Um modelo experimental de infarto do miocárdio para estudar o reparo e remodelamento cardíaco em camundongos knockout

Resumo

Descrevemos aqui um modelo experimental de infarto do miocárdio, um procedimento de ecocardiografia para estudar o remodelamento e a função cardíaca e procedimentos para quantificar fibrose e hipertrofia em cortes corados com picrosirius vermelho e rodamina, bem como o tamanho do infarto e o índice de expansão em cortes corados com tricrômico de Masson.

Resumo

A doença cardiovascular é a causa de morte mais prevalente nos países ocidentais, sendo o infarto agudo do miocárdio (IM) a forma mais prevalente. Este artigo descreve um protocolo para estudar o papel da galectina 3 (Gal-3) na evolução temporal da cicatrização e remodelação cardíaca em um modelo animal experimental de IM.

Os procedimentos descritos incluem um modelo experimental de IM com ligadura coronária permanente em camundongos machos C57BL/6J (controle) e Gal-3 knockout (KO), um procedimento de ecocardiografia para estudar remodelamento cardíaco e função sistólica in vivo, uma avaliação histológica de fibrose miocárdica intersticial com cortes corados com lectina corados com picrosirius vermelho e conjugado com rodamina para estudar a hipertrofia de miócitos pela área de secção transversa (MCSA), e a quantificação do tamanho do infarto e remodelamento cardíaco (afinamento cicatricial, espessura do septo e índice de expansão) por planimetria em cortes corados com tricrômico de Masson e cloreto de trifenil tetrazólio. Gal-3 Camundongos KO com IM mostraram remodelamento cardíaco interrompido e um aumento na taxa de afinamento da cicatriz e no índice de expansão. No início do IM, a função miocárdica e o remodelamento cardíaco também foram gravemente afetados. Às 4 semanas após o IM, a evolução natural da fibrose em camundongos Gal-3 KO infartados também foi afetada.

Em resumo, o modelo experimental de IM é um modelo adequado para estudar a evolução temporal do reparo e remodelamento cardíaco em camundongos com deleção genética de Gal-3 e outros modelos animais. A falta de Gal-3 afeta a dinâmica do reparo cardíaco e interrompe a evolução do remodelamento cardíaco e da função após o infarto do miocárdio.

Introdução

O infarto do miocárdio (IAM) é a forma mais prevalente de doença cardiovascular. Após o IM, o miocárdio sofre alterações morfológicas e funcionais seriadas, incluindo a cicatrização da zona de infarto do IM, remodelamento ventricular (RV) e disfunção miocárdica¹. A cicatrização do IM é um processo dinâmico e bem orquestrado associado à infiltração inflamatória profunda que termina na formação de uma cicatriz fibrótica ^2,3. O modelo experimental de IM em camundongos é atualmente utilizado para estudar o remodelamento cardíaco em condições patológicas ^4,5, e o conhecimento do protocolo cirúrgico preciso é essencial para desenvolver um procedimento reprodutível e eficaz para induzir uma ligadura coronária permanente. Esse método é necessário para estudar a cicatrização do IM e sua relevância na evolução temporal do remodelamento ventricular esquerdo (RVE) e na disfunção cardíaca associada ao IM.

As galectinas são um grupo de lectinas que reconhecem carboidratos específicos em ligantes intracelulares, receptores de membrana e glicoproteínas extracelulares. A galectina 3 (Gal-3) é um membro dessa família que atua por meio do reconhecimento e reticulação de N- e O-glicanos em glicoconjugados na superfície celular, sendo amplamente expressa no sistema imunológico⁶. Estudos anteriores investigaram o papel da Gal-3 como regulador da inflamação e fibrose em doenças cardiovasculares 7,8,9,10,11,12. Como o direcionamento dos fatores regulatórios da inflamação durante a cicatrização é altamente relevante porque a inflamação pode afetar notavelmente a evolução do remodelamento, nosso objetivo foi descrever um protocolo para estudar a evolução temporal do remodelamento ventricular pós-IM e as etapas e métodos para determinar como a mutação genética de Gal-3 modifica a evolução temporal da cicatrização no IM e afeta o remodelamento cardíaco e a função em camundongos.

Protocolo

NOTA: Todos os experimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Pesquisa Animal da Universidade de Buenos Aires (CICUAL), em consonância com o Comitê do Conselho Nacional de Pesquisa (EUA) para a Atualização do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório¹³. Para os experimentos, use camundongos machos C57BL / 6J e Gal-3 KO da mesma idade (8-10 semanas de idade) pesando 30-35 g, que permitem uma melhor manipulação para cirurgia. Permita que os animais tenham acesso à água e comida ad libitum. Os camundongos Gal-3 KO foram criados em um fundo C57BL / 6J nas mesmas instalações de biorrecursos que os camundongos C57BL / 6J controle.

1. Área cirúrgica e instrumentos

1. Antes de iniciar a cirurgia, verifique se o ventilador está conectado a uma fonte de alimentação e funcionando corretamente. Confirme se há solução anestésica suficiente. Prepare a solução no dia da cirurgia, calculando o número de animais a serem usados.
2. Confirme se todos os instrumentos cirúrgicos estão esterilizados, incluindo tesouras de aço inoxidável, microtesouras, porta-agulhas para agulhas grandes e pequenas, afastadores, pinças curvas e extra afiadas, pinças serrilhadas e pinças de tecido. Limpe a área de trabalho com etanol 70%.
3. Certifique-se da disponibilidade de pequenas bolas de algodão, hissopos e gaze para cauterização imediata de qualquer hemorragia potencial.
4. Mantenha suturas de seda trançadas revestidas de silicone 10-0 a 7-0 prontas para ligadura da artéria coronária descendente esquerda (LDA), sutura de náilon para fechamento do tórax e fio de linho para fechamento da pele.

2. Anestesia e intubação

1. Pese os camundongos para determinar a dose de anestesia.
2. Pré-aqueça uma almofada de aquecimento cercada por uma base de isopor a 40 °C.
3. Anestesiar os camundongos com administração intramuscular de 0,1 mL / 10 g de peso corporal de uma solução contendo cetamina (65 mg / kg), xilazina (13 mg / kg) e acepromazina (1,5 mg / kg).
4. Uma vez que o mouse esteja anestesiado e antes de iniciar o procedimento cirúrgico, verifique a profundidade do anestésico induzindo um estímulo levemente doloroso, como pressionar os pés com os dedos. Se o animal responder ao estímulo, ajuste a profundidade do anestésico.
5. Coloque o rato em decúbito dorsal e prenda suas pernas na base de trabalho acima da almofada de aquecimento, colocando-o sob um microscópio estéreo binocular. Hiperestenda o pescoço com uma rosca que prende os dentes maxilares presos à base de trabalho.
6. Em seguida, para a parte de intubação, expor os anéis traqueais através de uma incisão mínima no pescoço e canalizá-los com um cateter intravenoso 20 G conectado a um ventilador de roedores (volume corrente: 250 mL/AVC) a uma frequência respiratória de 34-38 ciclos/min, conforme descrito anteriormente¹⁴.
7. Colocar o animal em decúbito lateral para realizar a toracotomia lateral esquerda no quarto ou quinto espaço intercostal. Faça uma incisão na pele do animal; Observe os músculos abaixo e espalhe-os cuidadosamente para separá-los da parede torácica para ver claramente o espaço intercostal. Neste ponto, certifique-se de que o animal esteja conectado corretamente ao ventilador; Em seguida, abra o espaço intercostal fazendo um furo com a pinça extra afiada.
   NOTA: O LDA deve ser identificável ao longo da parede do ventrículo esquerdo (VE) livre nos espaços intercostais mencionados acima.
8. Realize a pericardiectomia e identifique o LDA contrastando as artérias coronárias com as veias coronárias e a ramificação do LDA abaixo da aurícula esquerda. Em seguida, execute a ligadura do LDA usando o 8-0 fio de seda ~2 mm da borda da aurícula. Por fim, feche o tórax por camadas usando o fio de seda 6-0 - feche as costelas, garantindo que não haja pneumotórax em seu interior (faça isso com cuidado, forçando os pulmões a se expandirem com o ventilador) e aproxime-se dos músculos ou suture-os antes de fechar a pele.
9. Uma vez que a pele esteja fechada, desconecte lentamente o camundongo do ventilador em decúbito ventral e remova o tubo endotraqueal quando a frequência respiratória se recuperar. Deixe o animal se recuperar da anestesia em um ambiente silencioso e, de preferência, com temperatura ambiente estável a 27 °C.
10. Espere que os animais se recuperem da anestesia, comecem a mover seus membros e que sua frequência respiratória normal seja restaurada. Em seguida, aloje-os em gaiolas individuais até o final do protocolo.
11. Realizar o mesmo procedimento nos animais de controlo ou simulados, mas sem a ligadura do LDA.

3. Desenho do estudo

1. Para testar a evolução temporal da cicatrização e remodelação ventricular após o infarto do miocárdio, randomize os camundongos nos seguintes grupos:
   1. Para estudar a fase inicial da remodelação ventricular após 1 semana de evolução do IM, atribua os camundongos aos seguintes grupos: 1) C57 Sham (1 semana); 2) Gal-3 KO Sham (1 semana); 3) IM C57 (1 semana); 4) Gal-3 KO MI (1 semana).
   2. Para estudar a fase tardia da remodelação ventricular em 4 semanas de IM, atribua os camundongos aos seguintes grupos: 5) C57 Sham (4 semanas); 6) Gal-3 KO Sham (4 semanas); 7) IM C57 (4 semanas); 8) Gal-3 KO MI (4 semanas).

4. Ecocardiografia

NOTA: Para ecocardiogramas de camundongos, transdutores lineares acima de 10 MHz devem ser usados para visualização adequada dos diâmetros das paredes e tamanhos das cavidades. Este procedimento pode ser realizado sob anestesia com avertin intraperitoneal (IP) a 1,15 mL/kg ou em animais conscientes. No entanto, este último pode levar a resultados confusos em camundongos com infarto do miocárdio devido ao estresse e ansiedade causados pela manipulação.

1. Para anestesiar um rato, pegue-o, segure-o de costas para a palma da mão e vire-o para alcançar a superfície do abdômen. Nessa posição, injete a anestesia IP em um ângulo de 45° entre o animal e a agulha subcutânea.
2. Depois que o mouse estiver anestesiado, raspe o peito e coloque-o sobre uma almofada de aquecimento pré-aquecida na posição de decúbito dorsal. Para obter incidências paraesternais de eixo longo e eixo curto, mova o transdutor 90°. Uma vez obtida a visualização correta do eixo, coloque o cursor no nível do músculo papilar, pressione a tecla 2-D M-mode para capturar as imagens e use o software de análise de imagem para medir os seguintes parâmetros:
   1. Meça as dimensões do VE, incluindo a espessura da parede (LVWT), as áreas do VE na sístole (S) e na diástole (D) e a área diastólica do ventrículo esquerdo (LVDA) e a área sistólica do ventrículo esquerdo (LVSA) em pelo menos três batimentos.
   2. Além disso, calcule a função ventricular pela fração de ejeção (FE, %), a fração de encurtamento (SF, %) e a massa cardíaca (suponha um cubo não corrigido) usando a equação (1), a equação (2) e a equação (3), conforme descrito anteriormente¹⁵.
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      Massa do VE = 1,055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³) (3)
      Onde LVEDD é o diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo, LVESD é o diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo, IVST é a espessura intraventricular e PWT é a espessura da parede posterior.

5. Avaliação histológica

1. Durante a necropsia, extraia o coração do animal abrindo o tórax de um lado para o outro e cortando todas as estruturas que o cercam. Limpe o coágulo sanguíneo que está dentro das cavidades aplicando uma leve pressão usando papel de seda.
2. Colha e pese o coração em uma balança de precisão de laboratório. Mergulhe-o em formaldeído a 10% por pelo menos 72 h em temperatura ambiente. Corte o coração manualmente do ápice à base em fatias transversais de 1 mm de espessura usando uma lâmina e processe as fatias embedindo-as em parafina. Faça cortes em série nas seções embebidas em parafina de 5 μm de espessura com um micrótomo.
3. Coloque cada seção entre as lâminas e core-as com hematoxilina e eosina (H & E), tricrômico de Masson, seções coradas com lectina conjugadas com rodamina ou vermelho de Picrosirius^15,16.
   1. Usando um fotomicroscópio apropriado, tire imagens digitalizadas a 400x para quantificação de morfometria, fibrose e MCSA. Verifique se o microscópio está conectado a uma câmera digital e a um computador com software de análise de imagem. Para cada análise morfométrica, certifique-se de que as imagens estejam nas mesmas áreas, com um mínimo de 10 campos de alta potência a 400x por seção (septo, zona infartada e zona remota) e sem sobreposição dos campos.
      1. Para medir o MCSA, esteja ciente das posições dos miócitos cardíacos e conte apenas os miócitos que são cortados transversalmente e circundados por pelo menos três capilares próximos.
      2. Nas fatias manchadas de vermelho Picrosirius, identifique as áreas da cicatriz e do septo e visualize o colágeno intersticial em ambas as zonas. Carregue as imagens no software de análise e abra a guia de limite para destacar todas as áreas de colágeno positivas e negativas Para obter os dados, pressione a guia de medição e salve os resultados. Para o cálculo da porcentagem de colágeno por região, utilizar a equação (4), somar as zonas positivas para colágeno e dividi-las pelo tecido total, incluindo as áreas positivas para colágeno, conforme descrito em outro artigo^15,16.
         Colágeno (%) = área vermelha de Picrosirius/Área total do tecido (4)
      3. Quantifique o MCSA a partir das imagens digitalizadas obtidas das seções coradas com lectina conjugadas com rodamina das amostras embebidas em parafina. Para obter a imagem correta, use um software de análise de imagem para traçar os contornos vermelhos dos miócitos ao redor das membranas celulares. Selecione a guia de área , trace os contornos e pressione a função de guia de medição . Por fim, salve os resultados das áreas das células¹⁶.

6. Determinação quantitativa do tamanho do infarto e planimetria para avaliar o remodelamento cardíaco

1. Medir o tamanho do infarto do miocárdio, a espessura da parede e o comprimento das circunferências endocárdica e epicárdica usando planimetria das imagens histológicas dos cortes corados com tricrômico de Masson obtidas com um microscópio óptico (4x) e o software apropriado.
   1. Para a quantificação do tamanho do infarto, identifique a zona do infarto (azul) e a zona remota (vermelho). Traçar e medir o comprimento total da zona do infarto e da zona remota nos lados endocárdico e epicárdico. Calcule a média dos traçados endocárdico e epicárdico em porcentagem da circunferência total do VE¹⁷.
   2. Da mesma forma, meça a espessura da cicatriz (a média de cinco medidas equidistantes) e a espessura do septo (a média de três medidas equidistantes) em uma seção média do coração e use essas medidas para determinar a razão da espessura da cicatriz (equação [5]) e o índice de expansão (equação [6]¹⁸).
      NOTA: Todos os valores podem ser registrados em uma planilha.
      Razão da espessura da cicatriz = Espessura da cicatriz/Espessura do septo (5)
      Índice de expansão = (área da cavidade do VE/área total do VE) × (espessura do septo/espessura da cicatriz) (6)
      NOTA: Como o remodelamento pode modificar a expansão, resultando em subestimação ou superestimação do tamanho do infarto, pode ser necessário algum tempo para realizar um experimento piloto para medir o tamanho do infarto em 24 h, seguido de eutanásia. Neste caso, anestesiar o animal com a mesma solução anestésica IP utilizada para o procedimento de IM.
2. Coloque o animal em decúbito dorsal e intube-o conforme descrito anteriormente. Uma vez que o animal esteja anestesiado, faça uma incisão diagonal profunda que atinja a pele, músculos e ossos costais da apófise xifóide até a cavidade axilar.
3. Isole o arco aórtico, faça um pequeno orifício na aorta ascendente e introduza um cateter para perfundir o coração com o azul de Evan. Em seguida, remova manualmente o coração manchado do animal e corte-o do ápice até a base com uma lâmina afiada. Colocar as fatias de coração em cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 1% em tampão fosfato isotónico (pH 7,4) e incubar a 37 °C durante 30 ^min4 para confirmar que os animais são comparáveis em termos de tamanho de enfarte.

Resultados

Sobrevida e necropsia pós-infarto do miocárdio
Ao longo de 4 semanas de acompanhamento, 17% (4/23) dos camundongos C57 versus 40% (8/20) dos camundongos Gal-3 KO foram encontrados mortos. A necropsia foi realizada; os camundongos Gal-3 KO mortos mostraram corações maiores do que os camundongos C57 (Figura 1), e 38% dos camundongos C57 em comparação com 32% dos camundongos Gal-3 KO tinham coágulos torácicos macroscópicos diretamente associados à ...

Discussão

O modelo experimental de IM por ligadura permanente da artéria coronária é utilizado para estudar uma ampla variedade de mecanismos fisiopatológicos de reparo e remodelamento cardíaco5,14,17. Este artigo resume os diferentes métodos atualmente utilizados neste laboratório para estudar a evolução temporal do reparo cardíaco e seus efeitos no remodelamento ventricular^{pós-IM14,17<...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sutura de seda 8-0	Camundongos Ethicon
C57BL/6J	Departamento de Biorrecursos da Faculdade de Veterinária da Universidade de Buenos Aires, Argentina
Fórceps
Hardvard 386 respirador	Empresa
Almofada			mantém a temperatura do animal durante a cirurgia
Imagem Pro-Plus 6.0	Software de	Análise de Imagem
Ketamine	Retratores
Ventilador para Roedores Modelo 683	Tesoura	ventilador mecânico
Lupa estereoscópica	Máquina Arcano
Vivid 7 (General Electric Medical Systems, Horten, Noruega)	General Electric		Qualquer software de rastreamento pode ser utilizado com este protocolo
WGA no. RL-1022, Laboratórios de Vetores, Burlingame	Vector Laboratories
Xylazine	Pro-Ser

Hardvard de aquecimento Media Cybernetics BIOPUR Picrosirius vermelhos Trichrome Masson Holiday  de Harvard Apparatus