Preparação e avaliação estrutural de monocamadas de células epiteliais em um dispositivo de cultura microfluídica de tamanho fisiológico

Eshan  B. Damle; Eiichiro Yamaguchi; Joshua E. Yao; Donald P. Gaver III

doi:10.3791/64148

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Artigo de método

Preparação e avaliação estrutural de monocamadas de células epiteliais em um dispositivo de cultura microfluídica de tamanho fisiológico

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DOI:

10.3791/64148

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1 de julho de 2022

Eshan B. Damle¹ , Eiichiro Yamaguchi¹ , Joshua E. Yao¹ , Donald P. Gaver III¹

¹Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Neste artigo

Resumo

O protocolo apresentado descreve o desenvolvimento e o uso de uma técnica de coloração de actina filamentosa à base de faloidina com microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) para visualizar a estrutura da camada celular aderente em canais de cultura dinâmica microfluídica e câmaras tradicionais de cultura estática de poço fixo. Essa abordagem auxilia na avaliação da confluência da camada celular, da formação da monocamada e da uniformidade da espessura da camada.

Resumo

A experimentação microfluídica in vitro tem grande potencial para revelar muitos conhecimentos sobre os fenômenos microfisiológicos que ocorrem em condições como a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) e a lesão pulmonar induzida por ventilação mecânica (LIVB). No entanto, estudos em canais microfluídicos com dimensões fisiologicamente relevantes para os bronquíolos terminais do pulmão humano enfrentam atualmente vários desafios, especialmente devido às dificuldades em estabelecer condições adequadas de cultura celular, incluindo taxas de fluxo de meios, dentro de um determinado ambiente de cultura. O protocolo apresentado descreve uma abordagem baseada em imagens para avaliar a estrutura de células epiteliais pulmonares humanas NCI-H441 cultivadas em um canal microfluídico impermeável ao oxigênio com dimensões fisiologicamente relevantes para os bronquíolos terminais do pulmão humano. Usando a coloração de actina filamentosa à base de faloidina, as estruturas citoesqueléticas das células são reveladas por microscopia confocal de varredura a laser, permitindo a visualização de células individuais e em camadas. A quantificação subsequente determina se as condições de cultura celular que estão sendo empregadas estão produzindo monocamadas uniformes adequadas para experimentação posterior. O protocolo descreve métodos de cultura de células e avaliação de camadas em canais microfluídicos e ambientes tradicionais de poço fixo. Isso inclui construção de canais, cultura de células e condições necessárias, fixação, permeabilização e coloração, imagens microscópicas confocais, processamento de imagens e análise de dados.

Introdução

A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma condição aguda decorrente de insulto e propagação de lesão no parênquima pulmonar, resultando em edema pulmonar dos alvéolos, trocas gasosas inadequadas e subsequente hipoxemia¹. Isso inicia um ciclo de liberação de citocinas pró-inflamatórias, recrutamento de neutrófilos, liberação de mediadores tóxicos e dano tecidual, o que por si só incorre em uma resposta inflamatória adicional². Além disso, o surfactante pulmonar, que estabiliza as vias aéreas e previne danos causados por recrutamento/desrecrutamento (R/D) repetitivos, pode ser inativado ou tornado disfuncio....