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Dissecção da Mão de Caenorhabditis elegans Intestinos

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DOI:

10.3791/64120

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13 de setembro de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Colorado State University

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve um procedimento para isolar intestinos de vermes nematoides adultos Caenorhabditis elegans manualmente para entrada em genômica, proteômica, microbioma ou outros ensaios.

Resumo

Composto por apenas 20 células, o intestino de Caenorhabditis elegans é o nexo de muitas funções de suporte à vida, incluindo digestão, metabolismo, envelhecimento, imunidade e resposta ambiental. Interações críticas entre o hospedeiro de C. elegans e seu ambiente convergem dentro do intestino, onde a microbiota intestinal se concentra. Portanto, a capacidade de isolar o tecido intestinal longe do resto do verme é necessária para avaliar processos específicos do intestino. Este protocolo descreve um método para dissecar manualmente os intestinos adultos de C. elegans. O procedimento pode ser realizado em cepas marcadas fluorescentemente para fins de facilidade ou treinamento. Uma vez que a técnica é aperfeiçoada, os intestinos podem ser coletados de vermes não rotulados de qualquer genótipo. Essa abordagem de microdissecção permite a captura simultânea do tecido intestinal do hospedeiro e da microbiota intestinal, um benefício para muitos estudos de microbioma. Como tal, as aplicações a jusante para as preparações intestinais geradas por este protocolo podem incluir, mas não estão limitadas ao isolamento de RNA das células intestinais e ao isolamento de DNA da microbiota capturada. No geral, a dissecção manual dos intestinos de C. elegans oferece um método simples e robusto para investigar aspectos críticos da biologia intestinal.

Introdução

O verme nematoide Caenorhabditis elegans, com apenas 959 células e um ciclo de vida de ovo a ovo de 4 dias, é um sistema modelo ideal para muitos estudos genéticos, genômicos e de desenvolvimento 1,2. A facilidade de triagem genética direta e reversa, a prevalência de marcadores fluorescentes modificados, a capacidade de realizar a edição do genoma específico de nucleotídeos e os numerosos recursos de toda a comunidade contribuíram para grandes descobertas e insights no sistema de C. elegans. No entanto, uma desvantagem significativa é a dificuldade de obter populações puras de células, tecidos ou órgãos, que são pequenos, frágeis e podem ser interconectados. Como populações puras de células são importantes para ensaios genômicos como RNA-seq, ChIP-seq e ATAC-seq, várias abordagens surgiram para obter preparações puras de células, tecidos e órgãos de C. elegans. Aqui, um método para dissecar manualmente os intestinos, em grandes seções, fora dos vermes adultos de C. elegans é descrito. As preparações resultantes são adequadas para ensaios genômicos a jusante (Figura 1).

O método de dissecção tecidual em escala fina descrito aqui (Figura 2) é apenas uma abordagem. Outras técnicas alternativas - como marcação molecular, desagregação de vermes e purificação de tipos celulares de interesse com classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e análise post hoc - também foram usadas com sucesso para pesquisar as características específicas do tecido da biologia molecular de C. elegans. Uma vantagem da dissecção da mão sobre essas outras abordagens, no entanto, é que ela pode ser usada para explorar simultaneamente as características do intestino de C. elegans e seu conteúdo bacteriano 3,4,5. Isso permite o sequenciamento do gene 16S rRNA e facilita os estudos do microbioma dentro do sistema C. elegans. Uma limitação importante, no entanto, é que as células intestinais não são isoladas individualmente.

A marcação molecular confere uma etiqueta específica do tipo de célula às moléculas apenas dentro do tecido ou células de interesse especificados. Essas etiquetas podem então ser isoladas de preparações totais de vermes. Dessa forma, promotores específicos de tecidos que conduzem uma proteína de ligação poliA marcada ou líder emendada permitiram o perfil de transcriptoma específico de tecido 6,7,8,9,10 e mapeamento 3'UTR 11,12. Da mesma forma, perfis de fatores de transcrição específicos de tecidos têm sido conduzidos usando ChIP-seq e DamID, nos quais variantes de fator de transcrição específico do promotor foram anexadas com tags ou fusões enzimáticas13,14.

O FACS permite isolar tipos de células de interesse de vermes dissociados com base em suas características celulares intrínsecas e propriedades fluorescentes. Essa abordagem gerou transcriptomas teciduais específicos de diversos órgãos 8,15,16 e tipos de células neuronais individuais 8,9,15,16,17,18 e tem sido utilizada para criar um mapa de expressão de todo o sistema nervoso de C. elegans 19,20 . O CASC, e sua prima fluorescência ativada por nuclei sorting (FANS), também têm sido utilizados para gerar perfis de cromatina específicos de células21,22.

Finalmente, a análise post-hoc pode ser realizada em ensaios de resolução de célula única. Neste método, todas as células individuais são pesquisadas, o tipo de célula de cada uma é atribuído na fase de análise e os tipos de células de interesse são filtrados seletivamente para um estudo mais aprofundado. A análise post-hoc tem sido utilizada com sucesso para obter transcriptomas de células em desenvolvimento com alta resolução espacial e temporal em embriões de C. elegans 23,24,25,26,27 e vermes de estágio L1 28. A acessibilidade à cromatina também tem sido caracterizada usando ATAC-seq em vez de RNA-seq usando uma estratégia semelhante29.

Cada abordagem tem suas vantagens e limitações. Para o intestino de C. elegans, a desagregação de vermes e o isolamento de células intestinais por FACS são alcançáveis nos estágios embrionário e larval30, mas é um desafio em adultos. Acredita-se que isso se deva às células grandes, endo-reduplicadas e fortemente aderentes do intestino, tornando-as difíceis de dissociar sem danos. O método de dissecção da mão descrito aqui contorna esses desafios, permitindo o isolamento de grandes seções do intestino do verme adulto. A prática de dissecar gônadas à mão a partir deste mesmo estágio é generalizada e direta. A dissecção intestinal é semelhante à dissecção de gônadas, mas menos comumente realizada32. O protocolo apresentado aqui é adaptado de um protocolo mais longo e inédito desenvolvido pelo Dr. James McGhee e Barb Goszczynski. Esse protocolo simplificado empresta técnicas para isolar blastômeros de embriões em estágio inicial 23,33,34,35. Embora a dissecção das mãos não seja viável para isolar a maioria dos tipos de células ou tecidos em C. elegans, é ideal para isolar intestinos de vermes adultos. Portanto, a dissecção das mãos complementa outros meios para a obtenção de preparações celulares específicas do intestino.

Protocolo

Os vermes CL2122 foram utilizados para o presente estudo. Os vermes foram obtidos através do Caenorhabditis Genetics Center (CGC, ver Tabela de Materiais), financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Crescimento de vermes para dissecção

  1. Cultivar uma grande placa de vermes CL2122 de estágio misto para sincronização seguindo procedimentos de cultura padrão (ou seja, placas de NGM semeadas com E. coli OP50)36,37.
    NOTA: Geralmente leva ~ 96 h para atingir a capacidade máxima de postura de ovos.
    1. Embrião preparar os vermes dentro do período de 72-96 h. Após a preparação do embrião, permitir que os embriões eclodam em M9 (ver Tabela 1) por 48 h. Isso produzirá uma população síncrona de worms de estágio L1.
      NOTA: Os vermes CL2122 abrigam um transgene-GFP (proteína fluorescente verde) integrado expulso do promotor mtl-2 específico do intestino (MeTaLlothionein 2)38. Este promotor é específico para o citoplasma de células intestinais e permite que o intestino seja visualizado em um microscópio de dissecção fluorescente. Uma vez treinados, os usuários podem não achar necessária a orientação de fluorescência.
  2. Vermes L1 sincronizados com placas em um mínimo de duas placas pequenas. Cultivar vermes em placas de NGM com alimento suficiente até atingirem a fase adulta (identificada pela presença de embriões capazes de postura de ovos). Isso leva entre 38-46 h a 20 °C.
    1. Tome cuidado para garantir que o mesmo estágio de desenvolvimento seja colhido em replicações e em cepas comparativas.
      NOTA: O período de tempo para o crescimento dos vermes depende da cepa, temperatura, fonte de alimento e estágio de desenvolvimento visado39. Outros estágios próximos ao estágio adulto também podem ser usados, como os estágios L4 e adultos mais velhos. Para o planejamento de experimentos de microbioma, diferentes fontes de alimento bacteriano além da fonte de alimento tradicional (E. coli OP50) podem ser usadas para cultivar vermes, como as cepasCeMbio 4 ou um patógeno de interesse40.

2. Preparação de soluções-tronco e pipetas microcapilares

NOTA: A Tabela 1 fornece os detalhes de todos os buffers e soluções utilizados para o presente estudo.

  1. Prepare 50 mL de sais de ovo (também conhecido como tampão de ovo) em um tubo cônico livre de nuclease (consulte Tabela de Materiais). Uma vez feito, armazene à temperatura ambiente.
  2. Preparar 10 ml de solução de reserva de levamisol a 100 mM num tubo cónico isento de nuclease. Uma vez preparado, faça alíquotas de 500 μL e armazene-as a -20 °C. As alíquotas podem ser descongeladas e armazenadas a 4 °C durante 1 semana de cada vez.
  3. Preparar 1 mL de solução de albumina sérica bovina acetilada (BSA) de 20 mg/mL em um tubo de microcentrífuga livre de nuclease. Uma vez preparadas, faça alíquotas de uso único de 50 μL e armazene-as a -20 °C.
    NOTA: É importante usar a versão acetilada da BSA porque esta é a única forma de BSA que é livre de nuclease. A BSA não acetilada pode ser uma fonte significativa de nucleases e, assim, levar à degradação das amostras.
  4. Preparar pelo menos cinco pipetas microcapilares de 50 μm e 100 μm, cada uma seguindo os passos abaixo.
    1. Primeiro, puxe os capilares de vidro padrão (4 de comprimento e 1,2 mm de diâmetro externo) para uma forma de agulha de injeção usando um puxador de agulha (consulte Tabela de Materiais) e condições para "Célula Aderente, C. elegans e Drosophila" do Sutter Instruments Pipette Cookbook41 (Condições: Calor = Rampa + 5; Puxar = 100; Vel. = 75; Atraso = 90; Pressão = 500; Caixa de 2,5 mm x 2,5 mm).
    2. Em seguida, forje as pipetas microcapilares para um tamanho de 50 μm (três marcas de escala indicadas pela régua ocular microforge sob o objetivo M5/0.1) ou 100 μm (cinco marcas de escala nas mesmas condições) usando uma microforja (ver Tabela de Materiais). Esses tamanhos representam o diâmetro de abertura estimado da pipeta microcapilar (Figura 3).
    3. Em seguida, afixe um tubo aspirador de boca nas pipetas microcapilares.
      NOTA: As pipetas aspiradoras são tradicionalmente controladas por pipetagem bucal, mas muitos protocolos de segurança modernos não permitem esse método. Como tal, os usuários podem controlar a aspiração com a tubulação do aspirador de boca, apertando a tubulação entre o dedo e o polegar. Além disso, um filtro de seringa pode ser instalado dentro do sistema de tubulação do aspirador de boca para maior segurança.

3. Preparação experimental

  1. Prepare 5 mL de tampão de dissecção em um tubo cônico livre de nuclease. Armazenar à temperatura ambiente.
  2. Preparar 1 mL de solução de BSA acetilada em funcionamento em um tubo de microcentrífuga livre de nuclease. Mantenha-se no gelo.
  3. Fazer 350 μL de solução de levamisol de trabalho em um tubo de microcentrífuga livre de nuclease. Prepare em triplicado (um tubo para cerca de 20 vermes). Mantenha-se no gelo.
  4. Preparar tampão quelante em um tubo de microcentrífuga livre de nuclease (Tabela 1). Faça em replicar (um tubo para cerca de 10 vermes dissecados). Mantenha-se no gelo. O uso do tampão quelante durante as dissecções das mãos melhora a qualidade e a quantidade de RNA (Figura 4).
  5. Preparar um tubo de microcentrífuga por grupo experimental que contenha 500 μL de reagente de isolamento de ácido nucleico ou reagente de isolamento especificado por kit (ver Tabela de Materiais) num tubo isento de nuclease. Mantenha-se no gelo. Este tubo será usado para coletar os intestinos finais e isolados para armazenamento ou uso posterior.
  6. Prepare um banho M9 e um banho tampão de dissecção. Para isso, obtenha duas placas de Petri estéreis de 35 mm de diâmetro. Em seguida, adicione 2 mL de M9 a um prato e 2 mL de tampão de dissecção ao outro. Finalmente, adicione 100 μL de solução de BSA de trabalho a cada banho. Redemoinho para misturar. Adicionar BSA aos banhos impedirá que os vermes grudem no plástico.
  7. Prepare a matriz de dissecção. Obter uma lâmina de concavidade de 2 poços (ver Tabela de Materiais) e adicionar 150 μL de solução de levamisol de trabalho ao primeiro poço. Em seguida, adicione 150 μL de tampão de dissecção ao segundo poço. Finalmente, adicione 20 μL de solução BSA funcional a cada poço. Adicionar BSA a cada poço impedirá que os vermes grudem no slide.

4. Dissecção da mão do intestino de C. elegans

  1. Usando uma picareta de verme, mova 20 vermes adultos da placa NGM para o banho M9 (etapa 3.6). Isso lavará as bactérias externas dos vermes.
  2. Em seguida, mova todos os 20 vermes do banho M9 para o banho tampão de dissecação (etapa 3.6). Isso lavará ainda mais as bactérias externas e equilibrará os vermes no tampão de dissecção.
  3. Em seguida, mova lotes de vermes (ou seja, em conjuntos de 10) do banho tampão de dissecção para o poço contendo solução de levamisol (etapa 3.7).
    NOTA: O levamisol paralisará temporariamente os vermes.
    1. Uma vez que os movimentos do verme diminuam a velocidade, mova-os rapidamente do poço de levamisol para o poço que contém o tampão de dissecção (passo 3.7). Tome cuidado para não paralisar demais os vermes.
      NOTA: O número de worms movidos em lotes para a solução de levamisole pode variar com base no conforto do usuário. Isso também é verdade para o número de vermes colhidos inicialmente no banho M9 e depois movidos para o banho tampão de dissecção. É uma boa prática ter worms adicionais disponíveis para dissecação, especialmente durante o treinamento, à medida que o usuário aprende e se sente confortável com o protocolo.
  4. Em seguida, permita que os worms comecem a se mover um pouco no buffer de dissecação antes de iniciar as dissecações.
    NOTA: Os intestinos não se extrudem bem de vermes excessivamente paralisados (ou seja, vermes que não estão se movendo).
  5. Quando estiver pronto, disseque os vermes sob um escopo de dissecação fluorescente usando uma agulha hipodérmica (ou seja, 27 G x 1/2 pol) (ver Tabela de Materiais) fazendo um corte logo atrás da faringe (Figura 5Aa) ou logo na frente do reto (Figura 5Ab). Isso produzirá duas grandes seções do intestino, uma metade médio-anterior e uma metade médio-posteriorI. Continue esse padrão para o resto dos vermes, mantendo o número de cortes intestinais obtidos das seções ântero-média e médio-posterior equivalente até que o número total desejado de intestinos seja adquirido.
    NOTA: A fixação da agulha hipodérmica a um tambor de seringa vazio de 1 ml pode ajudar na sua manipulação durante as dissecações das mãos. Dependendo do conforto e da experiência do usuário, não é incomum fazer um corte de dissecção que não produza fragmento intestinal. No entanto, com a prática, isso se torna muito menos comum.
  6. Aguarde cerca de 1 min para que os intestinos extrudam ao máximo do corpo. Eles normalmente assumem uma forma de loop e podem estar presos a uma parte das gônadas (Figura 5A). Enquanto espera, adicione 50 μL de tampão quelante ao poço para ajudar a reduzir a degradação do RNA (Figura 4).
  7. Enquanto aguarda e para ajudar ainda mais a facilitar a extrusão intestinal, use a pipeta microcapilar de 100 μm presa a um aspirador de boca e puxe o intestino/verme para dentro e para fora da pipeta (Figura 5B). Isso também ajudará a liberar o intestino da gônada. Tome cuidado para não perder o intestino sugando-o acidentalmente completamente para a pipeta microcapilar.
    NOTA: O usuário pode alternar entre as pipetas microcapilares de 100 μm e 50 μm para liberar o intestino do resto do corpo e da gônada. A abertura de menor diâmetro da pipeta microcapilar de 50 μm pode proporcionar um benefício para a remoção de pedaços pegajosos do intestino. As pipetas aspiradoras são tradicionalmente controladas por pipetagem bucal, mas muitos protocolos de segurança modernos não permitem esse método. Como tal, os usuários podem controlar a aspiração com a tubulação do aspirador de boca, apertando a tubulação entre o dedo e o polegar. Além disso, um filtro de seringa pode ser instalado dentro do sistema de tubulação do aspirador de boca para maior segurança.
  8. Uma vez que um intestino esteja suficientemente extrudido, use a agulha hipodérmica 27 G para cortá-lo longe do resto do corpo e de qualquer gônada restante. O tamanho da seção do intestino isolada pode variar muito, dependendo da experiência do colhedor, da qualidade do corte e do nível de paralisia no verme.
    NOTA: A integridade do intestino e dos fragmentos intestinais pode ser facilmente monitorada em todo o protocolo através da fluorescência da GFP.
  9. Agora, use a pipeta microcapilar para aspirar a seção intestinal e movê-la para fora do poço e para o tubo de microcentrífuga contendo reagente de isolamento de ácido nucleico ou reagente de isolamento especificado pelo kit. Mantenha os intestinos isolados em reagente no gelo e repita para os intestinos restantes.
    NOTA: Múltiplos intestinos podem ser adicionados ao tubo de microcentrífuga contendo reagente de isolamento de ácido nucleico ou outro reagente de isolamento especificado pelo kit ao longo do dia. Mantenha-se no gelo. Se todos os intestinos não puderem ser isolados em 1 dia, aqueles que já estão isolados e armazenados em um reagente de isolamento de ácido nucleico (que preserva os ácidos nucleicos) podem ser mantidos a -80 ° C até que os isolamentos retomem e / ou possam ser concluídos. Aqui, as amostras são estáveis a longo prazo (ou seja, vários meses a 1 ano) e podem permanecer até que estejam prontas para isolar ácidos nucleicos. Os intestinos podem ser colhidos em água ou em qualquer tampão de lise específico do kit. No entanto, deve-se considerar ao determinar quanto tempo os intestinos podem permanecer em um determinado tampão no gelo (ou outra temperatura desejada) antes de passar para aplicações a jusante.

5. Isolamento de RNA de intestinos dissecados

  1. Homogeneizar os tecidos adquiridos armazenados no reagente de isolamento de ácido nucleico realizando três ciclos de congelamento/descongelamento/vórtice. Para tal, utilizar um banho de grânulos de 37 °C e azoto líquido (ou outros meios comparáveis).
  2. Em seguida, adicione 0,2 volumes de fenol:clorofórmio:IAA reagente (ver Tabela de Materiais) à amostra e ao vórtice brevemente. Por exemplo, para um volume de amostra inicial de 500 μL, 0,2 volumes de clorofórmio seria 100 μL.
  3. Agite o tubo à mão por 20 s e, em seguida, incube à temperatura ambiente por 3 min.
  4. Separe as fases da amostra por centrifugação (10.000 x g, 18 min, 4 °C).
  5. Remova a fase aquosa e transfira para um novo tubo de microcentrífuga livre de nuclease.
    NOTA: Tome cuidado para não aspirar ou perturbar a interface.
  6. Em seguida, adicione um volume igual de etanol a 100% à fase aquosa e agite a amostra à mão por 20 s.
  7. Transfira 700 μL da amostra para a coluna de rotação (ver Tabela de Materiais). Em seguida, aderir RNA à coluna com centrifugação (≥8.000 x g, 30 s, RT [temperatura ambiente]). Descarte o fluxo. Repetir para qualquer amostra restante adicional.
  8. Adicionar 350 μL de tampão RW1 (ver Tabela de Materiais) à coluna para lavar a amostra. Em seguida, centrifugar (≥8.000 x g, 30 s, RT) e descartar o fluxo.
  9. Realize a digestão do DNA na coluna. Adicione 80 μL de DNase I no buffer RDD (consulte Tabela de Materiais) à coluna de amostra. Em seguida, incube por 15 min no RT.
  10. Em seguida, adicione 350 μL de tampão RW1 à coluna para lavar a amostra. Centrifugar (≥8.000 x g, 30 s, RT) e transferir a coluna para um novo tubo de coleta. Descarte o tubo de coleta de fluxo e antigo. Esta lavagem remove a DNase.
  11. Adicione 500 μL de EPR (ver Tabela de Materiais) à coluna de amostragem. Em seguida, centrifugar (≥8.000 x g, 30 s, RT) e descartar o fluxo. Repita para uma segunda lavagem.
  12. Em seguida, centrifugar por mais 1 min para secar ainda mais a membrana da coluna (≥8.000 x g, 1 min, RT). Em seguida, transfira a coluna de amostra para um novo tubo de coleta de microcentrífuga livre de nuclease com uma tampa. Descarte o tubo de coleta de fluxo e antigo.
  13. Adicionar 14 μL de água isenta de nuclease diretamente à membrana da coluna da amostra. Em seguida, incubar a amostra por 2 min no RT. Em seguida, centrífuga (≥8.000 x g, 1 min, RT) para eluír o RNA.
  14. Armazenar a amostra no gelo. Em seguida, avalie a qualidade e a quantidade de RNA da amostra usando kits de ensaio comercialmente disponíveis (consulte a Tabela de Materiais). Uma vez feito, armazene a amostra em um freezer de -80 °C.
    NOTA: O RNA é geralmente estável a -80 °C por até 1 ano sem degradação.

Resultados

O presente protocolo foi utilizado para isolar manualmente grandes seções do intestino de C. elegans adultas (Figura 2). A amostra final do intestino para cada grupo experimental mostrado é composta por uma coleção igual de cortes do intestino ântero-médio e médio-posterior. No entanto, dependendo da questão experimental, também pode incluir uma coleção de apenas seções do intestino anterior, médio ou posterior. Coletivamente, três resultados representativos são apresentados para este protocolo. A primeira retrata a dissecção e o isolamento bem-sucedidos dos intestinos (Figura 6). O segundo relata os resultados do isolamento de RNA de intestinos isolados (Figura 7). O terceiro mostra os resultados da vigilância microbiana de intestinos isolados (Figura 8).

Para o primeiro resultado, a Figura 6A exibe como é um intestino extrudado depois de fazer uma incisão primária no local "a" na Figura 5A dentro de vermes CL2122 adultos. Como os vermes CL2122 abrigam o promotor mtl-2 específico do intestino fundido à GFP (mtl-2 p::GFP), os intestinos isolados brilharão verde sob o escopo de dissecação fluorescente. A dissecção bem-sucedida de um segmento intestinal é então mostrada na Figura 6B. Esta seção do intestino está livre de contaminantes visíveis, como detritos da gônada ou carcaça. Em contraste, a Figura 6C mostra intestinos que não são dissecados com sucesso, pois gônada e carcaça ainda estão visivelmente ligados ao segmento intestinal.

Para o segundo resultado, os intestinos foram colhidos em um reagente de isolamento de ácido nucleico e processados no dia seguinte usando um protocolo de extração de RNA total de baixa entrada (ver Tabela de Materiais). Uma amostra final do intestino de 60 cortes do intestino total das seções ântero-média e médio-posterior produz aproximadamente 15 ng de RNA total de alta qualidade (Figura 7A). Esta quantidade de intestinos totais pode ser facilmente obtida em um único dia, mas também pode ser quebrada ao longo de vários dias, se necessário. Os rendimentos de RNA da dissecção da mão são mais eficientes do que a desagregação de vermes e o isolamento FACS de células intestinais, na medida em que centenas de milhares de células intestinais são necessárias para obter quantidades proporcionais de RNA total (Figura 7B). É importante ressaltar que os rendimentos de RNA gerados pela dissecção manual são mais do que suficientes como entrada para kits comerciais de biblioteca de RNA-seq (ou seja, NEBNext Ultra II e NEBNext Single Cell/Low Input), que podem levar apenas 2 pg de RNA.

Para o terceiro resultado, os intestinos foram colhidos em ddH20 estéril e processados no mesmo dia usando um kit comercial de isolamento de DNA microbiano (ver Tabela de Materiais). Uma amostra final do intestino de 40 seções do intestino total das seções ântero-média e médio-posterior produz cerca de 0,009 pg de DNA microbiano total usando um ensaio de detecção panbacteriana (ver Tabela de Materiais) (Figura 8). Essas quantidades são muito baixas para os métodos tradicionais de quantificação e devem ser extrapoladas a partir de curvas padrão de qPCR. Idealmente, os usuários devem direcionar uma quantidade total final de intestinos >40, pois isso aumenta o limite de detecção e o limite do sinal-ruído em relação aos níveis de contaminação por reagentes.

Ao considerar o delineamento experimental, a coleta de amostras de controle apropriadas é sempre necessária. Para experimentos transcriptômicos, um controle experimental adequado pode incluir preparações de todo o verme coletadas da mesma maneira que os intestinos. Durante a dissecção e isolamento dos intestinos de C. elegans, no entanto, é comum ver pedaços de carcaça e gônada agarrados às seções do intestino. Embora idealmente esses tecidos contaminantes sejam removidos dos intestinos antes do armazenamento para uso a jusante, controles experimentais adicionais podem incluir a coleta das carcaças de vermes remanescentes após a dissecção do intestino e / ou a coleta de gônadas dissecadas. Para experimentos de microbioma, os controles também podem incluir preparações de todo o verme coletadas da mesma maneira que os intestinos, além de controles convencionais positivos (cultura bacteriana) e negativos (água).

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Figura 1: Dissecção manual de intestinos de C. elegans adultos usados para gerar preparações específicas de tecidos para uso em uma ampla variedade de ensaios ômicos a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Esquema para o protocolo de dissecção manual. Este protocolo foi usado para isolar grandes seções do intestino de C. elegans adultos à mão. Os intestinos podem ser isolados para diferentes ensaios a jusante. Aqui é mostrado o uso de intestinos para isolamento de RNA e isolamento de DNA microbiano. Imagem criada com BioRender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Fabricação de pipetas microcapilares. (A) Uma pipeta microcapilar recém-puxada, mas não forjada, é mostrada através da peça ocular de uma microforja. Uma régua ocular é usada para medir pipetas microcapilares de tamanho de 50 μm até um diâmetro interno estimado de três marcas de escala (mostradas, indicadas por seta). (B) Pipetas microcapilares não forjadas, de 50 μm e 100 μm, são mostradas sob o escopo de dissecação ao lado de uma régua de calibração com 1 div = 0,1 mm. (C) As pipetas microcapilares de 50 μm e 100 μm de (B) são mostradas novamente, mas de um ponto de vista diferente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: O uso do tampão quelante (CB) durante a dissecção da mão para melhorar o rendimento de RNA. Um protocolo de extração de RNA total de baixa entrada gerou preparações de RNA a partir de tecidos nomeados. Execuções representativas de eletroforese em gel caracterizando a qualidade do RNA total isolado (RIN, número de integridade do RNA) e a quantidade são mostradas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Etapas de dissecção manual. (A) As etapas de dissecção descritas no protocolo são descritas aqui. Em (1), o intestino do verme é visualizado por fluorescência de GFP. O local primário da incisão pode ser distribuído uniformemente entre os vermes para garantir uma cobertura uniforme em todo o comprimento do intestino. Alternativamente, os locais de incisão primária "a" ou "b" podem ser selecionados para obter uma preparação específica do fragmento intestinal ântero-médio ou médio-posterior. Em (2), o intestino extrudeu, assumindo uma forma de laço. Em (3), o intestino é primeiro cortado do corpo do verme enquanto tenta libertá-lo da carcaça e da gônada. O intestino é então removido de qualquer carcaça ou gônada remanescente que não possa ser removida. Em (4), uma seção limpa do intestino é isolada e pronta para armazenamento. (B) Um passo crítico é desalojar quaisquer detritos em declínio (isto é, gônada, carcaça) do intestino, passando-os para dentro e para fora da pipeta microcapilar formada no final do aspirador da boca. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Resultados representativos das etapas de dissecção das mãos. Uma imagem representativa mostrando (A) a extrusão do intestino do verme. Estes são vermes do genótipo CL2122, expressando GFP sob o promotor mtl-2 específico da célula intestinal. Duas imagens representativas mostram (B) uma seção limpa e totalmente isolada do intestino e (C) um intestino isolado com gônadas contaminantes e tecidos de carcaça. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Resultados representativos da extração total de RNA de intestinos isolados. (A) Uma imagem representativa de preparações de RNA resolvidas por eletroforese em gel de agarose é mostrada, caracterizando a qualidade (RINs, Número de integridade de RNA) e quantidade de RNAs totais isolados. (B) Um gel representativo de RNA total isolado de células intestinais colhidas de vermes em estágio L1 via classificação celular ativada por fluorescência (FACS) é mostrado para comparação. Com 20 células por intestino, pode-se inferir que o método de dissecção da mão produz mais RNA total por intestino do que as células intestinais purificadas por FACS. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Resultados representativos para a extração de DNA microbiano total de intestinos isolados. Um kit comercial de isolamento de DNA microbiano gerou preparações de DNA de intestinos, vermes inteiros e controles. Um ensaio genético panbacteriano foi usado para quantificar o número de bactérias nas amostras. Uma imagem representativa de (A) as curvas de amplificação qPCR geradas, (B) a curva padrão de E. coli OP50 usada para quantificar as amostras e (C) as amostras são mostradas. Em (B), as concentrações iniciais logarítmicas dos padrões de E. coli são representadas graficamente em relação aos seus valoresde C T. Em (C), duas repetições (repetições) de 40 vermes inteiros foram cortadas medialmente e 40 cortes intestinais isolados foram processados para isolamento microbiano de gDNA. O NTC (No-Template-Control) da execução qPCR também é mostrado. O eixo Y representa os valores CT de exemplo. A quantidade de DNA quantificado a partir de PCRs é mostrada como valores de picogramas totais (pg) acima das barras da amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composições dos tampões e soluções utilizadas neste estudo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Este artigo descreve o protocolo passo-a-passo para dissecar manualmente intestinos de C. elegans adultos, gerando preparações puras para ensaios a jusante. As etapas críticas neste protocolo incluem (1) garantir não paralisar excessivamente os vermes, (2) fazer cortes precisos de dissecção, (3) forjar micropipetas de tamanho adequado para dissecação e (4) garantir a rápida recuperação de intestinos saudáveis durante a colheita final. Por estas razões, deve-se tomar cuidado ao expor os vermes à solução de levamisol, e as agulhas hipodérmicas precisam ser refrescadas com frequência para garantir a máxima nitidez. Manusear o intestino usando a pipeta microcapilar e o aspirador de boca é outro passo que exigirá prática. Micropipetas devidamente forjadas do tamanho apropriado também fazem uma diferença substancial no isolamento de grandes seções do intestino durante as dissecções, além de reduzir o risco de perda de intestinos dentro da micropipeta. Os novos usuários de protocolo geralmente perdem intestinos na borda interna da pipeta microcapilar antes que possam ser ejetados no reagente de isolamento. Este problema pode ser corrigido com a prática e pipetas microcapilares devidamente forjadas.

O protocolo aqui descrito foi projetado para uso em vermes adultos. Ensaios preliminares apoiam que este protocolo também é eficaz para uso em vermes L4 e vermes adultos mais velhos. No entanto, a eficácia deste protocolo ainda não foi avaliada em vermes em estágio larval precoce. Uma limitação dessa abordagem é a pequena quantidade de material que ela produz. Embora as quantidades sejam suficientes para RNA-seq e PCR, elas podem não ser adequadas para outros ensaios. Como tal, os usuários precisam determinar se a entrada mínima necessária para um ensaio pode ser coletada de forma viável com esse protocolo.

Nosso laboratório utiliza rotineiramente o FACS para purificar as células intestinais pós-isolamento 30, métodos de análise post-hoc para identificação de células intestinais e este método de dissecção manual30,42. A dissecção das mãos tem a vantagem de ser passível de uso em vermes adultos quando a desagregação de vermes e o isolamento celular são menos bem-sucedidos. Além disso, a eficiência e a qualidade do RNA total extraído das preparações de dissecção manual são altas, provavelmente porque os tecidos são rapidamente arrancados dos vermes e, em seguida, rapidamente depositados em um reagente de isolamento de ácido nucleico, reduzindo a degradação do RNA. Outro benefício do método de dissecção manual é que é de baixo custo, fácil de aprender e não requer equipamentos especializados. Finalmente, essa abordagem permite a colheita e o isolamento de bactérias intestinais de intestinos de vermes, permitindo estudos de microbioma a jusante.

O protocolo de dissecção manual descrito aqui para isolar intestinos de C. elegans adultos representa uma ferramenta poderosa para o estudo de vários aspectos da biologia de C. elegans. Por exemplo, com uma preparação pura dos intestinos, os pesquisadores podem investigar a interseção entre imunidade, envelhecimento, metabolismo e microbioma.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Estamos em dívida com o trabalho pioneiro de James McGhee e Barb Goszczynski, que inicialmente desenvolveram o método de dissecção intestinal a partir do qual este protocolo é adaptado. Nosso trabalho é apoiado por um Prêmio MIRA (R35) supervisionado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (Institutos Nacionais de Saúde, R35GM124877 para EON) e um Prêmio NSF-CAREER supervisionado pelo NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Prêmio # 2143849 para EON).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina de soro bovino acetilada (BSA)VWR97061-420Cepa de
verme BSA CL2122CGC (Caenorhabditis Genetics Center)CL2122dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vetor) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Tensão de controle para CL2120. Fenótipo aparentemente WT.
Cloreto de cálcio di-hidratadoFisherC79necessário para fazer sais de ovo
50 mL Tubos de centrífuga, OlympusPlastics28-108Tubo cônico livre de nuclease necessário para a fabricação de soluções.
Tubos de centrífuga de 15 mL, Plásticos Olympus a granel28-103Tubo cônico livre de nuclease necessário para a fabricação de soluções.
Lâmina de concavidade (2 poços)Electron Microscopy Sciences71878-0812-pk de lâminas de concavidade de 2 poços
Etilenoglicol-bis(2-amino-etiléter)-N,N',N',N'-ácido tetracético (EGTA)Millipore SigmaE3889necessário para fazer tampão de quelação
Microscópio de Dissecção FluorescenteLeicaM205 FCAEste é um equipamento opcional que pode ser usado com cepas fluorescentes de C. elegans para ajudar a guiar os usuários durante as dissecações manuais
N- (2-hidroxietil) piperazina-N′ - (ácido 2-etanossulfônico), ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfônico (HEPES)Millipore SigmaH4034necessário para fazer tampão de dissecção
Fita de tela de RNA de alta sensibilidadeAgilent5067-5579para avaliação da qualidade total do RNA e quantidade
Escada de fita de tela de RNA de alta sensibilidadeAgilent5067-5581para avaliação da qualidade e quantidade total de RNA
ScreenTape de alta sensibilidade Buffer de amostraAgilent5067-5580para avaliação da qualidade e quantidade total de RNA
Kit de DNA microbiano HostZEROZymo ResearchD4310Isolamento de DNA microbiano de intestinos/vermes de vermes
Agulha Hipodérmica (27G x 1/2")BD Scientific305109necessária para a dissecção manual dos intestinos
Levamisol (também conhecido como (-)-Cloridrato de Tetramisol)Millipore SigmaL9756usado para paralisar temporariamente vermes antes da dissecção manual dos intestinos.
Seringa descartável de uso geral Luer-Lok (1 mL)BD Scientific309628opcional. Pode ser usado para fixar a agulha hipodérmica, permitindo uma manipulação mais fácil da agulha durante a dissecção. Remova o êmbolo.
Cloreto de Magnésio HexahidratadoFisherM33necessário para fazer Sais de Ovo
Sulfato de Magnésio HpetahidratadoSigma-Aldrich230391-500Gnecessário para fazer tampão M9
MF-900 MicroforgeNarishigeMF-900Usado para forjar as pipetas microcapilares. Disponível através da Tritech Research.
Microtubos de 1,7 mL, ClearOlympus Plastics22-282Tubo de microfuga livre de nuclease necessário para a fabricação de soluções e armazenamento de amostras.
Tubo Aspirador de BocaMillipore SigmaA5177O tubo de aspirador de boca é necessário em combinação com a pipeta microcapilar para permitir a aspiração de intestinos dissecados.
16S Pan-Bacterial Control TaqMan AssayThermo FisherA50137ID do ensaio: Ba04930791_s1. Ensaio usado para detecção microbiana intestinal via qPCR.
P-1000 Extrator de MicropipetasInstrumentosSutter Modelo P-1000Usado para puxar as pipetas microcapilares antes do forjamento.
Placa de Petri (35 x 10 mm)Genesee Scientific - Olympus Plastics32-103Usada para fazer banho M9 e banho tampão Disseciton para lavar vermes antes da dissecação.
Fenol: Clorofórmio: IAAAmbionAM9730Usado no isolamento de RNA total
Cloreto de potássioMillipore Sigma529552necessário para fazer sais de ovo
Fosfato de potássio MonobasicSigma-AldrichP0662-500Gnecessário para fazer buffer M9
Qubit 3 FluorômetroInvitrogenQ33216Acompanha o kit de ensaio Qubit RNA HS. Pode ser usado para quantificar o RNA antes de executar a amostra no Agilent ScreenTape.
Kit de ensaio Qubit RNA HSInvitrogenQ32852Pode ser usado para quantificar o RNA antes de executar a amostra no Agilent ScreenTape.
PromegaN2111da ribonuclease de RNasinaInibição de amplo espectro de Rnases eucarióticas comuns
Conjunto de DNase livre de RNaseQiagen79254usado para digestão de DNA na coluna durante o protocolo de isolamento de RNA.
RNeasy Micro KitQiagen74004Usado para isolamento de RNA total de intestinos/vermes de vermes
Capilares de vidro padrãoWorld Precision Instruments1B100F-44 in OD 1,2 mm capilares de vidro borossilicato padrão usados para fazer pipetas microcapilares para dissecção
Cloreto de sódioFisherS271necessário para fazer sais de ovo
Fosfato de sódio dibásico heptahidratadoFisher ScientificS373-500necessário para fazer filtro de seringa de tampão M9
(SCFA de 0,2 micrômetro)Thermo Fisher72302520Opcional para uso com o tubo do aspirador bucal ao pipetar na boca.
4150 TapeStation SystemAgilentG2992AAAcompanha os reagentes RNA ScreenTape para avaliar a qualidade e quantidade de RNA
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master MixApplied BiosystemsA52699master mix usado para qPCR
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026Isolamento e preservação de ácidos nucleicos. QIAzol (Qiagen; 79306) pode ser substituído, se preferir.
Picareta de minhocaNANAFeito em casa a partir de uma pipeta pasteur e um fio de platina. Consulte wormbook para obter detalhes.
livre de nuclease a granel Inibidor

Referências

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