Method Article

Isolamento e processamento de adipócitos brancos murinos para análises de transcriptoma e epigenoma

DOI:

10.3791/64128

⸱

June 16th, 2022

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1Van Andel Institute, 2Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 3Department of General and Visceral Surgery, Medical Center-University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo resume um método universal para isolar, purificar e processar a montante de adipócitos brancos murinos otimizados para sequenciamento de RNA total a jusante, extração de núcleos por SONication (NEXSON) e ChIP-seq.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A obesidade é uma doença complexa influenciada pela genética, epigenética, meio ambiente e suas interações. Os adipócitos maduros representam o principal tipo de célula no tecido adiposo branco. Compreender como os adipócitos funcionam e respondem a sinais (epi)genéticos e ambientais é essencial para identificar a(s) causa(s) da obesidade. O RNA e a cromatina foram previamente isolados de adipócitos usando digestão enzimática. Além disso, protocolos foram desenvolvidos para isolamento nuclear, onde a purificação é obtida por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de repórteres transgênicos específicos para adipócitos. Um dos maiores desafios para alcançar alto rendimento e qualidade durante esses protocolos é a quantidade substancial de lipídios contidos no tecido adiposo. O presente protocolo descreve um procedimento otimizado para isolar adipócitos maduros que aproveita o heptano para separar lipídios dos alvos de interesse (RNA/cromatina). O RNA resultante tem alta integridade e gera resultados de RNA-seq de alta qualidade. Da mesma forma, o procedimento melhora a taxa de rendimento de núcleos e gera resultados reprodutíveis de ChIP-seq entre as amostras. Portanto, o estudo atual fornece um protocolo de isolamento de adipócitos murinos confiável e universal, adequado para estudos de transcriptoma e epigenoma do genoma inteiro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A obesidade é tipicamente entendida como uma doença de acúmulo excessivo de gordura que contribui para um risco aumentado de diabetes tipo 2, doença cardiometabólica e várias formas de câncer 1,2,3. Embora a compreensão atual da obesidade esteja fortemente enraizada na genética (de estudos em humanos e roedores), cerca de 30% a 70% da predisposição a doenças metabólicas é de origem não genética 4,5,6,7,8 e permanece mal definida.

O tecido adiposo desempenha um papel crítico na obesidade e outras doenças metabólicas 9,10. O tecido adiposo compreende adipócitos maduros e a fração vascular estromal, incluindo pré-adipócitos, células endoteliais e células imunes. Ainda não está claro como cada tipo de célula contribui para a obesidade e como a desregulação dos adipócitos contribui para a obesidade. Protocolos de isolamento e purificação reprodutíveis e eficazes para estudos de epigenoma de adipócitos maduros são de interesse para o campo.

Os adipócitos maduros foram isolados há muito tempo para análises de expressão gênica11 e estudos de epigenoma12,13. Existem duas estratégias principais para isolar os adipócitos. A primeira é usar a digestão enzimática para separar os adipócitos maduros do resto dos tipos celulares na fração vascular estromal11,14. A segunda é dounce o tecido adiposo para liberar núcleos intactos e, em seguida, recuperar os núcleos com base em um repórter fluorescente por classificação celular ativada por fluorescência (FACS)12,13, o que requer modelos repórter transgênicos especializados. O desafio técnico em cada caso é que os adipócitos maduros contêm altas concentrações de lipídios (Figura 1), o que reduz a qualidade e/ou o rendimento do RNA total15,16 e núcleos17. Aqui, um procedimento de digestão enzimática otimizado é descrito para isolar adipócitos maduros, no qual a vantagem do heptano é dissolver e remover lipídios de forma rápida e eficiente18 antes da extração do RNA ou das etapas de isolamento dos núcleos por Extração de Núcleos por SONication (NEXSON) 19 . O protocolo garante excelente recuperação e qualidade do RNA total para estudos de todo o genoma e melhora significativamente o rendimento de núcleos intactos para ChIP-seq reprodutível.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), número do protocolo: 18-10-028. Camundongos C57BL/6J machos com 12 semanas de idade foram eutanasiados com CO2 e dissecados para coletar as bolsas de gordura do tecido adiposo branco epididimal (eWAT).

1. Isolamento de adipócitos

  1. Preparar o tampão de digestão (quadro 1) e aquecer a 37 °C em banho-maria.
  2. Coloque a almofada de gordura do tecido adiposo branco epididimal (eWAT) em uma placa de Petri. Corte o tecido em pedaços pequenos (5 mm x 5 mm) usando uma pinça e um bisturi em 5 mL de DMEM.
    NOTA: É preferível uma placa de Petri que não contenha um revestimento de adesão celular. Também é importante segurar a almofada de gordura suavemente para evitar danificar as células. Quanto mais o tecido adiposo é manuseado, mais o rendimento fica comprometido. Um método de bisturi / fórceps é preferível a cortar as almofadas de gordura apenas com tesoura ou fórceps, pois podem danificar os adipócitos.
  3. Drene o excesso de DMEM sem perturbar os detritos do tecido.
    NOTA: Não retire os detritos de tecido da superfície da placa de Petri.
  4. Adicione 5 mL de tampão de digestão à placa de Petri, agite para liberar fragmentos de tecido da placa e despeje todo o conteúdo em um tubo de centrífuga de 50 mL. Repita o processo até que todos os fragmentos de tecido sejam transferidos para o tubo da centrífuga.
  5. Adicione o tampão de digestão restante ao tubo da centrífuga para que o volume final seja de ~ 20 mL.
  6. Incubar os fragmentos de tecido em banho-maria agitado a 37 °C a 100 rpm durante 20-30 min ou até que os fragmentos de tecido sejam inferiores a 1 mm x 1 mm.
  7. Adicione 0,4 mL de EDTA 0,5 M e 0,2 mL de EGTA 0,5 M ao tubo da centrífuga e continue agitando a 37 °C por 10 min.
  8. Transfira a suspensão celular com uma pipeta de 10 mL através de um filtro de matriz fina (420 μm, consulte a Tabela de Materiais) em cima de outro tubo de centrífuga de 50 mL para remover o tecido não digerido.
  9. Centrifugue o tubo de centrífuga de 50 mL a 200 x g por 5 min em temperatura ambiente para separar os adipócitos puros (flutuando na parte superior) da fração vascular estromal (pellet na parte inferior) (Figura 2A).
  10. Despeje a camada de adipócitos flutuante em um novo tubo de 50 mL, tomando cuidado para não romper o pellet.
    NOTA: Evite usar pontas de pipeta para transferir adipócitos flutuantes, pois eles podem grudar na parede da ponta da pipeta (reduzindo o rendimento). Algum tampão de digestão será transferido para o novo tubo; Use uma seringa e uma agulha para remover o tampão de digestão residual sob a camada de adipócitos.
  11. Use os adipócitos purificados para extração total de RNA (etapa 2.) e / ou ChIP-seq (etapa 3. e etapa 4.) imediatamente.
    NOTA: O usuário pode decidir usar todo o extrato de adipócitos para a etapa 2. ou etapa 3., dependendo do objetivo da pesquisa. O usuário também pode dividir todo o extrato de adipócitos em duas porções e continuar a etapa 2. e passo 3. em paralelo para obter resultados de análise das amostras biologicamente idênticas.

2. Extração total de RNA

NOTA: Execute esta etapa em uma capa química.

  1. Adicionar reagente de isolamento de ARN (1 ml) (ver Tabela de Materiais) aos adipócitos purificados no tubo de centrifugação de 50 ml (passo 1.11.).
  2. Pipetar para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 1 mL para dissolver completamente os adipócitos no reagente de isolamento de RNA e transferir para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
  3. Incube o tubo por 15 min em temperatura ambiente.
  4. Adicione 0,5 mL de heptano no tubo da centrífuga e vórtice em velocidade máxima por 30 s.
    NOTA: Os lipídios se dissolverão no heptano ( Figura 2B ).
  5. Centrifugue o tubo a 1.000 x g por 10 min a 4 °C.
  6. Adquira a camada inferior do reagente de isolamento de RNA com uma seringa e agulha de 30 G e transfira para um novo tubo de 1,5 mL.
  7. Adicione 0,1 mL de 1bromo-3cloropropano (consulte a Tabela de Materiais) ao extrato do reagente de isolamento de RNA e vórtice em velocidade máxima por 30 s. Incube o tubo em temperatura ambiente por 15 min.
  8. Centrifugue o tubo a 12.000 x g por 15 min a 4 °C. Use uma pipeta para coletar a fase aquosa superior e transferi-la para um novo tubo.
  9. Adicione 0,5 mL de isopropanol e incube por 10 min a 4 °C. Centrifugue o tubo a 12.000 x g por 10 min a 4 °C.
    NOTA: O RNA será precipitado como um pellet no fundo do tubo.
  10. Use uma pipeta para remover o sobrenadante, tomando cuidado para evitar tocar no pellet.
  11. Adicione 1 mL de EtOH a 75% e vortex em velocidade máxima brevemente.
  12. Centrifugue o tubo a 7.500 x g por 5 min a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma ponta de pipeta. Não perturbe o pellet.
  13. Seque o pellet ao ar em temperatura ambiente por 10 min ou até que o pellet fique claro/transparente.
  14. Dissolver o sedimento em 50 μL de água isenta de nuclease.

3. Fixação de adipócitos para ChIP-seq

NOTA: Execute a etapa 3. em um capuz químico.

  1. Adicione 0,3 mL de EDTA 0,5 M, 0,2 mL de EGTA 0,5 M, 14,8 mL de DMEM e 10 mL de heptano no tubo de 50 mL contendo adipócitos isolados (etapa 1.11.).
  2. Adicione 0,7 mL de formaldeído a 16% (0,7% final) e gire em um rotador de tubo (consulte a Tabela de Materiais) a 10 rpm por 5 min em temperatura ambiente.
    NOTA: Configure um cronômetro e conte por 5 min. Se estiver processando várias amostras, adicione formaldeído sequencialmente em intervalos de 30 s para permitir um tempo de fixação preciso e comparável em todas as amostras.
  3. Adicione 1,78 mL de glicina 1,25 M (0,125 M final) e misture no rotador a 10 rpm por não mais que 5 min em temperatura ambiente.
    NOTA: O formaldeído permanece ativo mesmo após a adição de glicina. Portanto, é importante separar as camadas por centrifugação (etapa 3.4.) imediatamente após a etapa de incubação de 5 minutos. Se houver mais de uma amostra, adicione glicina a cada amostra para interromper a reação sequencialmente em intervalos de tempo de 30 s.
  4. Em seguida, centrifugue a 200 x g por 5 min em temperatura ambiente.
    NOTA: Deve haver três camadas líquidas óbvias e discretas (Figura 2C). A camada branca do meio contém os adipócitos fixos.
  5. Use uma ponta de pipeta de 1 mL para transferir a camada de adipócitos (branco) para um tubo de centrífuga novo de 15 mL, minimizando a quantidade de fixador e heptano transportado para o novo tubo.
  6. Encha o tubo com 10 mL (temperatura ambiente) de DMEM suplementado com o comprimido de coquetel inibidor de protease (PIC, consulte a Tabela de Materiais). Misture bem por inversão.
  7. Centrifugue o tubo a ≤200 x g por 5 min em temperatura ambiente. Mantenha a força de centrifugação em 100 x g para minimizar a explosão da célula.
  8. Repita as etapas 3.5.-3.7. 1x antes de avançar para a etapa 3.9.
  9. Use uma ponta de pipeta de 1 mL para transferir a camada de adipócitos (branco) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ou 2 mL.
  10. Centrifugue o tubo a 100-200 x g por 5 min em temperatura ambiente e use uma ponta de pipeta de 1 ml para remover o heptano (camada superior) e o DMEM (camada inferior).
  11. Armazene os adipócitos fixos a -80 ° C por até 6 meses até o uso.

4. Extração de núcleos e cisalhamento da cromatina

NOTA: Este procedimento é adaptado de Arrigoni et al.19.

  1. Ligue o sonicador (consulte a Tabela de Materiais) e ajuste a potência de pico para 75 W, o fator de serviço para 2% e 200 ciclos/explosão, com o resfriador de banho-maria ajustado para 20 °C.
  2. Adicione o coquetel inibidor de protease (PIC) ao tampão de laboratório Farnham e ao tampão de cisalhamento (Tabela 1).
    NOTA: Por favor, verifique mais alguns sonicadores e parâmetros sugeridos em Arrigoni et al.19.
  3. Ressuspenda os adipócitos fixos (da etapa 3.) com 750-800 μL de tampão de laboratório Farnham gelado em um tubo de sonicação de 1 mL (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: Recomenda-se não encher o tubo até sua capacidade total. Caso contrário, os adipócitos flutuarão para a parte superior do tubo, o que reduz a eficiência da sonicação.
  4. Sonicate a amostra por 2,5 min.
    NOTA: Verifique a extração de núcleos em um microscópio de contraste de fase para determinar se é necessária sonicação adicional. Os núcleos devem ser redondos e intactos, conforme mostrado na Figura 2D.
  5. Antes de prosseguir, defina a potência de pico do sonicador para 140 W, o fator de serviço para 5% e 200 ciclos/rajada, com o resfriador de banho-maria ajustado para 4 °C.
  6. Use uma pipeta para transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue o tubo a 1.000 x g por 5 min a 4 °C.
  7. Remova cuidadosamente o sobrenadante do pellet (núcleos) e guarde o pellet.
  8. Lave o pellet com 1 mL de tampão de laboratório Farnham no gelo.
  9. Centrifugue o tubo a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C, use uma pipeta para remover o sobrenadante e guarde o pellet.
  10. Repita as etapas 4.8.-4.9. 1x antes de avançar para a etapa 4.11.
    NOTA: Os núcleos isolados e lavados podem ser armazenados a -80 °C por 3 meses até uso posterior.
  11. Ressuspenda os núcleos isolados em 1 mL de tampão de cisalhamento e transfira-os para um novo tubo de sonicação de 1 mL. Certifique-se de que não haja bolhas no tubo.
  12. Sonicar os núcleos no sonicador com uma potência de pico de 140 W, um fator de trabalho de 5% e 200 ciclos/explosão por 12 min para cisalhar a cromatina a 4 °C.
  13. Transfira o lisado para um tubo de microfuga de 1,5 mL.
    NOTA: A cromatina cisalhada é liberada dos núcleos e está contida no tampão (lisado).
  14. Centrifugue o tubo a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C para pellet detritos insolúveis. Transfira o sobrenadante (cromatina) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  15. A cromatina cisalhada pode ser armazenada a 4 ° C por 10 dias ou a -80 ° C por 3 meses até uso posterior.
    NOTA: Verificação de qualidade adicional: Alíquota de 25 μL da cromatina cisalhada para reticulação e remover o RNA com uma RNase livre de DNase seguindo o relatório publicado anteriormente19. Para o presente estudo, o DNA resultante foi purificado com um kit de purificação de DNA de acordo com as instruções do fabricante, o DNA foi quantificado com um kit de quantificação de DNA no instrumento de quantificação de DNA e o tamanho do fragmento foi avaliado pelo instrumento de eletroforese automatizado (ver Tabela de Materiais). O tamanho da cromatina cisalhada deve estar na faixa de 100-800 pb. O restante da cromatina de cisalhamento pode prosseguir para a aplicação ChIP-Seq a jusante.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os adipócitos foram isolados de seis bolsas de gordura, a extração de RNA à base de heptano foi realizada (etapa 2.) e o RNA resultante foi analisado no instrumento de eletroforese automatizada. O número de integridade do RNA calculado (RIN) para todas as amostras foi >8 (Figura 3A), indicando uma preparação de RNA de alta qualidade e reprodutível. O kit de preparação de RNA total foi então usado para preparar bibliotecas de RNA, e cada amostra foi sequenciada no sequenciador de próxima geração para atingir uma profundidade de leitura de ≥40 milhões de leituras. O escore Phred para todas as amostras (Figura 3B) e por sequência (Figura 3C) foi de ≥30, indicativo de sequências de DNA de alta qualidade20. Assim, a remoção de heptano suporta o isolamento de RNA de alto rendimento e alta qualidade adequado para sequenciamento de RNA.

Na etapa de fixação do formaldeído, também foram realizadas três preparações de isolamento nuclear contendo heptano e uma preparação controle sem heptano. A cromatina cisalhada foi então analisada no instrumento de eletroforese automatizado. Em ambos os casos, a cromatina foi cortada para uma faixa de tamanho de 100-800 pb (Figura 4A), ideal para procedimentos ChIP-seq a jusante19. É importante ressaltar que ~ 5 vezes mais cromatina foi obtida das amostras tratadas com heptano (11,5 ng / μL, 9,42 ng / μL e 9,6 ng / μL) em relação às amostras não tratadas (2,2 ng / μL). H3K4me3 e H3K27me3 ChIP-seq foram realizados seguindo Arrigoni et al.19. Conforme mostrado na Figura 4B, os traços de sinal de três amostras independentes tratadas com heptano foram comparáveis ao rastreamento da amostra não tratada com heptano para ambas as marcas de histonas. O tratamento com heptano não interfere na qualidade do ChIP-seq, mas melhora significativamente o rendimento dos núcleos (e da cromatina cisalhada).

figure-results-1
Figura 1: Adipócitos isolados. Os adipócitos isolados foram corados com DAPI (azul) para corar o núcleo e BODIPY (verde) para os lipídios. As gotículas lipídicas citosólicas compreendem até 95% do volume dos adipócitos e representam um desafio técnico para alcançar altos rendimentos durante as extrações de RNA e cromatina. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Fluxo esquemático do isolamento de adipócitos para análise de transcriptoma e epigenoma. Todo o fluxo de trabalho é representado, desde o isolamento dos adipócitos até a aplicação do transcriptoma ou epigenoma. As principais etapas e os resultados representativos são mostrados. (A) Os adipócitos isolados flutuam na camada superior, separando-se da fração vascular estromal como um pellet no fundo do tubo. (B) O uso de heptano para remover lipídios antes da extração de RNA com reagente de isolamento de RNA. (C) O uso de heptano para remover lipídios durante a fixação de adipócitos. (D) A imagem representativa dos núcleos de adipócitos isolados deve estar intacta e redonda. Barra de escala = 20 μm. O esquema foi criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Eletroferograma representativo dos escores de integridade e qualidade do RNA após RNA-seq. (A) As amostras 1-6 representam seis réplicas de adipócitos tratados com heptano, e sua análise de integridade do RNA foi executada no instrumento de eletroforese automatizado. O número de integridade do RNA (RIN) foi baseado nas razões de RNA ribossômico 18S e 28S e representa a qualidade do RNA. Escala de 1 (muito degradada) a 10 (a menos degradada). (B, C) O escore de qualidade de leitura do sequenciamento foi determinado pela análise multiQC (B) para o escore de qualidade médio nas bases (C) e para o escore de qualidade por sequência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Eletroferograma representativo da cromatina cisalhada e picos de enriquecimento de ChIP-seq. (A) Perfis representativos do instrumento de eletroforese automatizado mostrando as distribuições de tamanho da cromatina do controle (amostra 1, canto superior esquerdo) e as preparações de cromatina de adipócitos tratadas com heptano (amostras 2, 5 e 8, canto superior direito e dois inferiores). As concentrações de cromatina nas preparações finais são indicadas no canto superior esquerdo de cada imagem. (B) Captura de tela do navegador do genoma feita usando o Integrative Genomics Viewer (IGV). A parte superior do gráfico mostra perfis de H3K4me3 ChIP-seq para três amostras tratadas com heptano (vermelho) e um controle (azul). O painel inferior mostra o mesmo para o ChIP-seq de H3K27me3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

BufferComposição
Tampão de digestão (para 3000 mg ou menos de almofada de gordura / 20 mL)20 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)
0,3 g de BSA livre de ácidos graxos
0,1 g de colagenase tipo 2
Tampão de laboratório FarnhamTUBOS DE 5 mM (pH 8)
85 mM KCl
0,5% IGEPAL
Amortecedor de cisalhamento10 mM Tris-HCl pH 8
0,1% SDS
1 mM EDTA

Tabela 1: Composição dos diferentes tampões utilizados no presente estudo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo de isolamento de adipócitos aqui apresentado é baseado em métodos de digestão enzimática bem aceitos11,14 para separar os adipócitos maduros (flutuantes) da fração vascular estromal remanescente do tecido adiposo branco. Ele fornece uma abordagem direta e universal para purificar adipócitos maduros em qualquer modelo de camundongo. Conforme demonstrado acima, o protocolo é adequado para uso downstream para análises de transcriptoma completo e ChIP-seq. Ele fornece rendimento suficiente para gerar vários perfis epigenômicos (por exemplo, várias modificações de histonas mais RNA-seq) a partir da mesma almofada de gordura individual.

Para garantir os altos rendimentos que permitem a preparação de tais dados epigenoma correspondentes, uma etapa crítica é usar heptano para dissolver lipídios de adipócitos intactos e de adipócitos que lisam durante o processo. Em nossa experiência, essa etapa aumenta substancialmente a reprodutibilidade e o rendimento, evitando que o RNA e os núcleos sejam perdidos para a camada lipídica. A rotação contínua dos tubos contendo adipócitos submetidos à fixação é igualmente importante, pois aumenta a homogeneidade com que os lipídios são removidos dos adipócitos. Em vez do tampão fixador de formaldeído a 1% relatado em grande parte da literatura ChIP-seq21,22, verificou-se que a redução da concentração para 0,7% de formaldeído é necessária para evitar a fixação excessiva. O tempo de cisalhamento da cromatina também foi otimizado para 12 min para atingir uma faixa de tamanho ideal de cromatina (100-800 pb) para ChIP-seq.

O protocolo foi otimizado para estudos de transcriptoma e epigenoma em massa. O protocolo atual ainda tem suas próprias limitações para aplicações de transcriptoma de célula única e epigenoma. Considerando a heterogeneidade celular relatada no campo da adiposidade23,24, esse método de isolamento pode ser desenvolvido para ser adaptado para ensaios de célula única. Em tais contextos, marcadores restritos a adipócitos, como boro-dipirrometeno (BODIPY)25 e perilipina-1 (PLIN1)26, ASC-127 ou marcadores de núcleos específicos de adipócitos, podem ser valiosos para permitir a quantificação de parâmetros celulares adicionais, funcionais e relevantes28. Além da aplicação a estudos genômicos, esse protocolo também pode melhorar os estudos proteômicos de adipócitos, que têm um obstáculo extra devido ao alto teor de lipídios nos adipócitos29.

Este protocolo também pode ser usado para extrair com sucesso núcleos de adipócitos humanos (dados não mostrados), estendendo sua aplicação à pesquisa sobre obesidade humana.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estamos em dívida com a imagem óptica, sequenciamento, núcleo de bioinformática e pessoal do MPI-IE. Este trabalho foi apoiado por financiamento do MPG, do Instituto de Pesquisa Van Andel, da pesquisa Horizon 2020 da União Europeia, do NIH (R01HG012444 e R21HG011964), do acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 675610 e do Ministério Federal de Educação e Pesquisa sob o número do projeto 01KU1216 (Deutsches Epigenom Programm, DEEP).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solução de formaldeído a 16% (p / v). ThermoFisher sem metanolSCIENTIFIC28908
1-bromo-3-cloropropano SIGMAB9673
5 M NaClinvitrogenAM9759
Instrumento de eletroforese automatizado (2100 Bioanalyzer Instrument)Agilent TechnologiesG2939BA
BODIPY ThermoFisher SCIENTIFICD3922
Colagenase Tipo 2Worthington Biochemical Corp.43D14184B
Coquetel de inibidores de protease (PIC) completo, livre de EDTA Roche4693159001sem EDTA DAPI
 ThermoFisher SCIENTIFICD1306
DMEM (+ GlutaMAX) life technologies61965-026
kit de purificação de DNA (kit de purificação de PCR)Qiagen28104
(Fluorômetro Qubit 4)Fisher SCIENTIFICQ33238
(ensaio de alta sensibilidade de DNA)Agilent Technologies5067-4626
EDTAFisher chimicalE478-500
EGTAFisher chimicalO2783-100
EtOHPHARMCO111000200
Livre de ácidos graxos BSA SERVA11932.01Albumina bovina fração V, glicina liofilizada sem ácidos graxos
SIGMAG7126-100G
HeptanoSIGMAH2198-1L
Análise de RNA de alta sensibilidadeAgilent Technologies5067-1513
IgepalSIGMA18896-50ML
KClSIGMAP3911-25G
Filtro de matriz (420um)Tisch ScientificME17238
Sequenciador de Próxima Geração (HiSeq 3000 Sequencer) Illumina
Água sem nucleaseInvitrogen4387936
PIPESACROS organics5625-37-6
Proteinase K ThermoFisher SCIENTIFICEO0491
Reagente de isolamento de RNA (Trizol)ThermoFisher SCIENTIFIC15596026
RNase A, livre de DNase ThermoFisher SCIENTIFICEN0531
Rotator (Thermo Scientific Tube Revolver Rotator)ThermoFisher SCIENTIFIC88881001
SDS, Dodecil sulfato de sódioSIGMA8170341000
Tubo de sonicação (1 mL milliTUBE com fibra AFA)Covaris520135
Sonicator (Evolution Focused-ultra-sonicator (S220 ou E220))Covaris500217 ou 500239
Kit de Preparação Total de RNA ( Kit de Preparação Total de RNA Encalhado Illumina)Illumina20040525
Tris-HCl BiorreagentesFisher BP153-500
Instrumento de quantificação de DNA Kit de quantificação de DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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