1.2.1-1.2.3 a cada 7 dias para manter um estoque semanal. Para animais cultivados a 20 °C, repita os passos 1.2.1-1.2.3 a cada 4-5 dias para evitar a fome.
  3. Sincronizando worms via branqueamento
    NOTA: Uma placa de ágar NGM completa de 60 mm (por exemplo, placas de estoque de 1 semana cultivadas a 15 °C) fornecerá um número suficiente de animais para a maioria dos ensaios padrão descritos. Geralmente, um adulto gravid (adulto cheio de ovos) fornecerá 10-15 ovos42, e uma placa ngm-ágar completa de 60 mm tem em qualquer lugar entre 100-200 adultos gravid, fornecendo ~1000-2000 ovos.
    1. Para experimentos de maior escala que requerem mais animais, corte um ngm-ágar de 60 mm em quatro a seis pedaços iguais e escore-os em placas semeadas de 100 mm para expansão.
      NOTA: Aqui, o chunking refere-se a cortar um pedaço da placa NGM-ágar contendo vermes e mover todo o pedaço de ágar + worms para uma nova placa, lado do verme para baixo para permitir que os vermes rastejassem para a nova placa. Como referencial, os animais com fecundidade do tipo selvagem produzirão uma placa completa de 100 mm se cultivadas a 20 °C por 2-3 dias após a emção.
    2. Para começar a coletar os nematoides, despeje uma pequena quantidade de solução M9 (Tabela 1) em placas contendo vermes, tomando cuidado para não encher demais a placa de Petri. Gire a solução M9 suavemente para soltar vermes dos gramados bacterianos.
    3. Colete vermes adultos gravid com uma pipeta sorológica, tomando cuidado para não furar o ágar com a ponta da pipeta.
      NOTA: Pipetas sorológicas de vidro são recomendadas, pois c. elegans tendem a grudar no plástico. Se as pipetas de vidro não estiverem disponíveis, recomenda-se começar com um número maior de animais do que o necessário, pois alguns serão perdidos devido à aderência a pipetas plásticas.
    4. Pelota os animais por centrifugação para 30 s a 1.100 x g. Aspire o supernatante.
      NOTA: A pelota C. elegans é muito solta, por isso tome cuidado para não sacudir ou interromper a pelota enquanto aspira o supernante.
    5. Enquanto os animais estão percrifugando, prepare 5 mL de solução de branqueamento por cepa (ver Tabela 1 para detalhes da receita); para 5 mL de solução, misture 1,5 mL de hipoclorito de sódio de 6% (alvejante), 0,75 mL de 5 M NaOH ou KOH, e 2,75 mL de dH2O.
      ATENÇÃO: As soluções de hipoclorito de sódio e hidróxido de alta concentração são corrosivas e, portanto, recomenda-se usar luvas e um jaleco durante o manuseio.
    6. Adicione 5 mL de solução de branqueamento à mistura worm pellet/M9.
    7. Verifique os vermes sob um microscópio dissecando a cada poucos minutos até que todos os corpos de vermes adultos tenham sido dissolvidos e apenas ovos são deixados na mistura. Agite a mistura worm/alvejante vigorosamente para acelerar o processo de branqueamento.
      NOTA: Deixar ovos dentro de uma mistura de alvejante por longos períodos resultará em danos aos ovos e afetará a viabilidade dos animais. Para animais selvagens, o branqueamento geralmente leva de 4 a 6 minutos com agitação. Assim, recomenda-se verificar os animais sob um microscópio em intervalos de 30 s a partir da marca de 4 minutos.
    8. Pelota os ovos girando para baixo a mistura de ovo/alvejante por 30 s a 1.100 x g.
      NOTA: Alguns tubos cônicos de 15 mL têm linhas gradientes no interior do tubo. Para estes tubos, recomenda-se girar ovos em uma velocidade mais alta (por exemplo, 30 s a 2.000 x g) para garantir que os ovos pelotam para o fundo do tubo e não permaneçam em linhas gradientes.
    9. Aspire a solução de branqueamento.
      NOTA: Uma pelota de ovo é mais dura que uma pelota de verme, mas ainda pode ser interrompida facilmente. Então, tome cuidado para não sacudir o tubo depois de centrifuging.
    10. Lave os ovos adicionando solução M9 até 15 mL e invertendo o tubo quatro ou cinco vezes para garantir que os ovos estejam totalmente dispersos na solução M9.
    11. Ovos de pelota por centrifugação para 30 s a 1.100 x g e aspirar a solução M9.
    12. Repita os dois passos acima para um total de quatro lavagens para eliminar qualquer alvejante da mistura de ovos.
    13. Resuspenque os ovos em 100 μL a 2 mL de solução M9 (ou seja, dependendo do número total de vermes branqueados) após a lavagem final. Agite bem os ovos para quebrar os aglomerados e garantir que a pelota esteja totalmente ressuspendida.
    14. Alternativamente, os animais podem ser presos em L1 por uma sincronização temporal mais apertada; para prender L1, adicione a solução M9 à pelota de ovo a ~10 mL em um tubo cônico de 15 mL. Deixe os vermes girarem em um rotador por até 24 h a 20 °C ou temperatura ambiente. Os animais L1 geralmente levam meio dia a menos para atingir a idade adulta em comparação com o tempo dos ovos descritos na etapa 1.3.16.
    15. Aproxime-se da concentração de ovos (ou concentração de L1; veja o passo 1.3.14) por pipetar 4 μL de mistura de ovo/M9 em uma semeadura de placa de NGM com bactérias. Conte e calcule quantos ovos estão presentes por μL banhado. Repita a contagem três ou quatro vezes para melhorar a aproximação.
      NOTA: A aproximação da concentração de ovos garantirá que animais suficientes sejam banhados para o tamanho adequado da amostra para experimentos sem sobreplacar, o que causará fome.
    16. Com base na aproximação, emplaque o número apropriado de ovos em placas de NGM-ágar semeadas com bactérias de escolha. Para placas OP50, plaque uma placa máxima de 200 animais em uma placa de 60 mm e 1.000 animais em uma placa de 100 mm. Para placas HT115, plaque um máximo de 150 animais em uma placa de 60 mm e 600 animais em uma placa de 100 mm.
      NOTA: Estes são números aproximados com base em nossas condições de laboratório, e os números podem mudar com base na espessura do gramado bacteriano. Os ovos cultivados a 15 °C levarão ~5 dias para chegar ao dia 1 adulto (~140 h para atingir o máximo de ovos, estágio adulto gravid). Os ovos cultivados a 20 °C levarão ~4 dias para chegar ao dia 1 adulto (~96 h para atingir a máxima de colocação de ovos, estágio adulto gravid). Os ovos cultivados a 25 °C levarão ~3,5 dias para chegar ao dia 1 adulto (~62 h para atingir o máximo de ovos, estágio adulto gravid).
  4. Egg-lay como um método alternativo para sincronizar as populações C. elegans
    1. Se os protocolos de branqueamento não forem viáveis (por exemplo, nenhuma centrífuga disponível), como método alternativo para sincronizar populações de C. elegans, realize um procedimento de leigo de ovos. Tenha em mente que este protocolo é mais trabalhoso e resultará em rendimentos menores de animais.
    2. Para a colocação de ovos, coloque 8-12 adultos gravid em uma placa padrão de NGM-ágar semeada com bactérias de escolha e documente o número exato de animais colocados em um prato.
      NOTA: Os procedimentos de deitaria devem ser realizados na temperatura que será utilizada para experimentação.
    3. Deixe os animais colocarem ovos por 4-8 h.
      NOTA: A duração que os animais são deixados na placa pode ser ajustada quando necessário. Por exemplo, um número maior de animais pode ser colocado em um prato para uma duração mais curta de deitar ovos quando menos tempo está disponível. C. elegans geralmente colocam ovos em rajadas, que podem ser estimados a uma taxa de aproximadamente cinco ovos/h para animais com fecundidade tipo selvagem43. Siga as recomendações da etapa 1.3.16 para evitar a sobreplacar animais.
    4. Remova todos os animais adultos da placa.
      NOTA: Todos os animais adultos deixados na placa continuarão a colocar ovos, resultando em uma população dessincronizada.
    5. Coloque os ovos a 15 °C por ~5 dias ou 20 °C por ~4 dias para chegar ao primeiro dia adulto.

2. Medir a longevidade em C. elegans

  1. Vida útil padrão
    1. Prepare as placas de NGM-ágar semeando placas com 100 μL de bactérias escolhidas. Para consistência, certifique-se de que a mesma bactéria seja usada em todas as réplicas. Uma vez que os vermes são movidos todos os dias durante as fases de colocação de ovos da idade adulta, sementes de cinco a sete conjuntos de placas de NGM-ágar durante a duração da vida útil, e duas a quatro placas por cepa para cultivar animais até a idade adulta (ou seja, se usar oito placas de 15 animais para a vida útil, é preciso semear 40-56 pratos por condição).
    2. Deixe as placas secarem durante a noite antes do armazenamento.
      NOTA: Recomenda-se que as placas sejam armazenadas a 4 °C, e o número necessário de placas seja removido do armazenamento frio diariamente para evitar que as bactérias tornem os gramados espessos que possam dificultar a vida útil/contagem. Certifique-se de que as placas são aquecidas antes de emplacamento de vermes.
    3. Colete uma população sincronizada de C. elegans usando um ensaio de branqueamento padrão descrito nas etapas 1.3 e 1.4.
    4. Mova 10-15 dias 1 animais adultos para 8-12 pratos cada. Para uma vida útil padrão, comece com ~120 animais para garantir que o tamanho da amostra não caia muito abaixo de 100 após eventos de censura (por exemplo, oito placas de 15 animais = 120 animais; 12 placas de 10 animais = 120 animais).
      NOTA: No caso atual, 10-15 animais são um número gerenciável para a maioria dos investigadores, embora seis placas de 20 animais também sejam viáveis para diminuir o custo dos materiais de consumo.
    5. Durante os primeiros 7-8 dias ou até que a prole não seja mais visível, mova animais adultos para longe de seus descendentes a cada 1-2 dias.
      NOTA: Os animais podem ser movidos a cada dois dias para salvar materiais, mas deve-se tomar cuidado para garantir que os ovos/animais larvais não sejam transferidos com o adulto para evitar a contaminação de populações adultas com prole. Neste estudo, o método mais simples é mover animais todos os dias a partir dos dias 1-3, quando a colocação de ovos está no seu máximo, e depois mudar para animais em movimento a cada dois dias durante os dias 5-8, quando a colocação de ovos é mínima. Com este método, não é imperativo impedir a transferência de ovos/animais larvais durante os dias 1-3, uma vez que os adultos serão movidos todos os dias, e ovos/larvas não podem se desenvolver até a idade adulta em 1 dia.
    6. Depois que os animais pararam de produzir descendência, marque a vida útil a cada dois dias até que todos os animais tenham sido marcados como mortos ou censurados. Remova todos os animais mortos ou censurados da placa para evitar confusão e recontar o mesmo animal.
      NOTA: A morte é pontuada como animais que não exibem nenhum movimento quando suavemente tocados com uma picareta. A censura é pontuada como animais ensacados, exibem saliências vulval/intestinais, ou rastejam até os lados da placa onde se dessinsicuram.
  2. Vida útil com esterilização química usando FUDR
    1. Prepare as placas de NGM-ágar semeando placas com 100 μL de bactérias escolhidas. Para consistência, certifique-se de que a mesma bactéria seja usada em todas as réplicas. Sementes 8-12 pratos por cepa para experimentos de vida útil, e duas a quatro placas por cepa para cultivar animais até a idade adulta. Deixe as placas secarem durante a noite.
    2. Adicione 100 μL de 10 mg/mL FUDR no meio do gramado bacteriano para as placas de 8-12 que serão usadas para o ensaio de vida útil. Lembre-se de deixar de duas a quatro placas sem FUDR como placas de partida para permitir que os animais cresçam até a idade adulta. Deixe as placas secarem durante a noite.
      ATENÇÃO: O FUDR bloqueia a síntese de DNA e, portanto, recomenda-se usar luvas durante o manuseio.
    3. Colete uma população sincronizada de C. elegans usando um ensaio de branqueamento padrão descrito nas etapas 1.3 e 1.4.
      NOTA: Esses animais precisam ser cultivados em placas sem FUDR, pois a FUDR fará com que os animais sejam presos/mortos.
    4. Mova de 10 a 15 dias 1 animais adultos em 8-12 placas cada, contendo FUDR. Para uma vida útil padrão, comece com ~120 animais para garantir que o tamanho da amostra não caia muito abaixo de 100 após eventos de censura (por exemplo, oito placas de 15 animais = 120 animais; 12 placas de 10 animais = 120 animais).
      NOTA: Os animais também podem ser movidos para o FUDR na fase L4 se for imperativo que a formação de descendentes seja completamente evitada, mas os animais não devem ser movidos muito cedo, pois isso fará com que os animais estejam em maior risco para saliências vulval/intestinal e aumentarão a censura.
    5. Marcar vida útil a cada dois dias até que todos os animais tenham sido marcados como mortos ou censurados. Remova todos os animais mortos ou censurados da placa para evitar confusão e recontar o mesmo animal.
      NOTA: Para a vida útil do FUDR, qualquer descendência pode ser ignorada, pois eles vão prender na fase L1 e eventualmente morrer.
  3. Vida útil usando mutantes estéreis sensíveis à temperatura
    1. Prepare as placas de NGM-ágar semeando placas com 100 μL de bactérias escolhidas. Para consistência, certifique-se de que a mesma bactéria seja usada em todas as réplicas. Sementes 8-12 pratos por cepa para experimentos de vida útil, e 2-4 placas por cepa para cultivar animais até a idade adulta. Deixe as placas secarem durante a noite.
    2. Colete uma população sincronizada de C. elegans usando um ensaio de branqueamento padrão descrito nas etapas 1.3 e 1.4. Lembre-se de cultivar animais na temperatura restritiva de 25 °C para garantir que os animais sejam estéreis.
    3. Mova 10-15 dias 1 animais adultos para 8-12 pratos cada. Para uma vida útil padrão, comece com ~120 animais para garantir que o tamanho da amostra não caia muito abaixo de 100 após eventos de censura (por exemplo, oito placas de 15 animais = 120 animais; 12 placas de 10 animais = 120 animais).
    4. Marcar vida útil a cada dois dias até que todos os animais tenham sido marcados como mortos ou censurados. Remova todos os animais mortos ou censurados da placa para evitar confusão e recontar o mesmo animal.
      NOTA: Ao lidar com cepas de curta duração, recomenda-se marcar vida útil todos os dias, pois a expectativa de vida a 25 °C é muito menor e, portanto, o alcance dinâmico é limitado. Na experiência dos autores, os animais podem ser deslocados de volta para 20 °C após o dia 2, e os animais permanecerão estéreis se for preferível marcar vida útil a 20 °C.

3. Medindo a vida saudável em C. elegans

  1. Medições do comportamento locomotório através de espancamento
    1. Colete uma população sincronizada de C. elegans usando um ensaio de branqueamento padrão descrito nas etapas 1.3 e 1.4.
    2. Mova uma pequena colônia de vermes adultos do primeiro dia para uma placa NGM-ágar sob um escopo dissecando em 10-20 μL de solução M9. 10-15 animais são recomendados como um número controlável de animais para contar.
    3. Focando-se em um verme de cada vez, conte o número de vezes que o espécime muda de côncavo para formação cônvexa em 15 s. Use um contador de mão e um temporizador para que o foco possa ser colocado no worm durante a duração do ensaio.
      NOTA: Um vídeo da placa pode ser gravado para uma análise mais completa/fácil. Por exemplo, os acessórios padrão da ocular do microscópio estão disponíveis para a maioria dos smartphones e câmeras digitais ($15-$30), e estas são uma ótima opção para a captura de vídeo a um custo baixo.
    4. Repita o passo 3.1.3 para os outros vermes no líquido, com uma taxa de motilidade total para 10-15 vermes. Para maior tamanho amostral, repita as etapas 3.1.2-3.1.4.
    5. Envelhecer vermes para a idade desejada. Métodos semelhantes para ensaios de vida útil descritos nas etapas 2.1-2.3 podem ser usados para envelhecer vermes. Repetir passos 3.1.2-3.1.4 para avaliar a surra nas idades desejadas.
      NOTA: Um método alternativo para a etapa 3.1.2 é adicionar ~30 μL ou mais de solução M9 em um grupo de worms em uma placa. Isso poupará tempo de ter que transferir worms manualmente, embora devido à chance aleatória de onde os vermes estão em uma única placa, não há garantia de que um grupo de vermes permanecerá em um único ponto na placa.
  2. Medidas de fecundidade (contagem de ovos) em C. elegans
    1. Colete uma população sincronizada de C. elegans usando um ensaio de branqueamento padrão descrito nas etapas 1.3 e 1.4. Os ensaios para a contagem de ovos começam na etapa L4, que é ~1 dia antes do dia 1 adulto (~3 dias a 15 °C ou ~2 dias a 20 °C após a prisão de L1).
    2. Desestacou os vermes L4 em placas ngm-ágar separadas semeadas com bactérias escolhidas. Recomenda-se que ~10-15 animais sejam usados para um ensaio de fecundidade.
      NOTA: Recomenda-se diluir as bactérias escolhidas em 50% (ou seja, não uma cultura saturada) para melhorar a visibilidade do ovo no gramado bacteriano.
    3. Permita que os animais cresçam durante a noite a 20 °C. Certifique-se de que um lote recém-semeado de placas esteja pronto para o dia seguinte.
    4. No primeiro dia da idade adulta, transfira vermes adultos para placas frescas de NGM-ágar semeadas com as bactérias diluídas escolhidas.
      NOTA: Recomenda-se usar placas recém-semeadas, ou armazenar placas a 4 °C até que usem para evitar gramados bacterianos espessos.
    5. Conte o número total de ovos colocados em cada placa de NGM-ágar.
      NOTA: Para auxiliar na digitalização da placa, uma grade pode ser desenhada na tampa de uma placa e colocada sob a placa que está sendo marcada para ovos. A placa pode então ser escaneada ao longo das linhas da grade para manter a orientação à medida que a placa é movida e evitar a recontagem de quaisquer ovos.
    6. Repita as etapas 3.2.4-3.2.5 por 7-8 dias ou até que os ovos não estejam mais visíveis na placa.
      NOTA: Para os dias 1-3, quando as taxas de colocação de ovos são altas, recomenda-se mover animais pelo menos a cada 12 horas e avaliar a contagem de ovos duas vezes ao dia. No entanto, isso aumenta a quantidade de trabalho e os custos de consumíveis, e assim os animais e medidas móveis podem ser limitados a uma vez por dia, mas deve-se tomar cuidado para garantir que todos os ovos e animais eclodidos sejam contados adequadamente. Todos os animais eclodidos são contados como ovos para o propósito deste ensaio.
  3. Medição do tamanho da ninhada (desenvolvimento) de C. elegans progênero
    1. Colete uma população sincronizada de C. elegans usando um ensaio de branqueamento padrão descrito nas etapas 1.3 e 1.4. Os ensaios para o tamanho da ninhada começam na fase L4, que é ~1 dia antes do dia 1 adulto (~3 dias a 15 °C ou ~2 dias a 20 °C após a prisão de L1).
    2. Desestacou os vermes L4 em placas ngm-ágar separadas semeadas com bactérias escolhidas. Recomenda-se que ~10-15 animais sejam usados para um ensaio de fecundidade.
    3. Permita que os animais cresçam durante a noite a 20 °C. Certifique-se de que um lote recém-semeado de placas esteja pronto para o dia seguinte.
    4. No primeiro dia da idade adulta, transfira vermes adultos para placas frescas de NGM-ágar semeadas com bactérias escolhidas.
    5. A cada 12-24 h (2x por dia ou 1x por dia), transfira vermes adultos para placas frescas de NGM-ágar semeadas com bactérias escolhidas por 7-8 dias ou até que a prole não seja mais visível. Mantenha todas as placas contendo ovos a 20 °C.
    6. Repita o passo 3.3.5 por 7-8 dias ou até que a prole não esteja mais visível. Mantenha todas as placas contendo ovos a 20 °C.
      NOTA: As placas de progênero também podem ser armazenadas a 15 °C para estender o tempo antes de serem pontuadas.
    7. Dois dias depois de transferir vermes, conte a descendência desenvolvida nas placas. Conte os vermes em desenvolvimento na fase L4 (ou seja, 2 dias após o hatch a 20 °C) ou antes para garantir que a geração F2 (ou seja, descendente de descendentes) não conflita resultados. Conte todos os vermes que estão vivos.
      1. Remova todos os vermes da placa como eles são contados. Mantenha as placas por mais 1-2 dias antes de pontuá-las novamente para garantir que quaisquer animais com eclosão/desenvolvimento atrasados não sejam perdidos.
    8. Repita o passo 3.3.7 para cada prato de ovo coletado.
      NOTA: Os ensaios de tamanho da ninhada podem ser conduzidos em conjunto com o ensaio de contagem de ovos (etapa 3.2) para minimizar o trabalho e os custos de consumíveis coletando dois conjuntos de dados de um experimento. Isso também permitirá a comparação direta do tamanho da ninhada e da contagem de ovos dentro dos mesmos animais.

4. Medir a resiliência do estresse em C. elegans

  1. Medidas de sensibilidade ao estresse do ER usando t tunicamicina
    1. Prepare as placas de NGM-ágar por semeadura de placas contendo tunicamycin (ver passo 1.1.7, NOTA) com 100 μL de bactérias de escolha.
      ATENÇÃO: As luvas devem ser usadas ao manusear a tunicamicina.
    2. Para consistência, certifique-se de que a mesma bactéria seja usada em todas as réplicas. Sementes 8-12 placas de t tunicamiciccin por cepa para ensaios de sobrevivência, e duas a quatro placas sem tunicamicina por cepa para cultivar animais até a idade adulta. Deixe as placas secarem durante a noite.
    3. Colete uma população sincronizada de C. elegans usando um ensaio de branqueamento padrão descrito nas etapas 1.3 e 1.4.
      NOTA: Os animais devem ser cultivados em placas sem túnica até o primeiro dia da idade adulta, pois os animais prenderão/morrerão na tunicamicina.
    4. Mova 10-15 dias 1 animais adultos para 8-12 pratos cada. Para um padrão de ensaios de sobrevivência, comece com ~120 animais para garantir que o tamanho da amostra não caia muito abaixo de 100 após eventos de censura (por exemplo, oito placas de 15 animais = 120 animais; 12 pratos de 10 animais = 120 animais).
      NOTA: Semelhante aos ensaios da FUDR, ensaios de sobrevivência de túnica podem ser realizados sem animais em movimento, pois a túnica causa morte/apreensão de animais L1. No entanto, ao realizar um controle DMSO, a prole se desenvolverá em placas DMSO, de modo que os animais precisam ser movidos diariamente ou uma técnica de esterilização será necessária (métodos idênticos usados na seção 2 para vida útil podem ser usados para ensaios de sobrevivência).
    5. Ensaios de sobrevivência são pontuados semelhantes ao tempo de vida. Remova todos os animais mortos ou censurados da placa para evitar confusão e recontar o mesmo animal.
      NOTA: Embora seja possível escorrpor animais a cada dois dias, uma vez que a morte ocorre rapidamente na tunicamicina, recomenda-se pontuar ensaios de sobrevivência diariamente.
  2. Medições da sensibilidade ao estresse mitocondrial/oxidativo usando paraquat
    1. Preparar placas de NGM-ágar por semeadura de placas contendo paraquat (ver passo 1.1.7; NOTA) com 100 μL de bactérias de escolha.
      ATENÇÃO: As luvas devem ser usadas ao manusear paraquat, pois é um risco ambiental. Verifique com a saúde ambiental e a segurança da instituição para os requisitos de descarte, pois muitas instituições de pesquisa exigirão instruções específicas de descarte para riscos ambientais.
    2. Para consistência, certifique-se de que a mesma bactéria seja usada em todas as réplicas. Sementes 8-12 placas por cepa para ensaios de sobrevivência, e duas a quatro placas sem paraquat por cepa para cultivar animais até a idade adulta. Deixe as placas secarem durante a noite.
    3. Colete uma população sincronizada de C. elegans usando um ensaio de branqueamento padrão descrito nas etapas 1.3 e 1.4.
      NOTA: Lembre-se de cultivar animais em placas sem paraquat até o primeiro dia da idade adulta; no entanto, é necessário realizar uma técnica de esterilização ou afastar os adultos da prole, pois alguns animais podem se desenvolver até a idade adulta em placas de paraquat (ver passos 2.2-2.3).
    4. Mova 10-15 dias 1 animais adultos para 8-12 pratos cada. Para um ensaio de sobrevivência padrão, comece com ~120 animais para garantir que o tamanho da amostra não caia muito abaixo de 100 após eventos de censura (por exemplo, oito placas de 15 animais = 120 animais; 12 placas de 10 animais = 120 animais).
    5. Ensaios de sobrevivência são pontuados semelhantes ao tempo de vida. Remova todos os animais mortos ou censurados da placa para evitar confusão e recontar o mesmo animal.
      NOTA: Embora seja possível escorridar animais a cada dois dias, uma vez que a morte ocorre rapidamente no paraquat, recomenda-se pontuar ensaios de sobrevivência diariamente. Isso é especialmente verdade quando o uso de animais glp-4(bn2) cultivados a 25 °C, pois a morte ocorrerá muito rapidamente.
  3. Medições da sensibilidade ao estresse térmico (termotolerância) utilizando temperaturas elevadas
    1. Colete uma população sincronizada de C. elegans usando um ensaio de branqueamento padrão descrito nas etapas 1.3 e 1.4.
    2. Placas de NGM-ágar pré-aquecidas a 37 °C antes de mover animais para placas colocando placas em uma incubadora de 37 °C por pelo menos 1 h.
    3. Mova 10-15 dias 1 animais adultos para quatro a seis pratos pré-aquecidos cada. Para uma termotolerância padrão, comece com ~60 animais (por exemplo, quatro placas de 15 animais = 60 animais; seis placas de 10 animais = 60 animais)
    4. Coloque os animais em uma incubadora de 37 °C e marque para a morte a cada 2 horas. A morte é definida como animais que não exibem movimento quando suavemente tocados com uma picareta. Remova todos os animais mortos ou censurados da placa para evitar confusão e recontar o mesmo animal.
    5. Certifique-se de que as placas sejam removidas da incubadora de 37 °C pelo tempo mínimo possível, pois as placas que são deixadas à temperatura ambiente por longas durações enquanto a pontuação alterará os resultados da termotolerância.
      NOTA: Recomenda-se retirar apenas uma cepa de cada vez para marcar, pois a temperatura do ágar não deve mudar drasticamente no tempo que leva para marcar uma cepa.
    6. A termotolerância mediana é geralmente realizada em 7-9 h; por isso, certifique-se de um ensaio adequado às 7h, 9h e 11h.
      NOTA: Embora 1-5 h possa ser pulado, devido à variabilidade das incubadoras, à espessura das placas e outros fatores de confusão em cada laboratório, é importante que o tempo seja titulado cuidadosamente em cada laboratório se os pontos de tempo forem planejados para serem ignorados. Consulte a referência 44 para obter um guia completo sobre termotolerância.
    7. Alternativamente, realize o ensaio de termotolerância a 34 °C em vez de 37 °C.
      NOTA: A termotolerância mediana a 34 °C ocorre muito mais tarde (10-14 h neste estudo), o que permite que os ensaios de termotolerância sejam preparados tarde da noite (colocados em uma incubadora de 34 °C) e para pontuação começar cedo no dia seguinte. Isso permite ~8h de pontuação contínua em vez do período típico de 12 h necessário para um ensaio de termotolerância de 37 °C.

Resultados

C. elegans são um excelente organismo modelo para pesquisas de envelhecimento devido a uma grande maioria dos mecanismos de envelhecimento sendo conservados com humanos. É importante ressaltar que eles têm um custo muito baixo em manutenção e experimentação com requisitos mínimos para equipamentos e consumíveis, tornando-os um cobiçado sistema de modelo para instituições com fundos limitados. Além disso, uma infinidade de ensaios simples com curvas de aprendizagem rasas faz deles um excelente sistema até mesmo para o investigador mais jovem com pouca ou nenhuma experiência. Todos esses fatores combinados com a poderosa genética de C. elegans , incluindo a facilidade de edição de genomas, milhares de mutantes disponíveis e animais transgênicos a custos nominais, e bibliotecas RNAi disponíveis para knockdown genético de praticamente todos os genes fazem deles um sistema ideal para instituições de graduação. Aqui, alguns dos métodos de menor custo para estudar o envelhecimento em C. elegans são pesquisados, focando principalmente em ensaios com equipamentos mínimos e custo consumível, bem como curvas de aprendizagem rasas. De fato, a totalidade dos protocolos e coleta de dados foi escrita/realizada por pesquisadores juniores com <5 meses de experiência em pesquisa, em sua maioria estudantes de graduação.

Estudos de longevidade em C. elegans são muito simples devido à curta vida útil dos animais, variando de 14 a 20 dias. É importante ressaltar que os ensaios de vida são altamente padronizados e exigem apenas uma incubadora, um microscópio de dissecção padrão, uma picareta de verme padrão e consumíveis para a preparação de placas de NGM-ágar. Talvez o aspecto mais proibitivo de custos das medições de vida útil em C. elegans seja necessário consumíveis. Isso porque C. elegans são hermafroditas que se auto-fertilizam; portanto, os adultos que estão sendo rastreados para ensaios de longevidade precisam ser afastados da progênera diariamente. No entanto, os animais podem ser esterilizados expondo-os ao FUDR ou usando mutantes, como o mutante sem germinas sem temperatura glp-4(bn2) cultivado a 25 °C proibitivo para reduzir a quantidade de consumíveis necessários 30,31,32. Aqui, os ensaios de vida foram realizados com FUDR ou com os mutantes sem germina glp-4(bn2), que mostram resultados semelhantes às expectativas de vida padrão realizadas em animais não estéreis. Embora a vida útil do tipo selvagem não seja idêntica devido aos efeitos do FUDR45 ou ao crescimento a 25 °C na vidaútil 2, o animal de knockdown de curta duração hsf-1 mostra uma diminuição significativa na vida útil para todas as condições (Figura 1). hsf-1 codifica o fator de transcrição fator de choque térmico-1, que está envolvido na regulação da resposta ao estresse térmico, e seu knockdown resulta em uma diminuição significativa na vidaútil 38,46.

Embora a longevidade seja um fator importante a ser considerado na biologia do envelhecimento, muitas vezes, a longevidade não se correlaciona com o aumento da saúde, mesmo em C. elegans47. Assim, como abordagem complementar, oferecemos diversos métodos de medição da saúde do organismo, incluindo saúde reprodutiva, comportamento locomotório e resiliência ao estresse. A saúde reprodutiva pode ser medida de duas maneiras. Em primeiro lugar, as medidas da contagem de óvulos darão uma medição direta de quantos ovos são colocados por uma única hermafrodita auto-fertilizadora. No entanto, como os animais produzem mais oócitos do que espermatozoides, alguns óvulos não fertilizados que nunca produziriam prole viáveis também são colocados48. Portanto, para entender melhor a verdadeira capacidade reprodutiva de um animal, as medidas do tamanho da ninhada fornecem uma medida de quantos descendentes viáveis são produzidos. Muitas vezes, o aumento da resiliência ao estresse pode realmente diminuir a capacidade reprodutiva, potencialmente devido ao efeito inerente do estresse percebido na reprodução49. Da mesma forma, uma diminuição significativa no número de ovos colocados e no tamanho da ninhada é encontrada em animais de superexpressão hsf-1 em comparação com controles do tipo selvagem (Figura 2A,B). De fato, alguns animais de superexpressão hsf-1 apresentam total esterilidade, fornecendo evidências de que a saúde reprodutiva pode ser inversamente correlacionada com a longevidade.

Embora a saúde reprodutiva seja importante para a compreensão da saúde germinal, da meiose funcional e da capacidade reprodutiva, em geral, não há correlação direta entre longevidade e tamanho de ninhada50. Assim, como abordagem complementar, o comportamento locomotório é oferecido como um método padrão-ouro para avaliar a saúde de C. elegans durante o envelhecimento51. Existem muitos métodos para medir o comportamento locomotório, mas a maioria dos métodos requer câmeras sofisticadas, software de rastreamento ou produtos químicos caros. Em contraste, os ensaios de thrashing não exigem praticamente nenhum equipamento além do que um laboratório padrão C. elegans está equipado com: microscópio dissecando, picareta de vermes, pipeta e consumíveis para fazer placas de NGM-ágar. As taxas de desarmamento fornecem um método confiável para medir a vida saudável durante o envelhecimento, medida por uma diminuição significativa da surra em animais velhos em comparação com animais jovens (Figura 2C).

Finalmente, a sobrevivência aos ensaios de estresse é uma medida fisiológica adicional de resiliência. A capacidade de ativar as respostas ao estresse geralmente diminui durante o processo de envelhecimento, tornando os animais menos resistentes e mais sensíveis ao estresse. Assim, a resiliência do estresse pode ser usada como um proxy confiável para a saúde do organismo. Aqui, são oferecidos métodos para o levantamento da sensibilidade a 1) estresse do ER em resposta à exposição à túamamicina, agente químico que bloqueia a glicossição ligada a N e resulta no acúmulo de proteínas mal dobradas no ER; 2) estresse mitocondrial/oxidativo através da exposição ao paraquat, agente químico que induz a formação de superóxido em mitocôndrias; e 3) estresse térmico através da exposição a temperaturas elevadas. Para ensaios de tunicamicina e paraquat, a droga é incorporada na placa NGM-ágar durante a produção de placas. Para altas concentrações de tunicamicina, a prole geralmente não se desenvolve e, portanto, as técnicas de esterilização não precisam ser utilizadas. O protocolo aqui apresentado recomenda 25 ng/μL como concentração final de tunicamicina, mas para aqueles com fundos limitados, 10 ng/μL também mostra uma redução significativa na sobrevida (Figura 3A). Ambas as concentrações limitam o desenvolvimento de progêneses e, portanto, não são necessários métodos de esterilização, embora o controle do DMSO exija uma técnica de esterilização ou movimento de animais em novas placas. Isso porque a toxicidade da tunicamicina previne o desenvolvimento da prole, mas o DMSO é praticamente não tóxico, o que permite que a prole se desenvolva totalmente quando cultivada em túmica.

Para ensaios paraquat, uma técnica de esterilização ou movimento de animais é necessária, pois o tratamento paraquat não impede que a prole se desenvolva até a idade adulta. Altos níveis de paraquat (4 mM) reduzem significativamente a vida útil, enquanto os baixos níveis de paraquat (0,25 mM) aumentam a vida útil devido a um efeito hormético (Figura 3B), consistente com os resultados publicados anteriormente52. Finalmente, os ensaios de termotolerância requerem apenas uma incubadora que pode chegar a 30-37 °C, e não são necessários reagentes adicionais. A superexpressão do hsf-1 aumenta a termotolerância a 37 °C (Figura 3C) conforme publicado anteriormente53. No entanto, como outros mostraram anteriormente e a partir dos dados atuais, o grande problema com os ensaios de termotolerância é a sua variabilidade. Muitos fatores podem contribuir para a variabilidade dentro de ensaios de termotolerância, incluindo diferenças entre incubadoras e o tempo que os animais passam fora da incubadora enquanto pontuam termotolerância a cada hora. Para obter uma diretriz completa de termotolerância, consulte a referência 41.

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Figura 1: Comparação de medidas de vida útil com e sem esterilização. (A) Tempo de vida de nematoides N2 de tipo selvagem cultivados em placas de NGM-ágar semeadas com vetor vazio (ev) ou bactérias hsf-1 RNAi a 20 °C. Os animais foram retirados da prole nos dias 1, 3, 5 e 7 da idade adulta. (B) Vida útil de nematoides N2 do tipo selvagem cultivados em placas NGM-ágar-FUDR semeadas com vetor vazio (ev) ou bactérias hsf-1 RNAi a 20 °C. Os animais foram cultivados até a idade adulta em placas padrão ev ou hsf-1 RNAi, e depois transferidos para placas fudr no primeiro dia da idade adulta. (C) Vida útil de animais mutantes glp-4(bn2) cultivados em placas de NGM-ágar semeadas com vetor vazio (ev) ou hsf-1 RNAi a 25 °C. Para todas as condições, os animais eram marcados para a morte a cada 2 dias até que todos os animais fossem registrados como mortos ou censurados. Animais com ensacamento, saliência ou explosão da vulva, ou aqueles que rastejavam pelos lados das placas e dessecados foram censurados. Todas as estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste Log-Rank Mantel-Cox e podem ser encontradas na Tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Contagem de ovos, tamanho da ninhada e surra como medidas de saúde. (A) Ensaios de thrashing foram realizados em animais mutantes glp-4(bn2) cultivados em placas de NGM-ágar semeadas com vetor vazio a 25 °C no dia 1 (azul), dia 4 (vermelho) e dia 9 (verde). Thrashing foi pontuado em animais colocados em solução M9 em uma placa NGM-ágar, vídeo gravado usando uma câmera de smartphone padrão montado em uma ocular de um escopo de dissecação padrão, e surras pontuadas em câmera lenta para precisão. n = 15 animais por condição. (B) As contagens de ovos foram medidas em animais do tipo selvagem N2 (azul) e sur-5p::hsf-1 (vermelho). Os animais foram cultivados a 20 °C e movidos para placas frescas, e os ovos foram contados a cada 12 h. O número total de ovos colocados foi somado. n = 7 animais para tipo selvagem e 9 animais para sur-5p::hsf-1. (C) Os ensaios de ninhadas foram medidos nos mesmos animais que (B) onde os ovos foram cultivados a 20 °C por 2 dias para permitir a eclosão, e todos os ovos eclodidos foram contados. = p < 0,001 calculados utilizando testes não paramétricos de Mann-Whitney. Cada ponto representa um único animal, e as linhas representam a faixa mediana e interquartil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Resiliência do estresse como proxy para a saúde do organismo. (A) Ensaio de sobrevivência de animais N2 cultivados na bactéria rnai vetor vazia a 20 °C. Os animais foram movidos para placas contendo 1% DMSO, 10 ng/μL tunicamycin (TM), ou 25 ng/μL TM no primeiro dia da idade adulta. (B) Ensaio de sobrevivência de animais N2 cultivados na bactéria rnai vetor vazia a 20 °C. Os animais foram cultivados a partir da escotilha em placas contendo água, 0,25 mM paraquat (PQ), ou 4 mM PQ. Para A-B, os animais eram marcados para a morte a cada 2 dias até que todos os animais fossem registrados como mortos ou censurados. Animais com ensacamento, saliência ou explosão da vulva, ou aqueles que rastejavam pelos lados das placas e dessecados foram censurados. Todas as estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste Log-Rank Mantel-Cox (Tabela 2). (C) Dados agrupados de todos os ensaios de termotolerância de 37 °C para animais N2 do tipo selvagem versus superexpressão de hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Os dados são representados como por cento vivos no tempo = 9h de um ensaio termotolerância, com cada linha representando um experimento combinado realizado no mesmo dia. Os animais foram cultivados na bactéria rnai vetor vazia a 20 °C e movidos para 37 °C no primeiro dia de idade adulta para ensaio. n = 60 animais por cepa por réplica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ReagenteReceita
Solução alvejanteHipoclorito de sódio de 1,8% (v/v), 0,375 M KOH
CarbenicilinaSolução de estoque de 100 mg/mL (1000x) na água. Armazenar a 4 °C por até 6 meses ou -20 °C para armazenamento a longo prazo
FUDRSolução de 10 mg/mL na água. Armazenar a -20 °C.
IPTGSolução de 1 M na água.
Caldo de Lysogeny (LB)Neste protocolo, foi utilizada a LB comercial (ver Tabela de Materiais), mas todas as receitas padrão de LB caseiras usando Bacto-tryptone, extrato de levedura e NaCl são suficientes.
Solução M922 mM KH2PO4 monobásico, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Mídia de Crescimento de Nematoides (NGM)1 mM CaCl2, 5 μg/mL colesterol, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) ágar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl
Placas NGM RNAi1 mM CaCl2, 5 μg/mL de colesterol, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL carbenicilina/ampicillina. Armazenar a 4° C no escuro por até 3 meses
NGM RNAi DMSO1 mM CaCl2, 5 μg/mL de colesterol, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL carbenicilina/ampicillina; 1% DMSO
(controle para t tunicamycina)
NGM RNAi TM1 mM CaCl2, 5 μg/mL de colesterol, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL carbenicilina/ampicillina; 1% DMSO, 25 ng/μL tunicamycin
ParaquatoSolução de 400 mM na água – deve ser preparada fresca
TetraciclinaSolução de estoque de 10 mg/mL (500x) em 100% etanol. Armazenar a -20 °C
TunicamycinSolução de estoque de 2,5 mg/mL em 100% DMSO. Armazene a -80 °C para armazenamento a longo prazo. Esta é uma solução de 100x (solução de trabalho de 25 ng/μL)

Mesa 1. Receitas de reagentes e mídia para protocolos.

Painel figura correspondenteTensão, TratamentoVida útil mediana# Mortes/# Totalp-valor
(Log-Rank)
1AN2, vetor RNAi, 20 °C1774/120--
N2, hsf-1 RNAi, 20 °C1165/120<0.001
1BN2, vetor RNAi, FUDR, 20 °C19120/120--
N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C11116/120<0.001
1CN2, glp-4(bn2), vetor RNAi, 25 °C13115/121--
N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C4120/120< 0,001
2AN2, vetor RNAi, 20 °C, 1% DMSO1985/120--
N2, vetor RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunicamycin15109/120<0.001
N2, vetor RNAi, 20 °C, 25 ng/μL tunicamycin12117/120<0.001
2BN2, vetor RNAi, 20 °C1984/120--
N2, vetor RNAi, 20 °C, 0,25 mM paraquat2491/120<0.001
N2, vetor RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat650/120<0.001

Mesa 2. Estatísticas para a vida útil e resiliência do estresse.

Discussão

A vida útil, mais simplesmente definida como a duração da vida, é um fenômeno binário claro na maioria dos organismos - ou um organismo está vivendo ou não. No entanto, a longevidade nem sempre se correlaciona com a saúde de um organismo. Por exemplo, modelos de hormose mitocondrial onde a exposição ao estresse mitocondrial aumenta drasticamente a vida útil são geralmente alguns dos animais mais longevos, mas apresentam crescimento atrofiado e diminuição da função metabólica37,54. Da mesma forma, animais com respostas hiperativas de estresse reticulum endoplasmático também apresentam certos comportamentos e fenótipos que podem ser correlacionados com a diminuição da saúde, apesar de terem melhorado drasticamente a homeostase proteica e a vidaútil 36,49. Finalmente, muitos paradigmas de longevidade em organismos modelo, incluindo aumento da função HSF-155, aumento da função XBP-156, e sinalização foxo alterada57 estão todos correlacionados com o aumento do risco de câncer, e é indiscutível que a vida útil prolongada não é benéfica se um organismo está em uma luta constante contra o câncer e outras doenças de saúde. Portanto, a longevidade não pode ser uma medida autônoma na biologia do envelhecimento.

Assim, o conceito de saúde tem sido um campo crescente na biologia do envelhecimento. A vida saudável, vagamente definida como o período de vida que se é saudável, é mais difícil de determinar do que a longevidade. No entanto, ao contrário da longevidade, o conceito de "saúde" é complicado, pois há muitas leituras diferentes para a saúde do organismo: no nível do organismo, há função/força muscular, função neuronal/cognitiva, saúde reprodutiva, etc.; no nível celular há homeostase proteica, homeostase lipídica, homeostase de glicose, metabolismo, etc. Em 2014, biólogos envelhecidos caracterizaram definitivamente marcas biológicas do envelhecimento com a definição estruturada de que deve ser algo que naturalmente se quebra durante o envelhecimento e pode ser alterado experimentalmente de tal forma que a exacerbação experimental deve acelerar o envelhecimento e a intervenção experimental deve retardar o envelhecimento. Essas nove marcas do envelhecimento incluem instabilidade genômica, atrito de telômeros, alterações epigenéticas, perda de homeostase proteica (proteostase), exaustão de células-tronco, sinalização intercelular alterada, disfunção mitocondrial, sensoriamento de nutrientes desregulamentado e senescência celular58. Desde então, inúmeros estudos argumentam que outros fatores devem ser incluídos, incluindo proteínas extracelulares e fisiologia sistêmica, como imunidade e inflamação59. Em última análise, a definição complexa de healthspan determina que a saúde do organismo seja medida usando múltiplos métodos diferentes.

Portanto, neste manuscrito, são apresentados múltiplos métodos para medir vários aspectos da saúde utilizando o modelo nematode, C. elegans. Nós dizemos comportamento locomotório usando ensaios de espancamento, saúde reprodutiva usando contagem de ovos e tamanho de ninhada, e sensibilidade ao estresse. De fato, o comportamento locomotório é um método padrão-ouro para medir a saúde, pois os organismos apresentam perda significativa de motilidade e movimento durante o envelhecimento51. A perda de comportamento locomotório pode ser atribuída a múltiplas marcas do envelhecimento, já que a função muscular em C. elegans depende da proteostaseadequada 60, disfunção mitocondrial61 e sinalização neurônio-muscular62. Embora este manuscrito se concentre em uma medição do comportamento locomotório, é importante notar que existem muitos outros métodos, incluindo motilidade de animais em uma placa de ágar sólido, resposta ao toque51 e ensaios de quimiotaxis63. No entanto, esses métodos geralmente requerem dispositivos de gravação mais sofisticados, uso de software de rastreamento de worms ou uso de produtos químicos caros, perigosos ou voláteis, todos os quais podem ser proibitivos em algumas configurações de pesquisa.

Além disso, ensaios para contagem de óvulos e tamanho de ninhadas são apresentados como um método de medição da saúde reprodutiva e como o método mais simples para medir a divisão celular em vermes adultos, uma vez que os vermes adultos são pós-místicos e apenas células germinativas e embriões sofrem divisão celular dentro de um verme adulto64. Como medida de divisão celular, a saúde reprodutiva pode ser relevante para as marcas de envelhecimento da senescência celular e exaustão das células-tronco. A saúde reprodutiva pode ser afetada por muitos fatores, incluindo infecção patogênica65 ou exposição ao estresse49, embora não haja correlação direta entre saúde reprodutiva e longevidade. Na verdade, alguns animais de longa duração apresentam uma diminuição significativa no tamanho da ninhada49, e é até possível que exista uma correlação inversa entre longevidade e tamanho de ninhada50. Este não é um fenômeno específico para C. elegans, pois efeitos prejudiciais da reprodução sobre a longevidade têm sido observados há muito tempo em humanos66, cãescompanheiros 67 e camundongos68. Ainda assim, fornecemos a contagem de óvulos e o tamanho da ninhada como um método confiável e de baixo custo para medir a saúde reprodutiva com a ressalva de que a saúde reprodutiva pode não se correlacionar com a longevidade ou a vida saudável.

Finalmente, os ensaios de sobrevivência são oferecidos como medida indireta da saúde do organismo. É importante ressaltar que as respostas ao estresse celular69 e o estresseer 35 diminuem rapidamente durante o processo de envelhecimento e têm relevância direta para a marca de envelhecimento da proteostase70,71. Em contraste, as respostas de estresse hiperativantes podem aumentar significativamente a vida útil, promovendo a resiliência ao estresse 35,37,38. Embora este estudo se concentre nos métodos de custo mais simples e mais baixos, existem um grande número de métodos alternativos para ensaios de resiliência ao estresse para termotolerância41 e estresse oxidativo66, cada um exigindo um conjunto diferente de equipamentos e consumíveis. Além de estudos simples de exposição a estressores, outros métodos fisiológicos podem ser realizados dependendo do acesso aos equipamentos. Por exemplo, um analisador de fluxo extracelular pode monitorar a função mitocondrial e a respiração celular73; Microscópios de dissecção fluorescente permitirão medições de repórteres transcricionais para ativação de resposta ao estresse20; e microscópios compostos ou confocal de alta resolução podem ser usados para medir a morfologia organela com sondas fluorescentes para mitocôndrias74, o regômulo endoplasmático75,76 e o citoesqueleto de actina77.

Como um conto de advertência final para medidas de longevidade, enquanto métodos químicos e genéticos para esterilizar vermes são oferecidos para diminuir significativamente o custo, é importante notar que ambos podem impactar diretamente a vida útil. Por exemplo, a exposição ao FUDR foi relatada anteriormente para impactar tanto a vida útil quanto a termotolerância45. E enquanto o mutante glp-4(bn2) em si não tem nenhum efeito direto sobre a vida útil, o crescimento a 25 °C é um leve estresse térmico33,34 e, portanto, pode impactar a vidaútil 2. Existem outros métodos para esterilizar C. elegans, incluindo a esterilidade mediada pela auxina78 ou mutantes deficientes de temperatura79. No entanto, todos os métodos possuem algumas ressalvas, e deve-se tomar cuidado para utilizar o ensaio menos prejudicial para as necessidades científicas de cada laboratório. Uma limitação final dos estudos de longevidade é a variabilidade potencial que pode ocorrer devido a baixos tamanhos amostrais ou simplesmente por um erro objetivo do pesquisador. Isso pode ser contornado à medida que novas tecnologias nascem em tecnologias automatizadas de vidaútil 80, mas novamente esses sistemas são caros e exigem alguns equipamentos e habilidades de engenharia e computação. Em última análise, a coleção de métodos aqui fornecidos é um conjunto confiável de ferramentas que podem ser rapidamente adaptadas e aprendidas em quase qualquer instituição e fornecer uma base sólida para a biologia do envelhecimento.

Divulgações

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

A G.G. é apoiada pela T32AG052374 e a R.H.S. é apoiada pelo R00AG065200 do Instituto Nacional de Envelhecimento. Agradecemos ao CGC (financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) pelas cepas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
APEX IPTGGenesee18-242para RNAi
BactoAgar VWR90000-764para placas NGM
Bacto PeptoneVWR97064-330para placas NGM
Cloreto de cálcio di-hidratadoVWR97061-904para placas NGM
CarbenicilinaVWR76345-522para RNAi
ColesterolVWR80057-932para placas NGM
DMSOVWRBDH1115-1LPsolvente para medicamentos
LB CaldoVWR95020-778para LB
Sulfato de magnésio heptahidratadoVWR97062-132para placas NGM,
M9 ParaquatSigma-Aldrich36541para estresse oxidativo/mitocondrial
Cloreto de potássioVWR97061-566para solução de lixívia
Fosfato de potássio dibásicoVWREM-PX1570-2para placas NGM
Fosfato de potássio monobásicoVWREM-PX1565-5para M9
S7E Escopo de dissecaçãoLeica10450840Microscópio de dissecação padrão
Cloreto de sódioVWREM-SX0420-5para placas NGM,
M9 Hipoclorito de sódioVWRRC7495.7-32para solução de alvejante
Fosfato de sódio dibásicoVWR71003-472para
cloridrato de tetraciclinaVWR97061-638para RNAi
TunicamicinaSigma-AldrichT7765-50MGpara estresse ER
M9

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