Isolamento de células endoteliais glomerulares de camundongos imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes

Summary

O artigo descreve o método de isolamento de células endoteliais glomerulares imortalizadas condicionalmente dos rins de camundongos transgênicos expressando o vírus símio termolábil 40 e mitocôndrias fotoativáveis,^{excisadas por PhAM}. Descrevemos o procedimento para isolamento de glomérulos de rins inteiros usando contas, etapas de digestão, semeadura e cultura de GECs-CD31 positivos.

Abstract

A disfunção das células endoteliais glomerulares (GEC) pode iniciar e contribuir para a quebra da barreira de filtração glomerular. O aumento do estresse oxidativo mitocondrial tem sido sugerido como um mecanismo que resulta em disfunção GEC na patogênese de algumas doenças glomerulares. Historicamente, o isolamento dos GECs dos modelos in vivo tem sido notoriamente desafiador devido às dificuldades em isolar culturas puras dos glomérulos. Os GECs têm requisitos complexos de crescimento in vitro e uma vida útil muito limitada. Aqui, descrevemos o procedimento de isolamento e cultura de GECs condicionalmente imortalizados com mitocôndrias fluorescentes, possibilitando o rastreamento de eventos de fissão e fusão mitocondriais. Os GECs foram isolados dos rins de um camundongo duplo transgênico expressando o TAg termolábil SV40 (do camundongo Immorto), promovendo condicionalmente a proliferação e suprimindo a diferenciação celular, e uma proteína fluorescente fotoconversível (Dendra2) em todas as mitocôndrias (do camundongo mitocôndrias fotoativáveis [PhAM^excised]). A linhagem celular estável gerada permite a diferenciação celular após a inativação do gene imortalizante SV40 TAg e a fotoativação de um subconjunto de mitocôndrias, causando uma mudança na fluorescência do verde para o vermelho. O uso de mitoDendra2-GECs permite imagens ao vivo dos eventos de distribuição, fusão e fissão das mitocôndrias fluorescentes sem corar as células.

Introduction

O glomérulo é crítico para a filtração sanguínea, restringindo a passagem de moléculas grandes através da barreira de filtração glomerular ^1,2. O glomérulo contém quatro tipos de células: células epiteliais parietais, podócitos (células epiteliais viscerais), células endoteliais glomerulares (GEC) e células mesangiais³. O endotélio glomerular é caracterizado por uma estrutura vascular única, de acordo com a presença de fenestras necessárias para grandes volumes de filtração⁴. A superfície apical do endotélio glomerular é coberta com uma camada de glicocálice carregada negativamente e uma camada chamada camada superficial endotelial que cria um espaço entre o endotélio e o sangue. Essa estrutura proporciona alta seletividade de carga, restringindo a passagem de moléculas carregadas negativamente, como a albumina, e prevenindo a adesão de leucócitos e plaquetas⁵.

Os GECs são muito sensíveis a alterações metabólicas, como a hiperglicemia associada ao meio diabético. De fato, o diabetes leva ao aumento da circulação de substâncias nocivas, à saturação das vias metabólicas da glicose e à perturbação do equilíbrio redox celular ^3,6. Além disso, o aumento das espécies reativas de oxigênio induz disfunção mitocondrial, o que afeta a função endotelial⁷.

O objetivo geral do protocolo atual é isolar células endoteliais glomerulares imortalizadas com características mitocondriais fluorescentes. De fato, a cultura celular de GECs primários tem um ciclo proliferativo limitado e senescência precoce⁸. Além disso, a presença de mitocôndrias fluorescentes ajuda a examinar eventos de fissão e fusão em resposta à hiperglicemia ou a qualquer outro tratamento. Como método alternativo, outros laboratórios utilizaram o h-TERT para imortalizar células in vitro⁹.

O método aqui descrito permite o isolamento de células endoteliais mitoDendra2 imortalizadas condicionalmente de animais de 4 a 6 semanas de idade (Figura 1). Este protocolo detalhado descreve o uso de camundongos transgênicos (H-2K b-tsA58) abrigando o vírus símio 40 grande antígeno tumoral (SV40 TAg) gene^10,11 para a geração de células termolábeis condicionalmente imortalizadas. O produto do gene tsA58 TAg é funcional à temperatura permissiva de 33 °C sob o controle do promotor de flanco induzível de 5' do gene H-2K^b do camundongo, que é aumentado acima dos níveis basais após a exposição ao interferon gama (IFNγ), mantendo, portanto, o fenótipo de proliferação condicional¹². O H-2K^b é rapidamente degradado à temperatura não permissiva de 37 °C na ausência de IFNγ, removendo a função imortalizante do tsA58Tag nas células e permitindo que as células desenvolvam um fenótipo mais diferenciado^13,14,15. O cruzamento opcional de camundongos transgênicos H-2Kb-tsA58 com camundongos PhAM, que expressam uma Dendra2-verde específica para mitocôndrias (subunidade VIII da citocromo c oxidase), permite a detecção ao vivo de mitocôndrias fluorescentes¹⁶. A fluorescência verde Dendra2 muda para fluorescência vermelha após a exposição a um laser de 405 nm¹⁶. Quando as mitocôndrias se fundem após a fotocomutação, formam formas alongadas que aparecem amarelas pela troca de material verde e amarelo ou aparecem vermelhas quando sofrem fissão ^7,17. Os mitoDendra2-GECs são uma ótima ferramenta para estudar as respostas celulares das mitocôndrias GEC a diferentes estímulos.

Protocol

Todos os procedimentos animais descritos aqui foram aprovados pela IACUC na Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai. Usamos três camundongos machos (camundongos transgênicos H-2Kb-tsA58 com mitocôndrias fotoativáveis [PhAM]) comprados do laboratório Jackson e mantidos em uma dieta normal de ração.

1. Condições de trabalho e preparação

1. Limpe o espaço de trabalho dentro do exaustor de fluxo laminar usando 70% de etanol e luz UV-C.
2. Prepare os amortecedores de lavagem do talão. Fazer tampão 1 usando fosfato de sódio 0,1 M em pH 7,4-8,0, tampão 2 usando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio suplementado com 0,1% de antígeno sérico bovino (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 e tampão-3 usando 0,2 M Tris com 0,1% BSA, pH 8,5.

2. Concentrador de partículas magnéticas

1. Preparação de contas magnéticas
   1. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, misture suavemente 200 μL de esferas magnéticas (4 x 10⁸ contas) com 200 μL de tampão-1.
      NOTA: Prepare 200 μL de grânulos magnéticos por rato 1 dia antes da colheita de tecidos. As contas serão usadas para colher os glomérulos.
   2. Coloque o tubo em um concentrador de partículas magnéticas por 1 min e, em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Remova o tubo do ímã e ressuspenda as contas lavadas em 200 μL de buffer-1.
   3. Coloque o tubo que contém as contas magnéticas no concentrador de partículas magnéticas durante 1 min e aspirar suavemente o sobrenadante.
   4. Inative os grupos tosil livre lavando as contas magnéticas 2x, 5 min cada, usando 200 μL de buffer-2, colocando o tubo no concentrador de partículas magnéticas e descartando o buffer.
   5. Incubar as esferas magnéticas em 200 μL de tampão-3 durante 24 h a 4 °C, ou durante 4 h a 37 °C, para inactivar os restantes grupos tosil livres. Coloque o tubo no concentrador magnético por 1 min, aspirar suavemente o sobrenadante e descartá-lo.
   6. Lavar as contas magnéticas 1x com 200 μL de tampão-2 durante 5 min a 4 °C. Coloque o tubo de volta no concentrador magnético por 1 min e aspirar suavemente o sobrenadante. Retire o tubo do concentrador magnético e ressuspenda as contas magnéticas em 200 μL de tampão 2 para obter 4 x 10⁸ contas/mL.
      NOTA: Nesta fase, é possível deixar as contas a 4 °C por até 15 dias.

3. Isolamento das células glomerulares renais do rato

1. Preparar o material de perfusão: seringa de 30 ml, agulha de borboleta de 25 G. Prepare o material de isolamento: prato estéril de 10 cm, bisturi, concentrador de partículas magnéticas, filtro celular de 40 μm, filtro de célula de 100 μm.
2. Prepare 100 mL de 1x solução salina balanceada de Hank (HBSS) suplementada com antibióticos a 1% e ajuste o pH para 7,35. Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm e mantenha-a sob o capô para evitar a contaminação.
3. Misture 200 μL de grânulos magnéticos da etapa 2.1.6 com 20 mL de 1x HBSS.
   NOTA: Para cada rato, serão necessários 200 μL de grânulos diluídos em 20 ml de HBSS 1x.
4. Preparar uma alíquota de 1 ml de colagenase tipo II (125 CDU/mg) a 1 mg/ml em 1x solução de HBSS, pH 7,35. Pré-aqueça o RPMI com meio FCS a 10% em banho-maria a 37 °C. Pré-aqueça o meio de cultura de células endoteliais a 37 °C (ver Tabela de Materiais para mais detalhes).
   NOTA: O RPMI será usado para neutralizar a colagenase.
5. Pré-revestir dois poços de uma placa de 6 poços com 2 mL de colágeno IV de 10 μg/mL (1 mL/poço) por 45 min à temperatura ambiente. Lave a placa 3x com 1x PBS para remover o ácido acético usado para diluir o colágeno. Use as placas revestidas imediatamente ou armazene-as a 2-8 °C por até 4 semanas.
   NOTA: Selar a(s) placa(s) com uma película transparente é preferível para evitar a secagem. O revestimento de colágeno facilita a fixação das células à placa.
6. Limpar e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos da Figura 2 utilizando etanol a 70% e, posteriormente, autoclavá-los por 30 min. Limpe o espaço de trabalho cirúrgico com etanol a 70%.
7. Anestesiar os camundongos com uma injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina (10 mg/mL de cetamina e 1 mg/mL de xilazina). Para confirmar que o animal está totalmente anestesiado, verifique se há o reflexo de pinça do dedo do pé.
8. Fixe as patas do mouse com agulhas de 19 G para mantê-lo no lugar em uma plataforma de dissecação. Limpe o tórax e o abdômen com etanol a 70% e abra o abdômen ao longo do tórax com uma tesoura a (Figura 2).
9. Inserir uma agulha de borboleta no ventrículo esquerdo (Figura 3A) e injectar cerca de 100 μL da solução do talão (a partir do passo 1.2) para expandir a circulação sanguínea.
10. Romper cuidadosamente a veia cava inferior abaixo dos rins com uma agulha de 19 G (Figura 3A). Continue a perfusão iniciada na etapa 3.9.
    NOTA: Alternativamente, uma mini bomba pode ser usada na velocidade: 18.0+, tempo: 5 min. Uma boa perfusão é importante para colher um grande número de contas magnéticas portadoras de glomérulos. Este é um procedimento de não-sobrevivência / terminal.
11. Retirar suavemente o tecido adiposo com pinça e extirpar ambos os rins com tesoura cirúrgica fina c (Figura 2) e colocá-los em uma placa com 1 mL de 1x HBSS sobre gelo. Pice o rim com uma tesoura b (Figura 2) e, em seguida, com um bisturi estéril a pedaços pequenos de 1 mm, como mostra a Figura 3B.
12. Em seguida, incubar o rim picado com 1 mL de colagenase tipo II a partir do passo 3.4 por 35 min a 37 °C com inclinação suave usando um agitador horizontal. O tecido deve ser completamente digerido após esta etapa, como mostra a Figura 3C.
13. Adicione 4 mL de RPMI com FBS a 10% (a partir da etapa 3.4) para neutralizar a colagenase. Filtre o tecido digerido através de um filtro de células estéreis de 100 μm para um tubo de 50 ml. Use o fundo de um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL para agitar o tecido digerido contra o coador para permitir que os glomérulos passem.
14. Enxaguar o filtro celular com 15 mL de 1x HBSS e, em seguida, centrifugar o fluxo a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente. Neste ponto, o pellet contém três camadas; as contas com glomérulos são visíveis na camada intermediária do tubo, a camada superior consiste em estruturas menores, como túbulos, e a camada inferior são detritos (Figura 3D).
15. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e a camada branca superior. O pelotão restante contém as contas que ostentam os glomérulos e detritos (Figura 3D). Ressuscite o pellet com 1,5 mL de 1x HBSS e transfira para um tubo de 2 mL.
16. Colocar o tubo no concentrador magnético (Figura 3E), aspirar o sobrenadante e, em seguida, lavar as contas 2x com 1 mL de 1x HBSS; nesta fase, coloque 20 μL da suspensão celular em uma lâmina para verificar a presença de glomérulos ao microscópio (Figura 3F; um glomérulo [seta preta] e algumas contas [setas amarelas] na suspensão).
17. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, ressuspender o pellet em meio de crescimento de células endoteliais (Tabela de Materiais) e transferi-lo para um tubo limpo de 2 mL. Adicione 2 μL de IFNγ (100 U/mL) ao tubo e coloque as células em um poço de uma placa de 6 poços. Incubar as células a 33 °C.
18. Após 3 dias de cultura, trocar cuidadosamente o meio pipetando 1 mL do meio e substituindo-o por 1 mL de meio fresco. Nesta fase, as células são heterogêneas com uma mistura de células glomerulares (Figura 4G).
    NOTA: Na cultura de crescimento em crescimento, haverá uma mistura de células glomerulares e algumas esferas magnéticas (Figura 4G). Observe que todas as células devem mostrar mitocôndrias verdes e fluorescentes.
19. Após 7 dias de cultura, aspirar completamente o meio e substituí-lo por um meio fresco de 2 mL de crescimento de células endoteliais suplementado com IFNγ (100 U/mL). Nesta fase, as células começam a proliferar, mas ainda são heterogêneas (Figura 4A).
20. Após 10 dias de cultura, quando as células atingirem ~80% de confluência, passar as células usando tripsina conforme descrito na etapa 5.1 e, em seguida, transferi-las para um frasco T25 revestido com colágeno IV.
21. Após 1 semana (total ~21 dias de cultura), passar as células para um frasco de T75 revestido com colagénio IV.

4. Preparação de contas para isolamento de células endoteliais

1. Comece revestindo as contas anti-rato de ovelhas com um anticorpo CD31 anti-rato^de rato 3,18,19. Utilizar 10 μL de grânulos para cada balão T75.
2. Lave 10 μL de grânulos 3x com 200 μL de 1x PBS suplementado com 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Coloque o tubo no ímã concentrador para pipetar o tampão de lavagem de cada vez.
3. Ressuspender as esferas em 200 μL de PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Adicionar 4,8 μL de anticorpo CD31 anti-rato ^7,18,19 no rato, colocar o tubo num agitador horizontal e misturar suavemente durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida^, manter o tubo a 4 °C durante a noite.

5. Isolando as células endoteliais glomerulares com esferas revestidas com CD31

1. Adicionar 3 ml de tripsina a 0,25% a um balão de T75 e incubar as células a 37 °C durante 5 minutos. Neutralizar a tripsina com 3 mL de meio de crescimento endotelial, transferir as células para um tubo de 15 mL e, em seguida, centrifugar a 200 x g por 5 min.
2. Aspirar o sobrenadante e lavar as células em 1 mL de PBS contendo 1% de BSA, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Centrífuga a 200 x g durante 5 min.
3. Ressuspender o pellet em 200 μL de grânulos revestidos preparados na etapa 4 e adicionar 800 μL de PBS contendo 1% de BSA, 2 mM de EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar as células durante 45 min com agitação contínua a 37 °C, 5% de CO₂.
4. Coloque o tubo no concentrador magnético e lave as células 4x com 1x PBS contendo 1% de BSA, 2 mM de EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Ressuspender as células em 3 mL de meio de crescimento endotelial suplementado com 100 U/mL de IFNγ.
5. Placa de 1,5 mL de células/poço em poços revestidos de colágeno IV em uma placa de 6 poços. Cultivar as células em condições permissivas a 33 °C.
   NOTA: As células isoladas expressam o vírus símio 40 (SV40) grande antígeno T tsA58, permitindo a ativação da proliferação contínua a 33 °C (condição permissiva).
6. Após 4 dias em cultura, retirar 750 μL do meio e substituí-lo pelo mesmo volume de meio fresco suplementado com 100 U/mL de IFNγ.
7. Após 10 dias a 14 dias de cultura, verificar se há colônias de GECs CD31 positivas em crescimento (Figura 4C) que expressam mitocôndrias fluorescentes usando um microscópio de epifluorescência com filtro de 488 nm.
8. Após 21 dias de cultura, as células podem ter atingido 80%-90% de confluência; transferi-los para um balão T25. Após atingir a confluência, as células podem ser mantidas com meio de crescimento RPMI e FCS a 10%.
   NOTA: Antes de atingir a confluência, as células podem parecer heterogêneas (Figura 4B). No entanto, uma vez que são confluentes, adquirem uma morfologia de paralelepípedos.
9. Nesta fase, as células podem ser criopreservadas. Ao atingir 80% de confluência, adicionar 3 mL de tripsina a 0,25% às células e incubá-las a 37 °C por 5 min. Neutralizar a tripsina com um volume igual de meio de crescimento suplementado com 10% de FBS.
10. Centrífuga a 200 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 3 mL de meio de congelamento (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquotar as células em tubos criogênicos e armazená-las em temperatura de vapor de nitrogênio líquido.

6. Cultivando os mitoDendra2-GECs

1. Descongelar as células da crioalíquota, a partir da etapa 5.10, em banho-maria a 37 °C e transferi-las para um tubo de 15 mL com 10 mL de meio de crescimento endotelial pré-aquecido.
2. Centrifugar a suspensão a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Retirar o meio e transferir o pellet para o balão de cultura celular T25 cm² revestido de colagénio IV com meio de crescimento de células endoteliais pré-aquecido suplementado com 100 U/ml de IFNγ e incubar a 33 °C.
3. Mude o meio no dia seguinte. Quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, geralmente após 5 dias, transfira-as para um frasco de cultura de células T75 cm² .
4. Para diferenciar as células para o fenótipo endotelial, transfira as células para condições não permissivas a 37 °C em meios de crescimento sem IFNγ.

7. Passaging de mitoDendra2-GECs

1. Retirar o meio, lavar as células com PBS e adicionar 3 ml de solução quente de tripsina-EDTA a 0,25% (balão de T75 cm² ), incubar a 37 °C durante 5 min.
2. Quando as células estiverem descoladas, adicione 5 mL de meio de crescimento e pipeta para cima e para baixo. Centrifugar a suspensão a 200 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente e transferir as células para um novo balão ou placa revestida de colagénio IV.
   NOTA: A passagem deve ser feita uma vez por semana na proporção de 1:4.

8. Caracterização de mitoDendra2-GECs

1. Realizar coloração por imunofluorescência para CD31 em células diferenciadas 7,18,19,20 (Figura 4D). Use outros marcadores, como vWF e Isolectin-B4, bem como²⁰.
2. Para confirmar a especificidade mitocondrial do Dendra2, rotular as células com marcadores mitocondriais específicos, incubando as células em meio de crescimento contendo 100 nM de rastreador mitocondrial por 30 min a 37 °C, 5% de CO₂.
3. Retire o meio e lave as células suavemente com meio pré-aquecido sem vermelho de fenol para realizar imagens ao vivo.
   NOTA: Alternativamente, as células podem ser fixadas usando fixadores de formaldeído (4%) por 30 minutos, seguido de lavagem várias vezes em PBS. As células fixas podem ser armazenadas a 4 °C em 1x PBS até a utilização. Uma confirmação com citometria de fluxo também é possível: células de rótulo com anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45. Os GECs devem corar negativamente para marcadores de podócitos (sinaptopodina, Nphs1, Podxl), marcadores de células mesangiais (PDGFRβ, angiotensinogênio) e marcadores celulares tubulares (Aquaporina, Aminopeptidase-N). Esses marcadores servem como controles negativos. Devido à expressão de Dendra2 mitocondrial específica dessas células, evite usar o canal FITC.

9. Imagem de células vivas de alterações estruturais das mitocôndrias em resposta ao estresse oxidativo ou glicose elevada

1. Placa 1 x 10⁵ GECs em um prato de fundo de vidro de 35 mm revestido com colágeno IV usando meio de crescimento de células endoteliais (Tabela de Materiais). Após 24 h, mude para meio sem vermelho de fenol. As células têm mitocôndrias verdes e fluorescentes.
2. Ajuste a câmara ambiental a 37 °C, 5% de umidade e 5% de CO₂ 1 h antes do início do experimento.
3. Sob um microscópio confocal, use uma objetiva de 40x/1,2 W para ajustar o foco e selecionar a região de interesse. Incubar as células com 2mL de glicose de 5 mM ou 25 mM por 60 min.
4. Expor as células a um laser de 405 nm (4% de potência do laser) para fotoconverter uma subpopulação de mitocôndrias de verde para vermelho (Figura 5A-B, D-E).
5. Use o laser de 561 nm para excitar Dendra2 no estado não convertido para visualizar a fluorescência vermelha. Consulte o protocolo detalhado de comutação de fotos, conforme descrito anteriormente¹⁶. Os eventos de fusão aparecem como fluorescência amarela após vários minutos devido à fusão da matriz verde e da matriz vermelha (Figura 4C, F).

Results

Neste artigo, um protocolo detalhado para o isolamento de células endoteliais glomerulares imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes estáveis (mitoDendra2-GECs) é descrito (Figura 1). O uso de camundongos jovens de 6 a 10 semanas de idade é essencial para obter um número substancial de células saudáveis. Após 3 dias de cultura, as células começam a crescer lentamente a partir dos glomérulos isolados, como mostra a Figura 3G. Após 7 dias, as c...

Discussion

As mitocôndrias são críticas para o metabolismo celular, homeostase e respostas ao estresse, e sua disfunção está ligada a muitas doenças, incluindo doenças renais. As mitocôndrias têm papel na geração patológica de espécies reativas excessivas de oxigênio (EROs), na regulação dos níveis intracelulares de cálcio, nas vias de morte celular e na dinâmica citoesquelética^21,22,23.

O isolamento de GECs mur...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µ filtro de células m	Fisher	22-363-549
Seringas de insulina de 1ml	BD	329424
25G borboleta	BD	367298
tesoura de ponta de 3 mm	F.S.T	15000-00
seringa de 30ml	BD Biooscience	309650
40 µ filtro de células m	Fisher	22-363-547
40 µ m malha
Bonn Scissors	FST	14184-09
Albumina de soro bovino	Fisher	BP1600-100
CD31	abcam	ab7388
Tipo de colagenase I	Corning	354236
Collagenase tipo II	SIGMA	C6885	125CDU/mg
Colágeno tipo IV	SIGMA	C5533-5M
Dnase-I	Qiagen	79254
Dynabeads 450	Thermofisher Scientific	14013
meio de crescimento de células endoteliais	Lonza	cc-3156
Pinça graefe extra fina	FST	11150-10
FBS	Gemini	100-106	Fibronectina inativada por calor
	Thermofisher	33016015
Pinça Fina	FST Dumont	E6511
HBSS	GIBCO	14065-056
IFNg	Cell Science	CRI001B
Laboratório Immortomouse	Jackson	32619	Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ
L-Glutamina 100x	Thermofisher Scientific	25030081
Concentrador de partículas magnéticas	Thermofisher Scientific	12320D
mitotracker	Thermofisher Scientific	M7512
PBS 1X	Corning	46-013-CM
penequilina estreptomicina 100x	Thermofisher Scientific	10378016
camundongos PhaM	laboratório Jackson	18397	B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J
Protease (10 mg/ml)	SIGMA	P6911
RPMI	GIBCO	3945
Pyruvate de Sódio 100mM	Thermofisher Scientific	11360070
Padrão de fórceps	FST	11000-12
Tesoura Cirúrgica - Sharp-Blunt	FST	14008-14
sinaptopodina	Santa Cruz	sc-515842
Tripsina 0,05%	Thermofisher Scientific	25300054