Métodos imuno-histoquímicos são úteis na pesquisa de abelhas para detectar e avaliar o nível de apoptose e necrose no intestino médio e nas glândulas hipofaríngeas de abelhas adultas.
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Artigo de método
Noções Básicas de Histologia e Detecção de Morte Celular em Tecido de Abelhas Melíferas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) dentro da colmeia (enfermeiras e outras abelhas da colmeia) e fora da colmeia (forrageiras) estão expostas a mudanças climáticas e climáticas, vários pesticidas, patógenos e desnutrição, entrando principalmente pela boca e afetando principalmente os tratos digestivos das abelhas adultas. Para entender e prevenir os efeitos de tais estressores externos e internos nas abelhas, um método de pesquisa útil é o método imuno-histoquímico. Um protocolo básico é descrito para preparar o intestino médio (ventrículo) e as glândulas hipofaríngeas (HPGs) de abelhas adultas para análise histológica. Uma metodologia detalhada é descrita para avaliar o nível de dano celular e distinguir necrose de morte celular programada (apoptose) como um processo natural de regeneração tecidual. Os resultados do tratamento de abelhas adultas com ácido oxálico e pesticidas (inseticida e acaricida) e a determinação da morte celular no ventrículo e HPGs são apresentados. Os prós e contras da metodologia também são discutidos.
Introdução
As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) são, entre outros polinizadores silvestres, os mais importantes polinizadores das plantas agrícolas. Ao longo de milhares de anos, o ambiente em mudança influenciou as abelhas a adaptar sua morfologia, fisiologia, comportamento e tolerância a vários patógenos e parasitas. Portanto, as abelhas desenvolveram uma gama altamente diversificada de espécies e subespécies em todo o mundo1. Esses resultados são consistentes com achados anteriores, de que há variação genética na estrutura do trato digestivo da abelha, mas também sugerem que as alterações do intestino médio são devidas a fatores ambientais....
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Protocolo
1. Histologia básica para pesquisa de abelhas
- Dissecção do tecido das abelhas melíferas
NOTA: Para a dissecação de abelhas operárias, use um microscópio de dissecação com uma fonte de luz LED. A ampliação mais útil é ~20x.- Manipulação e dissecação
- Pegue cuidadosamente uma abelha operária com fórceps e coloque-a no gelo (ou no congelador a -20 °C) durante 2 minutos para imobilizá-la22. Prenda a abelha na placa de Petri diagonalmente através da porção superior das costas do tórax duas vezes, da esquerda para a direita e da direita para a esquerda.
- Despeje soro fisiológico de insetos para cob....
- Manipulação e dissecação
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Resultados
Detecção de morte celular no intestino médio
Abelhas operárias recém-surgidas (Apis mellifera carnica) do apiário experimental do Instituto Agrícola da Eslovênia em Liubliana foram tratadas individualmente com ácido oxálico (OA) a 3%23. O OA é frequentemente usado na apicultura para controle de destruidores de Varroa . Após o tratamento, as abelhas operárias (três de cada grupo) foram imobilizadas sobre gelo. O intestino médio foi dissecado e fixado em formali.......
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Discussão
Em organismos vivos, a morte celular é definida como apoptose ou necrose25 e pode ser acompanhada de autofagia26. A diferença entre células apoptóticas e necróticas é que a apoptose é uma forma de morte celular programada e aparece em células normais, enquanto a necrose ocorre devido a condições letais (por exemplo, acidente, doença)27,28. A apoptose pode ser detectada usando kits de ensaio baseados na técnica TUNEL.......
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Divulgações
O autor não tem conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradeço o apoio da Agência Eslovena de Investigação, subvenção n.º P4-133.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de peroxidase 2-Propanol | |||
| ApopTag (detecção de apoptose in situ da peroxidase ApopTag) | Sigma-Aldrich | S7100 | Ensaio B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Controles positivos incluídos no S7101 |
| Cobre | |||
| o sistema TUNEL Colorimétrico DeadEnd | Promega | G7360 | Ensaio A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Microscópio de dissecação (para dissecação de abelhas) | Zeiss | ||
| destilada | |||
| EnVision System kit de fosfatase alcalina | Dako | ||
| Eosin Y Solução | Sigma-Aldrich | ||
| álcool Etanol | 95% (ou menos puro), 90%, 80% | ||
| Meio de montagem Faramount, aquoso | Mesa | achatamento média de montagem | |
| Leica | HI1220 | ||
| Forceps (para dissecação de abelhas) | Ferramentas de ciência fina | 11294-00 | Padrão #4 |
| Formalina 10% | Formaldeído | ||
| Hematoxilina | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | Clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (para dissecação de abelhas) | Entosphinx | 44594 | Pinos de inseto em aço inoxidável - branco, tamanho 2 |
| ISCDDK, AP (Kit de Detecção de Morte Celular In Situ, Fosfatase Alcalina) | Ensaio | 11684809910 | Roche C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4Relógio de | |||
| laboratório | |||
| Microscópio de luz | Leica | ||
| Lâminas | A caixa com as lâminas deve ser preservada em um filme plástico para evitar poeira | ||
| Micrótomo | Leica | ||
| Estação modular de incorporação de tecidos | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldeído 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipetas | 1,5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| placa de Petri (para dissecação de abelhas) | Preenchido com silício de condensação (Xantopreno L azul e ativador líquido universal plus) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Solução de Ringers (para dissecação de abelhas) | 7,5 g de NaCL, 2,38 g de Na2HPO4, 2,72 g KH2PO4, 1 L de água destilada | ||
| Tesoura (para dissecação de abelhas) | Ferramentas de ciência fina | 1406-09, 14061-09 | Reta e curva, 9 cm |
| Ativador universal de líquido plus (para dissecação de abelhas) | Relojoeiro Kulzer | ||
| ' s (para dissecação de abelhas) | Ferramentas de ciência fina | 91100-12 | |
| Pincel | |||
| Leica | |||
| Xantoprene L azul (para dissecação de abelhas) | Kulzer |
Referências
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee.
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Reimpressões e permissões
