Preparação padronizada do anel coronário de rato e gravação em tempo real de mudanças dinâmicas de tensão ao longo do diâmetro do vaso

A doença arterial coronariana (CAD) tem sido amplamente reconhecida e preocupada como uma doença cardiovascular típica e representativa, sendo a principal causa de morte nos países desenvolvidos e em desenvolvimento ^1,2. Como uma rota de fornecimento de sangue e oxigênio para a função fisiológica cardíaca normal, o sangue circulante entra e nutre o coração através de duas artérias coronárias principais e uma rede vascular de sangue na superfície do miocárdio ^3,4. Depósitos de colesterol e gordura nas artérias coronárias cortam o suprimento sanguíneo do coração e a resposta inflamatória violenta do sistema vascular, causando aterosclerose, angina estável, angina instável, infarto do miocárdio ou morte cardíaca súbita ^5,6. Em resposta à estenose patológica das artérias coronárias, batimentos cardíacos fisiológicos acelerados compensatórios satisfazem o suprimento sanguíneo do próprio coração ou órgãos vitais do corpo aumentando a saída do ventrículo esquerdo⁷. Se a estenose coronária prolongada não for aliviada a tempo, novos vasos sanguíneos extensos podem se desenvolver em certas áreas do coração⁸. Atualmente, o tratamento clínico da CAD muitas vezes adota trombolise medicamentosa ou trommbolise mecânica cirúrgica e um bypass vascular biônico exógeno com medicação frequente e grande incapacidade cirúrgica⁹. Portanto, a investigação funcional da atividade fisiológica da artéria coronária ainda é um avanço urgente para as doenças cardiovasculares¹⁰.

Não há meios técnicos disponíveis para detectar atividade fisiológica coronária, exceto para sistemas de telemetria sem fio, que podem registrar dinamicamente pressão coronariana viva , tensão vascular, saturação de oxigênio no sangue e valores de pH¹¹. Portanto, considerando o sigilo e complexidade textural das artérias coronárias, a identificação precisa e o isolamento das artérias coronárias são, sem dúvida, as melhores opções para explorar múltiplos mecanismos de CAD in vitro⁴.

Um sistema multimógrafo de série, em particular um detector de tensão microvascular de fio (ver Tabela de Materiais), é um dispositivo comercializável muito maduro para registrar alterações in vitro de tensão tecidual de pequenos tubos vasculares, linfáticos e brônquicos com as características de alta precisão e gravação dinâmica contínua¹². O referido sistema tem sido amplamente empregado para registrar características in vitro de tensão tecidual de estruturas de cavidade com diâmetros de 60 μm a 10 mm. As características de aquecimento contínuo da plataforma do micrografo do fio compensam em grande parte a estimulação do ambiente externo adverso. Enquanto isso, os constantes insumos da mistura de gás e os valores do pH permitem obter dados de tensão vascular mais precisos em um estado fisiológico semelhante¹³. No entanto, considerando a complexidade da localização anatômica das artérias coronárias de ratos (Figura 1), seu isolamento tem sido desconcertante e limitando a exploração do mecanismo de doenças cardiovasculares diversificadas e desenvolvimento de medicamentos. Portanto, o presente protocolo introduz em detalhes o processo de localização anatômica e separação da artéria coronária do rato, seguido da medição da tensão na plataforma do micrografo^{do fio 14}.

O protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Gestão da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Record nº 2021-11). Os ratos machos Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 semanas de idade) foram utilizados para o presente estudo. Os ratos eram mantidos em uma câmara animal e eram livres para beber e comer durante o experimento.

1. Preparação da solução

1. Prepare a solução fisiológica de sal (PSS) dissolvendo 118 mM de NaCl, 4,7 mM de K⁺, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de KH₂PO₄, 1,2 mM de MgCl₂∙6H₂O, 25 mM de NaHCO₃, 11 mM de D-glicose e 5 mM de HEPES (ver Tabela de Materiais).
2. Prepare a solução de sal K⁺ alta dissolvendo 58 mM de NaCl, 60 mM de K⁺, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de KH₂PO4, 1,2 mM de MgCl₂∙6H₂O, 25 mM de NaHCO₃, 11 mM de D-glicose e 5 mM de HEPES.
3. Saturar as duas soluções acima e bolha com um gás misto de 95% O₂ e 5% de CO₂. Enquanto isso, mantenha os valores de pH da solução entre 7,38 e 7,42 com 2 mM NaOH.
   NOTA: Para obter informações sobre a preparação da solução, consulte a referência¹⁵.

2. Dissecção da artéria coronária do rato

1. Anestesiar o rato por inalação de 2% de isoflurane. Confirme a anestesia profunda por beliscão do dedo do sol e, se necessário, administre anestésicos adicionais. Em seguida, abra imediatamente a cavidade torácica para expor o coração na mesa de operação portátil após um relatório publicado anteriormente¹².
2. Depois de dissociar e remover o coração, drene o sangue residual de todas as câmaras cardíacas apertando levemente com fórceps plásticos médicos. Coloque rapidamente o coração pré-processado em uma placa de Petri contendo 95% O₂ + 5% DE CO₂ Saturado PSS a 4 °C, tendo um valor de pH de 7,40.
3. Para identificar com precisão a posição anatômica das artérias coronárias, ajuste a postura do coração isolado sob o microscópio de luz de acordo com o diagrama esquemático (Figura 2A).
   NOTA: Na visão frontal, a aurícula direita e a artéria pulmonar estavam no canto superior esquerdo e superior direito, respectivamente.
   1. Corte as cavidades ventriculares esquerda e direita ao longo do septo interventricular da raiz da artéria pulmonar com tesoura cirúrgica e pinça (Figura 2B).
4. Para dissociar as artérias coronárias esquerda e direita do tecido miocárdio, dissecar o ventrículo direito sob um microscópio anatômico óptico para expor completamente o ramo da artéria coronária direita. Em seguida, identifique a posição da artéria coronária esquerda girando o tecido cardíaco 45° no sentido horário (Figura 2D).
5. Depois de remover o tecido miocárdio pegajoso circundante, discerna explicitamente as artérias coronárias pulsantes esquerda (cerca de 5 mm) e direita (cerca de 5 mm). Separe as artérias coronárias no meio imediatamente e mergulhe completamente no PSS a 4 °C. Adquira um anel arterial de cerca de 2 mm cortando verticalmente a artéria destacada com uma tesoura anatômica para registrar a tensão vascular sob diferentes estímulos (Figura 2E).

3. Suspensão e fixação do anel arterial

NOTA: Para obter detalhes sobre esta etapa, consulte a referência¹⁴.

1. Prepare dois fios de aço inoxidável de 2 cm (ver Tabela de Materiais) e pré-mergulhe na solução PSS de 4 °C saturada com 95% O₂ + 5% DE CO₂. Passe ambos os fios paralelamente através do anel arterial, juntamente com a direção do vaso sob um microscópio anatômico óptico e com fios de comprimento igual expostos em ambas as extremidades da cavidade vascular.
2. Fixar o anel arterial com a frente do fio de aço e para trás na banheira do micrografo do fio preenchido com PSS borbulhante com 95% O₂ + 5% CO₂. Gire o botão horizontal do parafuso para um espaçamento dianteiro e traseiro adequado para que os dois fios sejam horizontais e o anel arterial esteja em um estado natural de relaxamento.
3. Após a instalação do banho DMT no aparelho termostático, abra o software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) para garantir que o sinal de caminho correspondente seja registrado. Definir os seguintes parâmetros: calibração da ocular (mm/div): 0,36; pressão do alvo (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; tempo médio online: 2 s; tempo de atraso: 60 s. Os passos da fixação do anel arterial são mostrados na Figura 3.

4. Padronização da tensão vascular no anel arterial de rato

NOTA: Para diferentes amostras de cavidade, a tensão inicial ideal foi necessária para que os vasos mantivessem atividade excepcional in vitro. Para mais detalhes, consulte a referência¹⁵.

1. Alcance a tensão inicial ideal do anel arterial aplicando uma tensão razoável ao longo do diâmetro do vaso.
   NOTA: Com base no estudo anterior¹⁶, a tensão maximal induzida por agonista foi realizada no fator k valor de 0,90 com a tensão inicial de estiramento de 1,16 ± 0,04 mN/mm (valores de referência para diferentes amostras de vasos: k valor, 0,90-0,95; tensão inicial, 1,16-1,52 mN/mm).
2. Neste ponto, defina o valor de tensão vascular exibido como zero. Depois, aplique um estímulo de 3 mN de puxar ao anel arterial girando o eixo espiral do banho.
3. Após a incubação por 1 h no tampão PSS saturado de oxigênio a 37 °C, pH 7.40, defina o valor da tensão para 0 mN novamente no painel de controle de tensão do micrografo do fio. O processo de configuração da tensão inicial do anel arterial é mostrado na Figura 4.

5. Detecção de reatividade do anel da artéria coronária

1. Realize a atividade contratil do anel da artéria coronária com a técnica de miógrafo^{de arame 14}, e valide em três operações separadas, estimulando com 60 mM de solução K⁺ por 10 min cada.
2. Após cada estimulação, lave o banho com PSS saturado de oxigênio até que o tom vascular retorne ao seu estado inicial.
   NOTA: Somente quando a flutuação de tensão das três medidas paralelas foi inferior a 10%, e a amplitude de cada contração foi maior que 1 mN/mm, anéis arteriais qualificados e altamente ativos poderiam ser usados para outros experimentos. A verificação de atividade do anel coronário de rato é mostrada na Figura 5.

6. Tratamento pós-cirúrgico

1. Após a cirurgia, eutanásia os animais seguindo protocolos institucionalmente aprovados.
   NOTA: Para o presente estudo, os animais foram eutanizados por inalação de excesso de isoflurano.

Posicionados anatomicamente, as artérias coronárias de ratos distribuídas e escondidas profundamente no tecido miocárdio não foram facilmente reconhecidas. Comparando-se as artérias coronárias de humanos (Figura 1A) e ratos (Figura 1B), a separação rápida e precisa das artérias coronárias de ratos foi conduzida de acordo com o processo de amostragem na Figura 2. Depois de localizar precisamente a aurícula direita, artéria pulmonar e ápice da frente sob um microscópio óptico, o miocárdio foi dissecado ao longo da linha preta sólida mostrada na Figura 2A. Cerca de 5 mm do ramo interventricular da artéria coronária foi claramente exposto à nossa visão. Após uma fina separação do miocárdio pegajoso em torno da artéria septal ventricular, um fio de 2 cm foi usado para atravessar uma alça de 2 mm da artéria coronária na direção do alinhamento vascular. Instantaneamente, o anel coronário de 2 mm foi então fixado no banho DMT, como mostrado na Figura 3. Depois que uma tensão inicial de 3 mN foi aplicada ao anel arterial (Figura 4), sua tensão excedeu mais de 2 mN aplicando 60 mM K+ em paralelo três vezes (Figura 5). Assim, os procedimentos acima resultaram em um anel coronário isolado com excelente atividade fisiológica.

Os acumulados K+ (20, 28, 39, 55, 77 e 108 mM) ou U46619 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 e 1 μM) foram adicionados ao banho de DMT 620M, resultando em um aumento dependente da concentração no tom vascular vitro. A próxima concentração de K+ ou U46619 (um agonista receptor thromboxane A2 (TP)15 foi adicionada quando o efeito vasoconstrição atingiu um platô. Os resultados experimentais são mostrados na Figura 6A,B. Para anéis coronários isolados constritos por K+ (60 mM) e U46619 (0,3 μM), a apigenina de droga de teste (1, 3, 10, 30 e 100 μM) causou vasodilatação de forma surpreendentemente dependente da concentração (Figura 6C).

Figura 1: Desenhos à mão livre de artérias coronárias humanas e de ratos. (A) apresenta as características da distribuição superficial das artérias coronárias esquerda e direita da visão frontal do coração humano e é facilmente reconhecida a olho nu. (B) demonstra as artérias coronárias esquerda e direita do rato profundas no miocárdio e seu septo interventricular ramificado. Abreviaturas: RCA = artéria coronária direita; LCA = artéria coronária esquerda; ISB = ramo de septo interventricular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diagrama da separação da artéria coronária em ratos. (A) A aurícula direita, artéria pulmonar, ápice e linha anatômica do coração de rato foram observadas a partir da vista frontal sob um microscópio leve. (B) Os lúmens ventriculares esquerdo e direito foram incisados ao longo do septo a partir da raiz da artéria pulmonar. (C) Localização anatômica das artérias coronárias esquerda e direita e seu ramo septo interventricular. (D) Um anel de 2 mm da artéria. (E) O anel arterial é fixado por fio ao longo da direção do vaso. Abreviaturas: RA = aurículo direito; PA = artéria pulmonar; RCA = artéria coronária direita; ISB = ramo de septo interventricular; LCA = artéria coronária esquerda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Um esquema do procedimento de montagem arterial. O anel arterial com fio foi transferido para (A) e fixado no banho DMT (B).. O fio de aço foi fixado e aparafusado no sentido horário para a parte superior esquerda (C) e inferior esquerdo (D). (E) As mandíbulas separadas foram aparafusadas para dar espaço para permitir que o segundo fio passasse pelo anel arterial. (F) O segundo fio era paralelo através do anel arterial. O fio de aço foi fixado e aparafusado no sentido horário para a direita superior (G) e inferior direito (H). (I) As mandíbulas separadas estavam vagamente parafusadas para deixar o anel arterial em seu estado natural. As linhas verdes representam os fios, e os cilindros laranja representam anel arterial isolado de 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Procedimento de normalização do anel arterial. Depois que a tensão do anel arterial isolado fixo voltou a 0 mN, uma força de tração de 3 mN foi aplicada no anel arterial ao mesmo tempo. Após 5 min, a tensão vascular diminuiu para 2,5 mN. Ao aumentar a tensão para 3 mN e mantê-la estável por 5 minutos, a tensão do anel da artéria coronária foi inicializada para 0 mN e repousava por 1h para estudos subsequentes sobre tensão vascular de diferentes estímulos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: O teste de reatividade vascular. Três aplicações de 60 mM K+ estimularam a tensão do anel isolado da artéria coronária a mais de 2 mN e as três medidas foram inferiores a 10%, sugerindo uma atividade vascular superior. Após cada estimulação, o banho foi suavemente lavado com uma solução de PSS saturada de oxigênio de 37 °C até que a tensão fosse de 0 mN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Rastreador representativo da contração de dose cumulativa da artéria coronária de rato via K+ ou U46619. À medida que a dose de K+ (A) e U46619 (B) aumentava, a força aumentava a dose dependente. (C) refere-se ao efeito relaxante da apigenina em anel arterial contratado por 60 mM K+- e 0,3 μM U46619 de forma dependente da concentração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.