Preparação padronizada do anel coronário de rato e gravação em tempo real de mudanças dinâmicas de tensão ao longo do diâmetro do vaso

Resumo

O presente protocolo descreve a técnica de miógrafo de fio para medir a reatividade vascular da artéria coronária do rato.

Resumo

Como um evento-chave das doenças do sistema cardiovascular, a doença arterial coronariana (CAD) tem sido amplamente considerada como o principal culpado da aterosclerose, do infarto do miocárdio e da angina pectoris, que ameaçam seriamente a vida e a saúde das pessoas em todo o mundo. No entanto, como registrar as características biomecânicas dinâmicas dos vasos sanguíneos isolados há muito intriga as pessoas. Enquanto isso, o posicionamento preciso e o isolamento das artérias coronárias para medir mudanças in vitro dinâmicas de tensão vascular tornaram-se uma tendência no desenvolvimento de medicamentos CAD. O presente protocolo descreve a identificação macroscópica e a separação microscópica das artérias coronárias de ratos. A função de contração e dilatação do anel da artéria coronária ao longo do diâmetro do vaso foi monitorada utilizando-se o sistema multimógrafo estabelecido. Os protocolos padronizados e programados de medição da tensão do anel coronário, desde a amostragem até a aquisição de dados, melhoram tremendamente a repetibilidade dos dados experimentais, o que garante a autenticidade dos registros de tensão vascular após intervenção fisiológica, patológica e medicamentosa.

Introdução

A doença arterial coronariana (CAD) tem sido amplamente reconhecida e preocupada como uma doença cardiovascular típica e representativa, sendo a principal causa de morte nos países desenvolvidos e em desenvolvimento ^1,2. Como uma rota de fornecimento de sangue e oxigênio para a função fisiológica cardíaca normal, o sangue circulante entra e nutre o coração através de duas artérias coronárias principais e uma rede vascular de sangue na superfície do miocárdio ^3,4. Depósitos de colesterol e gordura nas artérias coronárias cortam o suprimento sanguíneo do coração e a resposta inflamatória violenta do sistema vascular, causando aterosclerose, angina estável, angina instável, infarto do miocárdio ou morte cardíaca súbita ^5,6. Em resposta à estenose patológica das artérias coronárias, batimentos cardíacos fisiológicos acelerados compensatórios satisfazem o suprimento sanguíneo do próprio coração ou órgãos vitais do corpo aumentando a saída do ventrículo esquerdo⁷. Se a estenose coronária prolongada não for aliviada a tempo, novos vasos sanguíneos extensos podem se desenvolver em certas áreas do coração⁸. Atualmente, o tratamento clínico da CAD muitas vezes adota trombolise medicamentosa ou trommbolise mecânica cirúrgica e um bypass vascular biônico exógeno com medicação frequente e grande incapacidade cirúrgica⁹. Portanto, a investigação funcional da atividade fisiológica da artéria coronária ainda é um avanço urgente para as doenças cardiovasculares¹⁰.

Não há meios técnicos disponíveis para detectar atividade fisiológica coronária, exceto para sistemas de telemetria sem fio, que podem registrar dinamicamente pressão coronariana viva , tensão vascular, saturação de oxigênio no sangue e valores de pH¹¹. Portanto, considerando o sigilo e complexidade textural das artérias coronárias, a identificação precisa e o isolamento das artérias coronárias são, sem dúvida, as melhores opções para explorar múltiplos mecanismos de CAD in vitro⁴.

Um sistema multimógrafo de série, em particular um detector de tensão microvascular de fio (ver Tabela de Materiais), é um dispositivo comercializável muito maduro para registrar alterações in vitro de tensão tecidual de pequenos tubos vasculares, linfáticos e brônquicos com as características de alta precisão e gravação dinâmica contínua¹². O referido sistema tem sido amplamente empregado para registrar características in vitro de tensão tecidual de estruturas de cavidade com diâmetros de 60 μm a 10 mm. As características de aquecimento contínuo da plataforma do micrografo do fio compensam em grande parte a estimulação do ambiente externo adverso. Enquanto isso, os constantes insumos da mistura de gás e os valores do pH permitem obter dados de tensão vascular mais precisos em um estado fisiológico semelhante¹³. No entanto, considerando a complexidade da localização anatômica das artérias coronárias de ratos (Figura 1), seu isolamento tem sido desconcertante e limitando a exploração do mecanismo de doenças cardiovasculares diversificadas e desenvolvimento de medicamentos. Portanto, o presente protocolo introduz em detalhes o processo de localização anatômica e separação da artéria coronária do rato, seguido da medição da tensão na plataforma do micrografo^{do fio 14}.

Protocolo

O protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Gestão da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Record nº 2021-11). Os ratos machos Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 semanas de idade) foram utilizados para o presente estudo. Os ratos eram mantidos em uma câmara animal e eram livres para beber e comer durante o experimento.

1. Preparação da solução

1. Prepare a solução fisiológica de sal (PSS) dissolvendo 118 mM de NaCl, 4,7 mM de K⁺, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de KH₂PO₄, 1,2 mM de MgCl₂∙6H₂O, 25 mM de NaHCO₃, 11 mM de D-glicose e 5 mM de HEPES (ver Tabela de Materiais).
2. Prepare a solução de sal K⁺ alta dissolvendo 58 mM de NaCl, 60 mM de K⁺, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de KH₂PO4, 1,2 mM de MgCl₂∙6H₂O, 25 mM de NaHCO₃, 11 mM de D-glicose e 5 mM de HEPES.
3. Saturar as duas soluções acima e bolha com um gás misto de 95% O₂ e 5% de CO₂. Enquanto isso, mantenha os valores de pH da solução entre 7,38 e 7,42 com 2 mM NaOH.
   NOTA: Para obter informações sobre a preparação da solução, consulte a referência¹⁵.

2. Dissecção da artéria coronária do rato

1. Anestesiar o rato por inalação de 2% de isoflurane. Confirme a anestesia profunda por beliscão do dedo do sol e, se necessário, administre anestésicos adicionais. Em seguida, abra imediatamente a cavidade torácica para expor o coração na mesa de operação portátil após um relatório publicado anteriormente¹².
2. Depois de dissociar e remover o coração, drene o sangue residual de todas as câmaras cardíacas apertando levemente com fórceps plásticos médicos. Coloque rapidamente o coração pré-processado em uma placa de Petri contendo 95% O₂ + 5% DE CO₂ Saturado PSS a 4 °C, tendo um valor de pH de 7,40.
3. Para identificar com precisão a posição anatômica das artérias coronárias, ajuste a postura do coração isolado sob o microscópio de luz de acordo com o diagrama esquemático (Figura 2A).
   NOTA: Na visão frontal, a aurícula direita e a artéria pulmonar estavam no canto superior esquerdo e superior direito, respectivamente.
   1. Corte as cavidades ventriculares esquerda e direita ao longo do septo interventricular da raiz da artéria pulmonar com tesoura cirúrgica e pinça (Figura 2B).
4. Para dissociar as artérias coronárias esquerda e direita do tecido miocárdio, dissecar o ventrículo direito sob um microscópio anatômico óptico para expor completamente o ramo da artéria coronária direita. Em seguida, identifique a posição da artéria coronária esquerda girando o tecido cardíaco 45° no sentido horário (Figura 2D).
5. Depois de remover o tecido miocárdio pegajoso circundante, discerna explicitamente as artérias coronárias pulsantes esquerda (cerca de 5 mm) e direita (cerca de 5 mm). Separe as artérias coronárias no meio imediatamente e mergulhe completamente no PSS a 4 °C. Adquira um anel arterial de cerca de 2 mm cortando verticalmente a artéria destacada com uma tesoura anatômica para registrar a tensão vascular sob diferentes estímulos (Figura 2E).

3. Suspensão e fixação do anel arterial

NOTA: Para obter detalhes sobre esta etapa, consulte a referência¹⁴.

1. Prepare dois fios de aço inoxidável de 2 cm (ver Tabela de Materiais) e pré-mergulhe na solução PSS de 4 °C saturada com 95% O₂ + 5% DE CO₂. Passe ambos os fios paralelamente através do anel arterial, juntamente com a direção do vaso sob um microscópio anatômico óptico e com fios de comprimento igual expostos em ambas as extremidades da cavidade vascular.
2. Fixar o anel arterial com a frente do fio de aço e para trás na banheira do micrografo do fio preenchido com PSS borbulhante com 95% O₂ + 5% CO₂. Gire o botão horizontal do parafuso para um espaçamento dianteiro e traseiro adequado para que os dois fios sejam horizontais e o anel arterial esteja em um estado natural de relaxamento.
3. Após a instalação do banho DMT no aparelho termostático, abra o software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) para garantir que o sinal de caminho correspondente seja registrado. Definir os seguintes parâmetros: calibração da ocular (mm/div): 0,36; pressão do alvo (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; tempo médio online: 2 s; tempo de atraso: 60 s. Os passos da fixação do anel arterial são mostrados na Figura 3.

4. Padronização da tensão vascular no anel arterial de rato

NOTA: Para diferentes amostras de cavidade, a tensão inicial ideal foi necessária para que os vasos mantivessem atividade excepcional in vitro. Para mais detalhes, consulte a referência¹⁵.

1. Alcance a tensão inicial ideal do anel arterial aplicando uma tensão razoável ao longo do diâmetro do vaso.
   NOTA: Com base no estudo anterior¹⁶, a tensão maximal induzida por agonista foi realizada no fator k valor de 0,90 com a tensão inicial de estiramento de 1,16 ± 0,04 mN/mm (valores de referência para diferentes amostras de vasos: k valor, 0,90-0,95; tensão inicial, 1,16-1,52 mN/mm).
2. Neste ponto, defina o valor de tensão vascular exibido como zero. Depois, aplique um estímulo de 3 mN de puxar ao anel arterial girando o eixo espiral do banho.
3. Após a incubação por 1 h no tampão PSS saturado de oxigênio a 37 °C, pH 7.40, defina o valor da tensão para 0 mN novamente no painel de controle de tensão do micrografo do fio. O processo de configuração da tensão inicial do anel arterial é mostrado na Figura 4.

5. Detecção de reatividade do anel da artéria coronária

1. Realize a atividade contratil do anel da artéria coronária com a técnica de miógrafo^{de arame 14}, e valide em três operações separadas, estimulando com 60 mM de solução K⁺ por 10 min cada.
2. Após cada estimulação, lave o banho com PSS saturado de oxigênio até que o tom vascular retorne ao seu estado inicial.
   NOTA: Somente quando a flutuação de tensão das três medidas paralelas foi inferior a 10%, e a amplitude de cada contração foi maior que 1 mN/mm, anéis arteriais qualificados e altamente ativos poderiam ser usados para outros experimentos. A verificação de atividade do anel coronário de rato é mostrada na Figura 5.

6. Tratamento pós-cirúrgico

1. Após a cirurgia, eutanásia os animais seguindo protocolos institucionalmente aprovados.
   NOTA: Para o presente estudo, os animais foram eutanizados por inalação de excesso de isoflurano.

Resultados

Posicionados anatomicamente, as artérias coronárias de ratos distribuídas e escondidas profundamente no tecido miocárdio não foram facilmente reconhecidas. Comparando-se as artérias coronárias de humanos (Figura 1A) e ratos (Figura 1B), a separação rápida e precisa das artérias coronárias de ratos foi conduzida de acordo com o processo de amostragem na Figura 2. Depois de localizar precisamente a aurícula direita, artéria pulmonar e...

Discussão

A perturbação da microcirculação coronariana, que envolve uma ampla gama de pacientes com CAD, tem sido gradualmente reconhecida e preocupada com a base para a perfusão adequada do miocárdio. Considerando as sérias complicações de doenças cardíacas coronarianas súbitas e doenças cardiovasculares, a prevenção e o tratamento oportunos de drogas são extremamente importantes para um indivíduo clínico com CAD¹⁷. Inevitavelmente, o sigilo da anatomia da artéria coronária e a complexidade de sua estrutur...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China	150731
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China	A501330
D-glicose	Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China	A100781
LabChart Professional versão 8.3	ADInstruments, Austrália	—
MgCl2· 6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China	A100288
Sistema multi-miógrafo	Myo Technology, Aarhus, Dinamarca	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China	A100865
Fios de aço	Danish Myo Technology, Aarhus, Dinamarca	400447
U46619	Sigma, EUA	D8174