Microtensiometer para Visualização de Microscopia Confocal de Interfaces Dinâmicas

Interfaces ar-água cobertas por filmes surfactantes são onipresentes no cotidiano. As injeções de água surfactante são usadas para melhorar a recuperação de óleo de campos empobrecidos e são usadas como soluções de fraturamento hidráulico para gás de xisto e óleo. Espumas gás-líquido e emulsões líquido-líquidos são comuns a muitos processos industriais e científicos como lubrificantes e agentes de limpeza e são comuns em alimentos. Surfactantes e proteínas nas interfaces estabilizam as conformações de anticorpos durante a embalagem, armazenamento e administração 1,2,3,4,5, estabilidade do filme lacrimal no olho ^6,7,8 e mecânica pulmonar ^{9,10,11,12,13,14}, ^{15 anos}.

O estudo de agentes superanativos ou surfactantes que adsorvam interfaces e suas propriedades tem uma longa história com muitas técnicas experimentais diferentes 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Um desenvolvimento recente é o microtensiometer de pressão capilar (CPM), que permite o exame de propriedades interfaciais em interfaces altamente curvas, em escalas de comprimento muito menores, ao mesmo tempo em que utiliza significativamente menos materiais do que outros métodos comuns 9,23,24,25. A microscopia de fluorescência confocal (CFM) pode ser usada para estudar a morfologia de lipídios e proteínas nas interfaces ar-água no CPM²² ou nos cochos langmuir 20,26,27,28,29. Aqui, um CPM e CFM foram combinados para conectar fenômenos morfológicos a propriedades interfaciais dinâmicas e de equilíbrio para desenvolver relações estrutura-função para interfaces biológicas e tecnológicas.

Existem inúmeros parâmetros de importância em sistemas de surfactante interfacial acessíveis ao CPM-CFM. No CPM, uma bolha de ar de 30-200 μm de diâmetro é fixada na ponta de um tubo capilar de vidro. Nas versões anteriores do CPM, a diferença de pressão capilar entre o interior e o exterior da bolha foi controlada através de uma coluna de água e bomba de seringa oscilatória ^9,30 ; a nova versão descrita aqui substitui-as por uma bomba microfluidica de maior precisão, controlada por computador. A tensão superficial (γ) é determinada através da equação de Laplace, ΔP = 2γ/R, a partir da queda de pressão através da interface definida pela bomba, ΔP, e análise óptica do raio de curvatura da bolha, R. A tensão dinâmica da superfície da interface pode ser determinada com resolução de tempo de 10 ms após a geração de uma nova bolha em contato com um líquido a granel contendo um surfactante solúvel. A dinâmica de adsorção surfactante pode ser descrita pela clássica equação Ward-Tordai^10,31 para determinar propriedades essenciais do surfactante, incluindo a difusividade, a cobertura da superfície e a relação entre concentração a granel e tensão superficial de equilíbrio. Uma vez alcançada uma tensão superficial de equilíbrio, a área interfacial pode ser oscilada para medir o módulo dilatational, registrando as mudanças na tensão superficial, induzidas por pequenas mudanças na área da superfície da bolha, A³². Para interfaces mais complexas que desenvolvem suas próprias estruturas internas, como polímeros emaranhados ou proteínas, a tensão superficial, é substituída por um estresse superficial mais geral ^4,33, .

A estabilidade pulmonar durante a respiração pode estar diretamente ligada à manutenção de uma tensão superficial baixa e um módulo dilatational elevado na interface alveolar ar-líquido ^9,10. Todas as superfícies pulmonares internas são forradas com uma película contínua e espessa de fluido de revestimento epitelial para manter a hidratação tecidual³⁴. Este fluido de forro epitelial é principalmente água, com sais e várias outras proteínas, enzimas, açúcares e surfactante pulmonar. Como é o caso de qualquer interface curva de vapor líquido, uma pressão capilar é induzida com a pressão maior no interior do alvéolo (ou bolha). No entanto, se a tensão da superfície era constante em todos os lugares dentro dos pulmões, a equação de Laplace, ΔP = 2γ/R, mostra que alvéolos menores teriam uma pressão interna maior em relação aos alvéolos maiores, forçando o conteúdo gasoso dos alvéolos menores a fluir para alvéolos de menor pressão. Isso é conhecido como "Instabilidade Laplace"^9,35. O resultado líquido é que os menores alvéolos entrariam em colapso e seriam preenchidos com líquido e se tornariam difíceis de reinflar causando o colapso de parte do pulmão, e outras partes inflariam demais, ambas sintomas típicos da síndrome do sofrimento respiratório agudo (ARDS). No entanto, em um pulmão em funcionamento adequado, a tensão da superfície muda dinamicamente à medida que a interface do fluido ar-epitelial na área interfacial alveolus se expande e contrai durante a respiração. Se , ou , a pressão de Laplace diminuir com o raio decrescente e aumenta com o raio crescente de modo a eliminar a instabilidade de Laplace, estabilizando assim o pulmão⁹. Assim, e como depende da frequência, da morfologia e composição da monocameira, e da composição do fluido alveolar pode ser essencial para a estabilidade pulmonar. O CPM-CFM também forneceu as primeiras demonstrações dos efeitos da curvatura interfacial na adsorção^{surfactante 25}, morfologia monocamadas²² e módulo dilatational⁹. O pequeno volume (~1 mL) do reservatório no CPM permite a rápida introdução, remoção ou troca da fase líquida e minimiza a quantidade necessária de proteínas caras ou surfactantes¹⁰.

O contraste em uma imagem CPM-CFM deve-se à distribuição de pequenas frações de lipídios ou proteínas fluorescentes na interface^16,27. Monocamadas surfactantes bidimensionais geralmente exibem separação de fase lateral em função da tensão superficial ou pressão da superfície, π é a diferença entre a tensão superficial de uma interface fluido-fluido limpo, γ₀, e uma interface coberta de surfactante, γ. π pode ser pensado como a "pressão" 2D causada pelas interações de moléculas surfactantes na interface que age para diminuir a superfície de tensão pura. Em baixas pressões superficiais, as monocamadas lipídicas estão em um estado desorganizado semelhante a líquido; isso é conhecido como a fase expandida líquida (LE). À medida que a pressão superficial aumenta e a área por molécula lipídica diminui, os lipídios se orientam entre si e podem passar por uma transição de fase de primeira ordem para a fase^condensada líquida de longo alcance (LC) fase ^16,20,27. As fases LE e LC podem coexistir em várias pressões superficiais e podem ser visualizadas à medida que lipídios marcados fluorescentes são excluídos da fase LC e segregados à fase LE. Assim, a fase LE é brilhante e a fase LC é escura quando imagens com CFM¹⁶.

O objetivo deste manuscrito é descrever os passos necessários para construir e operar o microtensiometer de microscópio confocal combinado. Isso permitirá ao leitor realizar estudos de adsorção, medir a tensão superficial, o comportamento reológico e examinar a morfologia interfacial simultaneamente em uma interface de ar/água/água em escala de míccro ou óleo/água. Isso inclui uma discussão sobre como puxar, cortar e hidrofobizar os capilares necessários, instruções para o uso de modos de controle de pressão, curvatura e área de superfície, e transferência interfacial de surfactante insolúvel para a interface curva do microtensiometer.

1. Preparação de tubos capilares

1. Coloque o capilar em um puxador capilar e execute o programa de puxar desejado para fazer dois capilares afilados com um diâmetro externo (OD) de ~1 μm na ponta.
   NOTA: O OD do capilar antes de puxar deve ser o OD especificado para caber no suporte capilar na célula microtensiômetro. O diâmetro interno (ID) do capilar pode variar, mas afetará o raio crítico do capilar após a puxar. Um programa de puxar é escolhido para que o taper resultante inicialmente reduza o OD capilar e o ID rapidamente, em seguida, atinge um raio perto do desejado capilar OD e ID, e, em seguida, reduz o diâmetro mais lentamente. Isso criará um comprimento capilar maior que pode ser pontuado para produzir um capilar utilizável de 30-100 μm em ID.
2. Marque a ponta do capilar no local desejado para obter um ID de 30-100 μm e quebrar a ponta. O capilar agora terá um OD e Y do raio desejado na ponta (Figura 1A). Os capilares podem ser armazenados até o passo 2.
   NOTA: A borda cortada do capilar deve ser uma ruptura limpa de 90°. Qualquer defeito na borda de corte levará a uma má fixação da bolha nas medidas capilares e ruins da propriedade superficial. Pontas capilares cilarias são muito delicadas. Eles serão destruídos se entrarem em contato com qualquer outra coisa que não as soluções (por exemplo, paredes de frasco, bico de ar).

2. Hidrofobização de capilares

1. Reúna capilares de vidro puxados, solução de limpeza de ácido, pinça plástica, água desionizada (DI), solução de hidrofobização (2% de silano no etanol), bomba de vácuo e solução de etanol. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes.
   ATENÇÃO: A solução de limpeza de ácido é acutly tóxica, causa corrosão/irritação da pele e dos olhos, é oxidante. A solução de hidrofobização é um irritante de pele/olho/respiratório. Use proteção ocular, jalecos e luvas e trabalhe com soluções em um capô de fumaça.
2. Limpe o capilar
   NOTA: A limpeza ácida do capilar remove quaisquer resíduos orgânicos dentro do capilar e prepara a superfície de vidro para a reação de silanização que torna o hidrofóbico capilar.
   1. Pegue um capilar firmemente perto de sua extremidade larga com a pinça.
   2. Mergulhe a ponta afilada na solução de limpeza de ácido enquanto prende a mangueira da bomba de vácuo à extremidade larga do capilar. Isso vai sugar a solução para o capilar.
      NOTA: Uma ponta de pipeta pode ser anexada à extremidade da mangueira capilar para permitir um melhor ajuste com a extremidade capilar.
   3. Pare quando a solução de limpeza de ácido tiver preenchido cerca de metade do capilar.
      NOTA: Após a remoção da ponta capilar da solução de limpeza ácida, a solução no exterior do capilar muitas vezes forma uma pérola perto da ponta capilar. Toque suavemente o capilar no pescoço do frasco de solução para remover o excesso de solução.
   4. Permita que a solução de limpeza de ácido permaneça nos capilares por pelo menos 30 minutos, garantindo que o plugue do líquido permaneça na extremidade afilada do capilar.
   5. Remova a solução de limpeza de ácido do capilar, segurando firmemente o capilar com a pinça e usando a mangueira de vácuo para retirar o líquido da extremidade grande do capilar.
3. Enxágüe o capilar
   1. Submergir a extremidade cila círada do capilar em água DI garantindo que ela esteja submersa o suficiente para cobrir qualquer exterior que tenha sido submerso na solução de limpeza de ácido. Enquanto a ponta estiver submersa, use a mangueira de vácuo para puxar a água DI através do capilar. Retire o capilar da água e remova a água restante com a mangueira de vácuo.
   2. Repita o passo acima pelo menos 4x.
4. Realizar a etapa 2.3 novamente substituindo o etanol por água DI.
5. Aplique a sucção continuamente até que o etanol evapore completamente do interior do capilar. O capilar ficará nublado e frio ao tocar à medida que o etanol começa a evaporar, mas vai limpar depois dos 30 a 45 s.
6. Cubra o capilar com a solução de hidrofobização
   1. Mergulhe brevemente a extremidade larga do capilar no silano de ~2% na solução de etanol. A ação capilar fará com que a solução de revestimento suba dentro do capilar. Remova o capilar da solução uma vez que um plugue de tamanho de ~1 cm tenha aumentado dentro do capilar.
   2. Oriente o capilar para que a ponta afilada fique voltada para baixo, permitindo que a solução de revestimento caia com gravidade em direção à ponta afilada.
   3. Deixe que a solução de revestimento permaneça no capilar por pelo menos 3 minutos.
      NOTA: Não deve haver bolhas de ar no plugue da solução de revestimento que esteja em contato com o interior da ponta afilada. Se houver uma bolha de ar, então o interior capilar provavelmente não secou suficientemente na etapa 2.5. Para remediar isso, repita as etapas 2.4-2.6 conforme necessário.
7. Enxágüe os capilares com etanol 1x da mesma forma que o passo 2.3.
8. Coloque o revestimento hidrofóbico no capilar
   1. Coloque frascos de cintilação limpos e secos em um forno a vácuo definido para 120 °C. Coloque capilares revestidos nos frascos (idealmente um capil por frasco) com extremidades largas apoiadas na base do frasco. Permita que os capilares permaneçam no forno por pelo menos 6h (pernoite preferido) para alcançar a ligação permanente da camada de silano hidrofóbico com os capilares. Os capilares podem ser armazenados até o passo 4.

3. Preparação e armazenamento de amostras

1. Misture e armazene soluções de surfactante e fluorforeiro em frascos limpos lavados com ácido para evitar contaminação.
   NOTA: Os lipídios disponíveis comercialmente devem ser da maior pureza e armazenados entre o uso a - 20 °C. Lipídios velhos ou contaminados muitas vezes causam dificuldades de reprodução de resultados.

4. Configuração do microtensiômetro

1. Monte a célula CPM conforme descrito na Figura 2.
   1. Coloque o lado grande do capilar na parte superior da célula CPM até que ele empurre para a parte inferior da célula.
   2. Aperte suavemente o plugue PEEK para fixar o capilar e, em seguida, conecte o tubo da bomba microfluidica ao lado grande do capilar. Tenha cuidado para não tocar na ponta capilar afilada.
2. Conforme necessário, conecte as mangueiras de troca e/ou controle de temperatura das respectivas entradas e saídas na célula CPM (Figura 2); caso contrário, conecte as entradas e tomadas nãousadas.
3. Conecte a célula CPM ao estágio do microscópio confocal, alinhando-a aproximadamente com o objetivo cfm, câmera CPM e fonte de luz CPM (Figura 3).
4. Abra o fluxo de gás para a bomba microfluida na pressão de operação recomendada da bomba (150 mbar para a bomba microfluida usada aqui) e garanta que o fluxo para o capilar esteja aberto.
5. Comece a executar a interface virtual CPM (Arquivo de Codificação Suplementar 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) no modo controle de pressão com a frequência de oscilação de pressão capilar e amplitude definida para zero (Figura 4-7). A Figura 4 mostra uma captura de tela da interface virtual. Para água DI e um raio capilar de ~35 μm, uma pressão de ~20 mbar garante que nenhuma água entre no capilar.
6. Encha a célula CPM com água usando uma pipeta.
7. Concentre-se na ponta capilar usando a câmera microtensiometer.
8. Concentre-se na ponta capilar com o CFM. Se houver dificuldade em encontrar o capilar, use a câmera CPM para encontrar o objetivo do CFM. Isso ajudará a aproximar a distância entre o objetivo do CFM e a bolha, alcançando a distância de trabalho correta.
9. Depois que o anulus (projeção do setor verde) estiver centrado na bolha, ajuste manualmente o foco para que a borda da bolha possa ser vista claramente (Figura 4-3).
   NOTA: A posição, o ângulo de partida e a extremidade e os raios internos e externos do anulo podem ser ajustados através do menu abaixo da janela de exibição.
10. Clique em Reset Bubble e certifique-se de que uma nova bolha seja formada (será possível ouvir o velho estouro de bolha, e a nova bolha será observável da janela de visualização do painel de controle; Figura 4-3). Se a bolha não estourar, aumente a pressão de reset ou aumente o tempo de atraso de reset na guia Redefinir bolhas abaixo da janela de visualização. Verifique se a tensão superficial está em torno de 73 mN/m (para bolhas salinas ou de água/ar) (Figura 4-9).
11. Tire a água através da seringa direta à célula (Figura 3-13), esvazie-a e recoloque-a. A amostra está pronta para carregar para executar o experimento.

5. Estudo de adsorção

1. Encha a célula com a amostra desejada usando uma pipeta autoclaved mantendo o software CPM no modo controle de pressão . Certifique-se de que a tensão inicial da superfície está em torno de 73 mN/m quando uma nova interface de bolha é criada.
2. Determine o raio da bolha recém-formada e a entrada que valorizem o controle da área central (Figura 4-7) e altere o tipo de controle para o controle da área clicando na guia Controle de área (Figura 4-8).
   NOTA: O controle constante de pressão também pode ser usado, mas isso faz com que o raio da bolha mude continuamente à medida que a tensão superficial da interface muda. Essa mudança de área pode complicar a análise das taxas de adsorção de surfactantes e fazer com que a bolha estoure durante o estudo.
3. Comece a gravar o vídeo confocal.
4. Clique em Reset Bubble (Figura 4-5) e clique imediatamente em Coletar Dados (Figura 4-6). A luz de sinalização no botão ficará verde.
5. Ajuste a taxa de registro de dados de acordo com a concentração da amostra deslizando a barra mostrada na Figura 4-6. Para adsorções mais lentas, use uma taxa de gravação mais lenta. Isso pode ser ajustado no meio de uma corrida se uma taxa de gravação mais alta for desejada no início, mas uma taxa mais lenta é preferível para estudos longos, a fim de reduzir o tamanho do arquivo.
6. Após o término do experimento (quando um platô de tensão de superfície final foi atingido), salve o arquivo escolhendo o caminho correto do arquivo (Figura 4-1) e clicando no botão Salvar (Figura 4-2).
7. Pare e salve a gravação no CFM também.

6. Estudo de oscilação/relaxamento

1. Encha a célula com a amostra usando uma pipeta autoclaved mantendo o software CPM no modo controle de pressão . Certifique-se de que a tensão da superfície está em torno de 73 mN/m quando uma nova interface de bolha é criada.
2. Aguarde até que a amostra seja totalmente adsorvida à interface. Isso pode ser realizado diretamente após um estudo de adsorção em vez de começar de novo com uma nova interface de bolha.
3. Decida se a oscilação será uma oscilação de pressão, oscilação de área ou oscilação de curvatura selecionando a guia apropriada (Figura 4-8) e digitando o valor de linha de base desejada, oscilação% e frequência de oscilação (Figura 4-7).
   NOTA: As oscilações da área de onda detomó, quadrada e triangular também estão acessíveis a partir do menu suspenso na guia Oscilação de Outras Áreas .
4. Inicie a gravação do vídeo confocal e clique em Coletar dados (Figura 4-6) no software CPM.
5. Comece a oscilação. Certifique-se de registrar pelo menos sete ciclos para melhores resultados. Escolha uma taxa de aquisição de dados (Figura 4-6) para dar um número adequado de pontos de dados para cada ciclo de oscilação.
6. Se forem desejadas outras amplitudes de oscilação ou frequências, altere os valores durante o experimento.
7. Guarde os resultados como nas etapas 5.6 e 5.7.

7. Estudo de troca de solventes

1. Encha a célula com a amostra usando uma pipeta autoclaved mantendo o software CPM no modo de controle de pressão. Certifique-se de que a tensão da superfície está em torno de 73 mN/m, quando uma nova interface de bolha é criada.
   NOTA: Estudos de adsorção e/ou oscilação podem ser realizados antes do estudo de troca de solventes.
2. Conecte o tubo de entrada com a garrafa da solução de troca desejada (Figura 3-11) à bomba peristáltica (Figura 3-10).
3. Inicie a gravação do vídeo no software confocal e clique em Coletar dados (Figura 4-6) no software CPM.
4. Defina a velocidade da bomba peristáltica. Isso controlará a taxa de troca de fluidos e deve ser escolhido com base nos requisitos para o experimento, ou seja, quão rápido o solvente precisa ser trocado.
5. Se vários fluidos precisarem ser trocados, pare a bomba peristáltica e conecte a entrada a outra solução de troca.
6. Após o término da troca (~20 min), guarde os resultados como na etapa 5.6 e 5.7.

8. Adsorção de surfactante insolúvel

NOTA: Se o surfactante a ser adsorvido não for solúvel no líquido do reservatório, este método pode ser usado para transferir uma monocamada da interface ar/água da célula para a superfície da bolha. Muitas bicamadas que formam lipídios são quase insolúveis em solução salina e não absorvem espontaneamente a bolha quando suspensas na solução do reservatório.

1. Encha a célula com a amostra usando uma pipeta autoclaved mantendo o software CPM no modo controle de pressão . Certifique-se de que a tensão da superfície está em torno de 73 mN/m, quando uma nova interface de bolha é criada.
2. Deposite uma monocamada de surfactante insolúvel na interface ar-água da célula a partir de uma solução em uma solução orgânica volátil. Usando uma seringa, deposite pequenas gotículas na interface e permita que o solvente evapore deixando o lipídio para trás como um filme fino.
   ATENÇÃO: O clorofórmio é usado como solvente para fosfolipídios como fosfattidylcholinas e ácidos graxos. As soluções de disseminação são geralmente 0,01-0,02 mg de lipídio por mL do solvente. O clorofórmio é agudamente tóxico, pode causar irritação na pele e nos olhos, e é cancerígeno. Use proteção ocular adequada, jaleco e luvas e faça a solução em um capô de fumaça.
3. Diminua a área da superfície através do controle de pressão da linha central (Figura 4-7) da bolha até que ela esteja quase plana. Isso evita que a bolha apareça depois que o surfactante tenha adsorte.
4. Remova o líquido do reservatório da célula através da seringa direta à célula até que a interface ar/água passe pela ponta do capilar. Enquanto uma bomba de seringa pode ser usada, esta etapa pode ser alcançada usando manualmente a seringa.
5. Aumente a altura líquida do reservatório para o nível inicial.
   NOTA: Depois que a ponta for resubssumida, a bolha será maior devido ao surfactante que agora é adsorvida na interface. A monocamadas estará agora pronta para experimentos de oscilação ou troca de solventes.

9. Limpar

1. Desligue o CFM.
2. Mude para o modo controle de pressão .
3. Remova a amostra da célula usando uma pipeta. Carregue a célula com água DI e apareçam a pressão para ~50 mbar para fazer com que as bolhas escapem constantemente da capilaridade e limpem a ponta capilar. Repita este processo em 2x.
4. Feche a válvula de segurança e desligue o CPM clicando no botão vermelho no canto superior esquerdo, desligue a luz e o painel de controle de pressão azul e feche a fonte de pressão.
5. Remova a célula do estágio do microscópio confocal. Enxágüe a célula com etanol e água DI. Remova o tubo capilar da célula CPM.

10. Limpeza da célula

1. Desmonte a cela. Escove a parede interna com uma escova de dentes enquanto enxagua em água DI. Submergir as peças no etanol e sonicá-la por ~30 min.
2. Enxágüe todas as peças com água DI algumas vezes. Seque as peças soprando-as com gás nitrogênio ou secando-as dentro de um forno a vácuo.

11. Análise de oscilação

1. Execute o código Dilatational_Rheology_Analysis.m (Arquivo de Codificação Suplementar 2), escolhendo o arquivo desejado salvo da interface virtual CPM. Os dados da amostra estão incluídos nos arquivos suplementares.
2. O gráfico de pressão versus tempo aparecerá como mostrado na Figura Suplementar 1. Clique à esquerda no ponto onde a oscilação começa e clique à esquerda novamente onde a oscilação termina. Se os dados contiverem múltiplas oscilações, repita este processo para todas as oscilações.
   1. Quando todos os pontos de partida e final tiverem sido clicados à esquerda, clique à direita no mouse em qualquer lugar. Por exemplo, como mostrado na Figura Suplementar 1, pode-se deixar o clique nos pontos 1, 2, 3 e 4, seguido por um clique à direita.
      NOTA: O código calculará o módulo dilatational e o ângulo de fase e os resultados serão escritos em um novo arquivo .csv no local do arquivo original. Os resultados dos dados da amostra podem ser vistos nos resultados do código fornecidos no Arquivo de Codificação Suplementar 2. O MATLAB também gerará várias representações gráficas dos dados, conforme mostrado na Figura Suplementar 2.

Uma das principais fontes de erro de medição surge dos capilares que possuem defeitos, seja do processo de corte (Figura 5A,B) ou do processo de revestimento (Figura 5D). Ambos os tipos de defeitos levam a erros na determinação da forma e tamanho da bolha pelo sistema óptico de análise de imagens, levando a valores imprecisos de tensão superficial. É importante examinar cuidadosamente cada novo capilar depois de ser puxado e revestido sob o microscópio óptico antes de inserir o capilar no CPM. Um capilar de corte errado deve ser descartado, mas um capilar mal revestido pode ser limpo a ácido e revestido para melhorar a bolha fixando no final do capilar (passo 2 do Protocolo). Os capilares funcionam melhor se o corte final for perfeitamente perpendicular ao capilar (Figura 5C) e os pinos de bolha diretamente no final do capilar (Figura 5E). O revestimento hidrofóbico no capilar se tornará menos eficaz na fixação com uso, exigindo que o capilar seja re clean e revestido.

Os dados representativos para adsorção de surfactante versus tempo são apresentados na Figura 6. Técnicas experimentais anteriores, como um pingente ou gotas de sessile usadas para medir a adsorção de surfactantes, não tinham um mecanismo para ajustar dinamicamente a pressão capilar, pois a mudança na tensão superficial faz com que a área da bolha mude durante a adsorção 30,36,37. De fato, para bolhas e gotas maiores, mudanças na forma de bolha ou queda (e, portanto, área da superfície) são necessárias para determinar a tensão superficial a partir da análise da forma da interface, uma vez que a pressão capilar não é medida independentemente e a pressão capilar varia sobre a superfície de gota ou bolha37. Isso também complica a análise da adsorção, pois como adsorbs surfactantes para a interface, a tensão superficial diminui, e para satisfazer a equação de Laplace a área de superfície da bolha deve aumentar, exigindo surfactante adicional para adsorb para alcançar o equilíbrio. No CPM, uma pressão capilar fixa requer que o raio inicial da bolha deve estar dentro de uma pequena faixa antes da adsorção surfactante para evitar que a bolha ejete do capilar se a tensão da superfície diminuir demais. A dinâmica de adsorção surfactante é frequentemente modelada pela clássica equação Ward-Tordai31, que descreve a adsorção de moléculas surfactantes para uma interface limpa de área interfacial constante. Embora a equação Ward-Tordai possa ser modificada para explicar a mudança da área da superfície, isso introduz parâmetros adicionais e complica muito a análise38,39.

Para superar essas questões, um loop de feedback baseado em modelo foi desenvolvido usando a equação de Laplace que mantém a curvatura (e a área da superfície) da bolha constante durante todo o processo de adsorção, ajustando dinamicamente a pressão capilar. Há diferenças significativas na taxa de mudança da tensão superficial porque a área da bolha não está aumentando constantemente. As mudanças na área da bolha durante a adsorção não são constantes com o tempo, pois a tensão da superfície muda lentamente no início, e depois acelera rapidamente antes do equilíbrio. Uma complicação adicional é que a mudança fracionária na área depende do raio inicial da bolha. Um benefício adicional do raio de bolha constante é que a imagem da interface é simplificada à medida que a superfície da bolha permanece fixa, o que simplifica o foco do CFM. Durante o processo de adsorção, como adsorbs surfactantes para a interface (Vídeo 1), o sinal fluorescente da interface aumenta. Se o surfactante formar domínios de superfície, esses domínios podem ser observados formando e crescendo22.

As alterações na tensão superficial durante as oscilações da área são mostradas na Figura 7. Nas versões anteriores do CPM, oscilações foram feitas na pressão capilar da bolha; no entanto, gerar uma onda senoidal na pressão capilar não se traduz diretamente em uma onda seno na superfície, pois os dois estão relacionados através da equação de Laplace. Ao aproveitar um loop de feedback baseado em modelos usando a equação de Laplace, as oscilações são criadas na área e não na pressão capilar, levando a dados mais fáceis de analisar e coletar sobre uma gama maior de amplitudes. Como resultado, os dados de tensão superficial versus área coletados a partir deste método podem ser usados para calcular diretamente o módulo dilatational interfacial da camada surfactante: (Figura 8), onde está o estresse total do sistema e oestressenãoisotrópico é o estresse desviatório não isotrópico muitas vezes ausente em soluções simples de surfactante 4,33. Assim, para um simples sistema de surfactante, . Para interfaces onde redes elásticas podem ser formadas, como proteínas superativas, tensões extras estão frequentemente presentes e, portanto, devem ser contabilizadas na definição do módulo dilatacional. O vídeo 2 mostra um vídeo CFM do movimento de domínios LC pretos em uma matriz de fase LE colorida contínua em monocamadas fosfolipídidas. Os distintos domínios de LC na interface se reorganizam em uma rede de ramificação que cobre a interface quando as oscilações ocorrem na bolha curva22,40. A guia Oscilações de Outras Áreas pode ser usada para criar ondas de dente de serra, quadradas e triangulares, como visto na Figura Suplementar 3 e a guia Compressão permite a compressão e expansão constantes da área de taxa.

Para estudos de troca de solventes, um surfactante é primeiro autorizado a adsorb para a interface, e então o líquido do reservatório é trocado para permitir que uma segunda espécie ativa da superfície entre em contato com essa interface. É possível examinar a mudança na tensão superficial à medida que o segundo surfactante compete com o surfactante original na interface. O módulo dilatational da superfície é frequentemente uma sonda mais sensível da troca de surfactantes, juntamente com a morfologia da superfície via CFM. A Figura 9 mostra a mudança na tensão superficial, módulo dilatational da superfície e morfologia superficial como uma dessas trocas de solventes ocorre. Embora as especificidades de tal troca possam variar, uma alteração em qualquer uma das três propriedades pode indicar a integração do segundo componente na monocamadas ou solvação do componente principal no volume. Uma segunda tag fluorescente poderia ser anexada à espécie secundária para observar sua interação com a interface das imagens CFM.

Figura 1: Tratamento capilar. (A) Imagem mostrando a pontuação do capilar. A cerâmica de pontuação de vidro é mantida em um grampo para mantê-la estável. (B) Limpeza ácida do capilar. A solução de limpeza ácida é puxada para dentro do capilar com a bomba de vácuo. (C) Hidrofobização do capilar. Plugue de solução Silane mantido dentro do capilar Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Construção celular. (1) Grande suporte de célula de alumínio, (2) junta de fluoroeelômero (quatro no total), (3) lâmina de vidro (duas no total), (4) célula PEEK e (5) pequeno suporte de célula de alumínio. Quando montada, uma junta fluoroestomer é colocada em ambos os lados de cada lâmina de vidro. A célula é mantida junto com parafusos e parafusos. A imagem ampliada da célula PEEK mostra os locais das várias portas: (6) porta capilar, (7) entrada de troca de solventes, (8) saída de troca de solventes e (9,10) entrada e saída de controle de temperatura. Um plug peek pode ser usado para anexar o tubo ou capilar à célula. As portas que não estão sendo utilizadas podem ser completamente fechadas por plugues sem canais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Esquema de CPM/CFM, para não escalar. (1) a célula CPM, (2) o tubo capilar com uma bolha na ponta, (3) objetivo do microscópio confocal, (4) objetivo da câmera do microscópio com filtro, (5) fonte de luz CPM, (6) bomba microfluidica, (7) válvula de segurança, (8) entrada de troca de fluidos, (9) saída de troca de fluidos, (10) bomba peristáltica, (11) reservatório de fluido de troca, (12) resíduos de troca de fluidos, (13) direto para a ingestão de células, (14) entrada e saída da jaqueta de controle de temperatura e (15) reservatório e bomba controlados pela temperatura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Interface virtual CPM. (1) o caminho do arquivo onde os dados serão salvos; (2) parâmetros do sistema, comentários e o botão Salvar. Todos os campos nesta área são salvos no arquivo de dados final; (3) a imagem da câmera CPM; (4) configurações que controlam a análise da imagem, medição de anular, redefinição de bolhas e quadros por segundo; (5) o botão Redefinição de bolha; (6) o botão Coletar dados, o controle da taxa de registro de dados e os indicadores de coleta de dados; (7) controles para todos os valores da linha central do modo operacional, amplitude de oscilação e frequência de oscilação; (8) interruptor de modo de funcionamento: clicar em cada guia muda para esse modo de controle. Cada modo mostra o sinal de pressão sendo enviado para a bomba no gráfico "Sinal de Pressão", bem como alguns controles adicionais; (9) dados de tensão da superfície ao vivo; (10) dados de pressão ao vivo; (11) raio ao vivo dos dados de curvatura; (12) dados da área de superfície viva; e (13) tensão da superfície viva e dados da área da superfície, que podem ser usados para determinar aproximadamente o ângulo de fase durante um estudo de oscilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Defeitos Capilares. (A) e (B) Capilares miscut; (C) corte corretamente capilar, (D) capilar com fixação ruim devido ao revestimento ruim ou degradado, e (E) corretamente fixado capilar. As setas vermelhas em D e E indicam onde as bolhas estão presas. Para os melhores resultados, a bolha vai fixar na ponta capilar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Estudo de adsorção resultados microtensiometer para adsorção de pressão constante (laranja) e área constante (azul). A área de superfície da bolha para a proliferação constante da área aumenta significativamente ao longo do estudo e faz com que a adsorção deva mais tempo para atingir a mesma tensão superficial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Oscilação típica da área de superfície. (A) Pressão, (B) curvatura e (C) dados da superfície. Os dados da área de superfície são um sinusoide enquanto os dados de pressão e curvatura não são, como evidenciado pelos valores da linha central não estar no ponto médio da oscilação. A relação matemática entre os três valores significa que apenas um pode ser um verdadeiro sinusoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Resultados reológicos da amostra após análise. Módulo dilatational de Lyso PC (1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfocholina) em função da frequência para o aumento das concentrações de Lyso PC para bolhas de raio de ~45 μm. Concentrações >0,1 mM de Lyso PC que acompanham inflamação diminuem o módulo dilatational sobre a faixa de ventilação/taxas de respiração normais (amarelo) para fazer 2ε-γ < 0, que é o valor do crossover para induzir a instabilidade de Laplace (linha vermelha pontilhada). Baixas concentrações de Lyso PC ≤0,01 mM, que podem ocorrer em pulmões normais não induzem instabilidade. Em frequências >10 rad/seg, todas as concentrações do Lyso PC estão acima do crossover, e não seriam suscetíveis à instabilidade de Laplace. Linhas vermelhas sólidas são ajustes de teoria para os dados. Figura reproduzida a partir da referência9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Os resultados de CFM e CPM para um estudo de troca de solventes para surfactante pulmonar trocado com água DI e, em seguida, Lyso PC. (A) mostra como a tensão superficial e o módulo dilatational da superfície mudam ao longo do estudo. O gráfico é separado em quatro regiões: quando o surfactante pulmonar é adsorvido à interface (azul), quando o LS é trocado com água DI (verde), quando a solução de troca é mudada para uma solução de PC Lyso (vermelho), e quando a célula é preenchida com a solução Lyso PC (laranja). As propriedades podem ser vistas para mudar ao longo das várias trocas indicando que a interface está mudando. (B) mostra uma imagem confocal do adsorte de surfactante pulmonar atribuído à interface antes da troca e (C) mostra a mesma superfície após a troca com a solução lyso PC estiver completa. Em ambos os casos, o círculo branco traço indica a borda interna do capilar. A estrutura dos domínios na monocamadas muda drasticamente após a troca de solventes, corroborando os resultados do CPM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vídeo confocal de estudo de adsorção de pressão constante para surfactante pulmonar. A cor falsa mostra a distância na direção z com a barra de cor no lado esquerdo do vídeo, com roxo indicando a bolha perto do capilar e verde sendo o topo da bolha. A interface é inicialmente pouco iluminada como apenas um pouco do surfactante fluorescente é adsorvida. À medida que cada vez mais adsorbs surfactantes, a bolha começa a crescer à medida que a cor muda mais para verde e a interface se torna povoada por domínios LC pretos que podem se mover através da interface. Agregados de surfactante na solução podem ser vistos flutuando na solução como formas amorfas brilhantes e vários se acomodam na interface da bolha, desintegrando e depositando seu surfactante na interface. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Vídeo confocal de estudo de oscilação para surfactante pulmonar. A cor falsa mostra a distância na direção z com a barra de cor no lado esquerdo do vídeo. A superfície é submetida a várias frequências de oscilação diferentes e os domínios escuros de LC na interface podem ser vistos para mudar ao longo das oscilações. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figura suplementar 1: Exemplo de uma etapa intermediária no código para determinar a reologia dilatational. Quando esta tela aparecer, o usuário deve clicar à esquerda na borda mais à esquerda da oscilação para analisar e, em seguida, clique à esquerda na borda mais à direita. Várias oscilações podem ser analisadas para que o usuário possa clicar à esquerda em 1, 2, 3 e 4 e, em seguida, clicar com o botão direito do mouse para analisar essas duas oscilações. As oscilações mostradas são de diferentes amplitudes e frequências. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Exemplo dos resultados gráficos produzidos pelo código de reologia dilatational. Isso mostra os ataques dos sinusoides às oscilações na pressão, raio, área da superfície e tensão superficial, bem como a transformação de Fourier de cada oscilação. Idealmente, a segunda harmônica na transformação Fourier deve ser inferior a 10% da primeira harmônica para a área de superfície e tensão superficial. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: Modos de operação alternados. (A) Onda de sine, (B) onda de dente-de-serra, (C) onda quadrada, (D) onda triangular, (E) Expansão constante da taxa e (F) compressão constante da taxa. Os modos de compressão e expansivo permitem que isotherms do tipo Langmuir sejam criados para surfactantes insolúveis. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: microtensiometer Virtual Interface.vi. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: Dilatational_Rheology_Analysis.m. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.