A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas

Resumo

A técnica peel-blot é um método de preparação de grade crio-EM que permite a separação de amostras biológicas multicamadas e concentradas em camadas únicas para reduzir a espessura, aumentar a concentração da amostra e facilitar o processamento da imagem.

Resumo

A técnica de preparação de grade crio-EM peel-blot é um método de retroinjeção significativamente modificado com o objetivo de alcançar uma redução nas camadas de amostras de várias camadas. Essa remoção de camadas antes do congelamento por imersão pode ajudar a reduzir a espessura da amostra para um nível adequado para a coleta de dados crio-EM, melhorando a planicidade da amostra e facilitando o processamento da imagem. A técnica peel-blot permite a separação de membranas multilamelares em camadas únicas, de cristais 2D em camadas em cristais individuais e de estruturas empilhadas em forma de folha de proteínas solúveis para também serem separadas em camadas únicas. A alta espessura da amostra desses tipos de amostras frequentemente apresenta problemas insuperáveis para a coleta de dados crio-EM e processamento de imagem crio-EM, especialmente quando o estágio do microscópio deve ser inclinado para a coleta de dados. Além disso, grades de altas concentrações de qualquer uma dessas amostras podem ser preparadas para uma coleta de dados eficiente, uma vez que a concentração da amostra antes da preparação da grade pode ser aumentada e a técnica peel-blot ajustada para resultar em uma distribuição densa de amostra de camada única.

Introdução

A técnica peel-blot foi desenvolvida com o objetivo de separar cristais bidimensionais empilhados de proteínas de membrana em camadas únicas para obter amostras adequadamente finas para coleta de dados crio-EM 2D e 3D e facilitar o processamento de imagens¹. O protocolo é igualmente adequado para outros tipos de amostras multilamelares, bem como para alcançar altas concentrações de amostra de qualquer tipo de amostra na grade sem aumentar a espessura em Z.

A redução das camadas de amostra para uma camada é alcançada pela aplicação de uma combinação de pressão capilar e forças de cisalhamento em um protocolo que se estende substancialmente e modifica o método de retroinjeção². Uma primeira etapa de blotting resulta em sanduíche apertado e aderência ao filme de carbono e uma barra de grade em ambos os lados da amostra de várias camadas durante a mancha em submícron, em vez do tamanho do poro de papel de filtro de 20-25μm no método de retroinjeção. A separação, ou descamação, de uma camada individual ocorre ao forçar a separação das camadas ensanduichadas uma vez que a grade é pressionada verticalmente em uma gota de trealose, forçando o filme de carbono para longe da barra de grade (Figura 1). O reposicionamento do filme de carbono para longe do ponto de contato original com a barra de grade ocorre na próxima etapa, quando a grade é novamente manchada em papel de filtro submícron. O número de iterações dessas etapas pode ser otimizado para amostras específicas. Além disso, o protocolo pode ser usado para aumentar as concentrações da amostra, evitando a agregação em Z. Devido à dependência da aderência à barra de grade e ao filme de carbono, bem como à separação forçada, essa abordagem pode não ser adequada para moléculas altamente frágeis, como certas proteínas delicadas e / ou instáveis e complexos proteicos.

A técnica peel-blot não requer equipamentos especializados nem suprimentos caros. A aplicabilidade a amostras específicas exigirá, no entanto, considerações cuidadosas sobre os parâmetros biológicos. A decisão é mais fácil para os cristais 2D, pois o filme de carbono é necessário para garantir a planicidade, mas a manipulação através da técnica peel-blot pode afetar a integridade biológica da amostra ou a ordem cristalina. A adequação da técnica peel-blot a partículas individuais é restrita e pode ser testada para aquelas que requerem filme de carbono e são estáveis à manipulação. Espécimes com interações biológicas críticas entre camadas podem não ser adequados para caracterização com a ajuda da técnica peel-blot devido à interrupção de tais interações.

A técnica peel-blot ("peel-blot") é mais rapidamente otimizada por testes e triagem com coloração negativa ou amostras não coradas por MET à temperatura ambiente. Uma vez que o número ideal de iterações de peel-blot tenha sido identificado, o tempo para controlar a espessura antes da vitrificação pode ser determinado.

Protocolo

1. Etapas de preparação para a técnica peel-blot

NOTA: A preparação requer que os seguintes itens sejam colocados adjacentes uns aos outros.

1. Empilhe dois pedaços de papel de filtro de 20-25 μm de tamanho de poro (consulte Tabela de Materiais).
2. Coloque uma película de parafina de ~8 cm x 10 cm de comprimento adjacente ao papel de filtro com o papel voltado para cima.
3. Coloque um pedaço de papel de filtro submícron em cima de dois pedaços adicionais de papel de filtro #4 (Figura 1-1).
4. Posicione a pinça anticapilar com a perna dobrada virada para cima e a perna reta voltada para baixo. Em seguida, selecione uma grade de 600 malhas com o lado liso/brilhante para cima. Coloque a pinça em uma placa de Petri ou outra superfície elevada para evitar o contato da grade limpa com outros itens.
5. Retire o papel da película de parafina e puxe os lados (~ 5 mm) para criar uma pequena borda. Pipete duas gotas de 150 μL de solução de trealose a 4% ~1-2 cm de um lado curto do filme de parafina e ~1 cm de distância no filme de parafina.
6. Em um banco separado ou no chão, despeje nitrogênio líquido em um pequeno recipiente de espuma de poliestireno (consulte Tabela de materiais).
   CUIDADO: Receba treinamento para o manuseio adequado usando luvas e um escudo facial, a fim de evitar a picada de gelo.
7. Coloque um pequeno recipiente de grade crio-EM no nitrogênio líquido e cubra o recipiente de espuma de poliestireno com lenços sem fiapos.

2. Colocando o filme de carbono na grade

1. Use a pinça Dumont #5 (ver Tabela de Materiais) para flutuar do filme de carbono da mica tocando um lado da mica em um leve ângulo para baixo (~20°-40°) em uma das gotas de solução de trealose e lentamente deixe a tensão da água levantar o filme de carbono movendo a mica para baixo. Solte a mica uma vez que o filme de carbono flutua na superfície da gota.
2. Inspecione visualmente o filme de carbono para evitar o uso de carbono com danos na forma de fraturas.
3. Insira a grade mantida pela pinça anticapilar em um ângulo (~20°-30°) em uma gota de trealose em uma posição adjacente e, em seguida, centralizada sob o filme de carbono. Pegue o filme de carbono (Figura 1-2).
4. Mantenha a grade na mesma orientação e abaixe lentamente na superfície da segunda gota de trealose sem quebrar a tensão superficial da gota para remover o filme de carbono desnecessário que pode ter envolvido a borda da grade para o lado áspero.

3. Separação de cristais 2D de várias camadas em camadas únicas

1. Gire a pinça anticapilar (ver Tabela de Materiais) e coloque-a em uma placa de Petri com o lado de carbono da grade voltado para baixo (Figura 1-3).
2. Pipetar 1,3 μL da amostra para o menisco ligeiro de trealose no topo da grelha. Pipete a solução ~8-10 vezes para misturar e distribuir a trealose e a amostra em ambos os lados da grade.
3. Durante a incubação da solução por 1 min, pipete uma ou mais gotas de 1,7 μL de solução de trealose no filme de parafina.
4. Gire a grade de volta à sua posição original com o filme de carbono voltado para cima.
5. Use a pinça anticapilar para pressionar a grade no papel de filtro submícron (Figura 1-4). Uma vez que a solução tenha sido absorvida pelo papel de filtro e o filme de carbono esteja deitado, aguarde 3s antes de levantar a grade e movê-la verticalmente para a gota de 1,7 μL de solução de trealose (Figura 1-5).
   Observação : repita esta etapa várias vezes para amostras altamente empilhadas ou a grade é preparada para vitrificação nas próximas etapas.
6. Limpe a grade nos dois pedaços de papel de filtro e, em seguida, levante a grade do papel de filtro (Figura 1-6). Após aproximadamente 13 s, dependendo da umidade e do tampão de amostra, mergulhe a grade no nitrogênio líquido no pequeno recipiente de isopor e coloque a grade no recipiente de grade cryo-EM ou transfira-a diretamente para triagem crio-EM ou coleta de dados.
   NOTA: Para otimizar rapidamente o protocolo, manche negativamente a grade manchada por casca nesta etapa, em vez de mergulhá-la em nitrogênio líquido. Contamine negativamente a amostra aplicando 3 μL de acetato de uranila a 1% na grade, incube a grade por 30 s e a limpe com um pedaço rasgado de papel de filtro de tamanho de poro de 20-25 μm. Grades de cristais 2D vitrificados em trealose, tanino ou glicose são rotineiramente mergulhadas à mão para vitrificação, pois trealose, tanino e glicose impedem a formação de gelo cristalino a taxas usadas para mergulho manual².

Resultados

Um experimento bem-sucedido de peel-blot resultará em camadas únicas de amostras em concentrações muitas vezes altas. É de se esperar que algumas regiões na maioria dos quadrados de grade ainda contenham várias camadas, especialmente em menor número de iterações dos passos de peel-blot. A maioria dos quadrados de grade, no entanto, conterá extensas regiões de camadas únicas, como observado para cristais 2D de leucotrieno humano C₄ sintase (Figura 2) e lipossomas (adicionados na etapa 3.2

Discussão

O peel-blot é um método poderoso para superar o empilhamento e a espessura de cristais 2D de várias camadas e amostras semelhantes para coleta de dados crio-EM e processamento de imagens. Uma decisão sobre o uso do peel-blot será baseada em parâmetros biológicos da amostra e também exigirá avaliação assim que um modelo crio-EM 3D estiver disponível. A importância biológica dos contactos e a potencial flexibilidade das regiões de contacto serão particularmente importantes nesta avaliação.

O núm...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grades de 600 mesh	SPI	2060-C-XA
Pinça anticapilar	Ted Pella	510-5
Carbono para revestir mica
Cryo-EM			As grades Cryo-EM podem ser rastreadas a 120 kV ou 200 kV.  Os dados de alta resolução são coletados a 300 kV.
Pinça Dumpont #5 Ted	Pella	5622
Caixa de grade para armazenamento crio-EM	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Mica de nitrogênio
Ted	Pella	56	A mica é revestida de carbono e cortada em quadrados que são ligeiramente maiores do que uma grade TEM.  A espessura do carbono pode exigir otimização para evitar carbono fino que se quebra facilmente após várias manchas de casca.
Mancha			1-2% de acetato de uranila é adequado para muitas amostras.  Outras manchas, como o ácido fosfotúngstico, podem ser substituídas.
parafilme
			Um contêiner de transporte de poliestireno pode ser reciclado para esse fim e forrado com papel alumínio.
Papel de filtro submicrométrico	MilliporeSigma	DAWP04700
Microscópio eletrônico de transmissão	JEOL	JEM-1400	Qualquer TEM operado a uma tensão de aceleração de 80-120 kV será adequado para triagem de grades manchadas negativamente.
Trealose			Prepare a solução de trealose a 4%.
Whatman #4 papel de filtro	MilliporeSigma	WHA1004150	Isso corresponde ao 20-25 μ papel de filtro do tamanho do poro de m no protocolo.