O artigo descreve o método de isolamento de células endoteliais glomerulares imortalizadas condicionalmente dos rins de camundongos transgênicos expressando o vírus símio termolábil 40 e mitocôndrias fotoativáveis,excisadas por PhAM. Descrevemos o procedimento para isolamento de glomérulos de rins inteiros usando contas, etapas de digestão, semeadura e cultura de GECs-CD31 positivos.
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Artigo de método
Isolamento de células endoteliais glomerulares de camundongos imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes
Neste artigo
Resumo
Resumo
A disfunção das células endoteliais glomerulares (GEC) pode iniciar e contribuir para a quebra da barreira de filtração glomerular. O aumento do estresse oxidativo mitocondrial tem sido sugerido como um mecanismo que resulta em disfunção GEC na patogênese de algumas doenças glomerulares. Historicamente, o isolamento dos GECs dos modelos in vivo tem sido notoriamente desafiador devido às dificuldades em isolar culturas puras dos glomérulos. Os GECs têm requisitos complexos de crescimento in vitro e uma vida útil muito limitada. Aqui, descrevemos o procedimento de isolamento e cultura de GECs condicionalmente imortalizados com mitocôndrias fluorescentes, possibilitando o rastreamento de eventos de fissão e fusão mitocondriais. Os GECs foram isolados dos rins de um camundongo duplo transgênico expressando o TAg termolábil SV40 (do camundongo Immorto), promovendo condicionalmente a proliferação e suprimindo a diferenciação celular, e uma proteína fluorescente fotoconversível (Dendra2) em todas as mitocôndrias (do camundongo mitocôndrias fotoativáveis [PhAMexcised]). A linhagem celular estável gerada permite a diferenciação celular após a inativação do gene imortalizante SV40 TAg e a fotoativação de um subconjunto de mitocôndrias, causando uma mudança na fluorescência do verde para o vermelho. O uso de mitoDendra2-GECs permite imagens ao vivo dos eventos de distribuição, fusão e fissão das mitocôndrias fluorescentes sem corar as células.
Introdução
O glomérulo é crítico para a filtração sanguínea, restringindo a passagem de moléculas grandes através da barreira de filtração glomerular 1,2. O glomérulo contém quatro tipos de células: células epiteliais parietais, podócitos (células epiteliais viscerais), células endoteliais glomerulares (GEC) e células mesangiais3. O endotélio glomerular é caracterizado por uma estrutura vascular única, de acordo com a presença de fenestras necessárias para grandes volumes de filtração4. A superfície apical do endotélio glomerular é coberta com uma camada de glicocálice carr....
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Protocolo
Todos os procedimentos animais descritos aqui foram aprovados pela IACUC na Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai. Usamos três camundongos machos (camundongos transgênicos H-2Kb-tsA58 com mitocôndrias fotoativáveis [PhAM]) comprados do laboratório Jackson e mantidos em uma dieta normal de ração.
1. Condições de trabalho e preparação
- Limpe o espaço de trabalho dentro do exaustor de fluxo laminar usando 70% de etanol e luz UV-C.
- Prepare os amortecedores de lavagem do talão. Fazer tampão 1 usando fosfato de sódio 0,1 M em pH 7,4-8,0, tampão 2 usando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio....
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Resultados
Neste artigo, um protocolo detalhado para o isolamento de células endoteliais glomerulares imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes estáveis (mitoDendra2-GECs) é descrito (Figura 1). O uso de camundongos jovens de 6 a 10 semanas de idade é essencial para obter um número substancial de células saudáveis. Após 3 dias de cultura, as células começam a crescer lentamente a partir dos glomérulos isolados, como mostra a Figura 3G. Após 7 dias, as c.......
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Discussão
As mitocôndrias são críticas para o metabolismo celular, homeostase e respostas ao estresse, e sua disfunção está ligada a muitas doenças, incluindo doenças renais. As mitocôndrias têm papel na geração patológica de espécies reativas excessivas de oxigênio (EROs), na regulação dos níveis intracelulares de cálcio, nas vias de morte celular e na dinâmica citoesquelética21,22,23.
O isolamento de GECs mur.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a declarar.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Professor Cijiang He e ao Dr. Fu Jia por seus insights sobre o isolamento de células endoteliais de camundongos e agradecem ao Professor Mone Zaidi por fornecer aos camundongosexcisados PhAM e discussões valiosas. Os autores também gostariam de agradecer o CORE de Microscopia na Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai e a equipe pela orientação que recebemos. Este trabalho foi apoiado por doações do subsídio R01DK097253 do National Institutes of Health e do subsídio CDMRP do Departamento de Defesa E01 W81XWH2010836 ao I.S.D.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100 µ filtro de células m | Fisher | 22-363-549 | |
| Seringas de insulina de 1ml | BD | 329424 | |
| 25G borboleta | BD | 367298 | |
| tesoura de ponta de 3 mm | F.S.T | 15000-00 | |
| seringa de 30ml | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µ filtro de células m | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µ m malha | |||
| Bonn Scissors | FST | 14184-09 | |
| Albumina de soro bovino | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Tipo de colagenase I | Corning | 354236 | |
| Collagenase tipo II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Colágeno tipo IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| meio de crescimento de células endoteliais | Lonza | cc-3156 | |
| Pinça graefe extra fina | FST | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Fibronectina inativada por calor |
| Thermofisher | 33016015 | ||
| Pinça Fina | FST Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Laboratório Immortomouse | Jackson | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamina 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Concentrador de partículas magnéticas | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penequilina estreptomicina 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| camundongos PhaM | laboratório Jackson | 18397 | B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Pyruvate de Sódio 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Padrão de fórceps | FST | 11000-12 | |
| Tesoura Cirúrgica - Sharp-Blunt | FST | 14008-14 | |
| sinaptopodina | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Tripsina 0,05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
Referências
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C.
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Reimpressões e permissões
