Method Article

Preparação e avaliação estrutural de monocamadas de células epiteliais em um dispositivo de cultura microfluídica de tamanho fisiológico

DOI:

10.3791/64148

⸱

July 1st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo apresentado descreve o desenvolvimento e o uso de uma técnica de coloração de actina filamentosa à base de faloidina com microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) para visualizar a estrutura da camada celular aderente em canais de cultura dinâmica microfluídica e câmaras tradicionais de cultura estática de poço fixo. Essa abordagem auxilia na avaliação da confluência da camada celular, da formação da monocamada e da uniformidade da espessura da camada.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A experimentação microfluídica in vitro tem grande potencial para revelar muitos conhecimentos sobre os fenômenos microfisiológicos que ocorrem em condições como a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) e a lesão pulmonar induzida por ventilação mecânica (LIVB). No entanto, estudos em canais microfluídicos com dimensões fisiologicamente relevantes para os bronquíolos terminais do pulmão humano enfrentam atualmente vários desafios, especialmente devido às dificuldades em estabelecer condições adequadas de cultura celular, incluindo taxas de fluxo de meios, dentro de um determinado ambiente de cultura. O protocolo apresentado descreve uma abordagem baseada em imagens para avaliar a estrutura de células epiteliais pulmonares humanas NCI-H441 cultivadas em um canal microfluídico impermeável ao oxigênio com dimensões fisiologicamente relevantes para os bronquíolos terminais do pulmão humano. Usando a coloração de actina filamentosa à base de faloidina, as estruturas citoesqueléticas das células são reveladas por microscopia confocal de varredura a laser, permitindo a visualização de células individuais e em camadas. A quantificação subsequente determina se as condições de cultura celular que estão sendo empregadas estão produzindo monocamadas uniformes adequadas para experimentação posterior. O protocolo descreve métodos de cultura de células e avaliação de camadas em canais microfluídicos e ambientes tradicionais de poço fixo. Isso inclui construção de canais, cultura de células e condições necessárias, fixação, permeabilização e coloração, imagens microscópicas confocais, processamento de imagens e análise de dados.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma condição aguda decorrente de insulto e propagação de lesão no parênquima pulmonar, resultando em edema pulmonar dos alvéolos, trocas gasosas inadequadas e subsequente hipoxemia1. Isso inicia um ciclo de liberação de citocinas pró-inflamatórias, recrutamento de neutrófilos, liberação de mediadores tóxicos e dano tecidual, o que por si só incorre em uma resposta inflamatória adicional2. Além disso, o surfactante pulmonar, que estabiliza as vias aéreas e previne danos causados por recrutamento/desrecrutamento (R/D) repetitivos, pode ser inativado ou tornado disfuncional pelos processos químicos que ocorrem durante a SDRA, resultando em maior estresse e lesão do parênquima circundante3. Se houver danos suficientes, a ventilação mecânica pode ser necessária para garantir oxigenação sistêmica adequada4. No entanto, a ventilação mecânica impõe seus próprios desafios e traumas, incluindo a possibilidade de lesão pulmonar induzida pela ventilação mecânica (LPIV), caracterizada como lesão do parênquima pulmonar causada pelos esforços mecânicos impostos durante a superinsuflação (volutrauma) e/ou pela D/D da interface ar-líquido na via aérea ocluída por líquido (atelectrauma)5. O gradiente de pressão experimentado por células epiteliais expostas a uma interface ar-líquido (como em um bronquíolo ocluído por fluido) no modelo atelectrauma pode resultar em uma resposta obstrutiva originada pela permeabilidade (POOR), levando a um ciclo virtuoso de lesão POOR-get-POORer 6,7,8.

A experimentação in vitro pode fornecer informações em microescala sobre esses fenômenos, mas os estudos atuais em ambientes de canais microfluídicos com dimensões fisiologicamente relevantes enfrentam váriosdesafios9. Por um lado, a otimização das condições de cultura celular representa uma barreira significativa à entrada para a pesquisa em cultura de células em ambientes microfluídicos, pois existe uma interseção estreita dentro da qual os parâmetros de fluxo de meio, duração da cultura e outras condições de cultura permitem a formação ótima da camada celular. Isso inclui as limitações de difusão impostas pela natureza impermeável ao oxigênio do invólucro do canal de cultura microfluídica. Isso requer uma consideração cuidadosa dos parâmetros de fluxo do meio, pois baixas taxas de fluxo podem privar as células de oxigênio, especialmente aquelas mais distantes da entrada; Por outro lado, altas taxas de fluxo podem empurrar as células para fora do canal de cultura ou resultar em desenvolvimento inadequado ou desigual da camada. Limitações de difusão podem ser abordadas com o uso de materiais permeáveis ao oxigênio, como polidimetilsiloxano (PDMS), em um aparelho de cultura de interface ar-líquido (LPA); no entanto, muitos canais de cultura microfluídica convencionais, como os do sistema elétrico cell-substrate impedance sensing (ECIS), são inerentemente impermeáveis ao oxigênio, dada a natureza do gabinete fabricado10. Este protocolo visa fornecer uma técnica para análise de camadas celulares cultivadas em um recinto impermeável ao oxigênio.

Ao comparar a viabilidade das condições de cultura, observações de características específicas da camada, tais como a presença de uma monocamada, topologia de superfície, confluência e uniformidade de espessura de camada, são necessárias para determinar se a camada celular produzida por um determinado conjunto de condições de cultura atende às especificações desejadas e são de fato relevantes para o planejamento experimental. Uma avaliação limitada pode ser realizada por métodos como o ECIS, que utiliza medidas de potencial elétrico (tensão) criado pela resistência à corrente alternada (CA) de alta frequência (impedância) imposta por membranas eletricamente isolantes de células cultivadas em eletrodos de ouro dentro da matriz de fluxo. Ao modular a frequência de CA aplicada às células, propriedades celulares específicas dependentes da frequência das células e das camadas celulares, tais como força de aderência superficial, formação de tight junction e proliferação ou confluência celular, podem ser alvo e examinadas11. No entanto, essas formas indiretas de medidas são um pouco difíceis de interpretar no início de um experimento, e podem não quantificar todos os aspectos relevantes da camada celular. A simples observação da camada celular sob um microscópio de contraste de fase pode revelar a natureza de certas qualidades, tais como confluência; no entanto, muitas características relevantes, como a presença de uma monocamada e uniformidade de espessura de camada, requerem uma avaliação tridimensional (3D), o que não é possível com imagens microscópicas de campo claro, contraste de fase ou fluorescente12.

O objetivo deste estudo foi desenvolver uma técnica de coloração de actina filamentosa para permitir a verificação por imagem de uma monocamada e a avaliação da uniformidade da camada celular usando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). A actina filamentosa (F-actina) foi considerada um alvo apropriado para o conjugado fluoróforo, devido, em parte, à maneira como a F-actina segue firmemente a membrana celular, permitindo uma aproximação visual de todo o volume celular13. Outro benefício importante do direcionamento da F-actina é a maneira pela qual a coloração da F-actina elucida visualmente as rupturas ou alterações do citoesqueleto impostas pelos estresses e tensões experimentados pelas células. A fixação de ligações cruzadas com formaldeído livre de metanol foi utilizada para preservar a morfologia das células e da camada celular, uma vez que fixadores desidratantes, como o metanol, tendem a achatar as células, distorcendo grosseiramente a camada celular e alterando suas propriedades14,15.

Para determinar a capacidade da técnica de avaliação de camadas em mitigar esses desafios, as células foram cultivadas em câmaras de cultura tradicionais de oito poços, bem como em canais microfluídicos para avaliar as diferenças, se houver, nas camadas celulares produzidas. Para os poços de cultura fixos, foram utilizadas unidades de vidro coberto com câmara de oito poços. Para a cultura microfluídica, matrizes de fluxo (comprimento do canal 50 mm, largura 5 mm, profundidade 0,6 mm) foram otimizadas para o cultivo de células epiteliais do pulmão humano imortalizado (NCI-H441) em um ambiente com dimensões fisiologicamente relevantes para os bronquíolos terminais presentes na zona respiratória do pulmão humano16. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido com o ambiente de cultura de matrizes de fluxo ECIS em mente, ele pode ser aplicado a qualquer ambiente de cultura dinâmica impermeável ao oxigênio para o qual a avaliação das características da camada celular cultivada ou das condições de cultura seja necessária.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A linhagem celular epitelial pulmonar humana NCI-H441 foi utilizada para o presente estudo (ver Tabela de Materiais).

1. Cultura celular no canal microfluídico

  1. Fabricar o canal microfluídico e realizar o pré-tratamento seguindo os passos abaixo.
    1. Obtenha uma matriz de fluxo de canal único (consulte Tabela de Materiais) e separe a porção superior da placa de base de policarbonato.
    2. Obter uma tampa de vidro retangular #1.5 (espessura 0,17 mm) com dimensões de 60 mm x 22 mm. Limpar as superfícies do vidro de cobertura num banho ultra-sónico e tratar um lado com uma solução de Poli-D-lisina 0,1 mg/ml à temperatura ambiente durante 5 minutos antes de secar a 60 °C durante 30 minutos.
    3. Afixar um adesivo de dupla face de 0,13 mm de espessura (ver Tabela de Materiais), cortado a laser para acomodar as dimensões do topo da matriz de fluxo e do canal de fluxo (50 mm de comprimento, 5 mm de largura), na parte superior da matriz de fluxo, tendo o cuidado de alinhar precisamente os recortes do canal17.
    4. Afixe um espaçador mylar de 0,1 mm de espessura (consulte Tabela de Materiais), cortado a laser para acomodar as dimensões do topo da matriz de fluxo e do canal de fluxo, na tira adesiva, tendo o cuidado de alinhar precisamente os recortes do canal.
    5. Repita os passos 1.1.3 e 1.1.4 até atingir a altura desejada do canal (por exemplo, para uma altura de canal de 0,6 mm, utilize dois espaçadores e três tiras adesivas).
    6. Afixe uma tampa retangular na tira adesiva mais inferior com o lado tratado com Poli-D-lisina voltado para o adesivo. Após a conclusão da montagem, conforme indicado na Figura 1, aplique pressão firme e igual na parte superior e inferior da construção e segure por 1 min.
      NOTA: A construção do gabinete do canal, incluindo vidro de cobertura, adesivos, espaçadores e parte superior da matriz de fluxo, está concluída.
    7. Enxágue o canal com água desionizada usando uma seringa, verificando simultaneamente se há vazamentos.
    8. Esterilizar o compartimento do canal em um esterilizador ultravioleta (UV) por 30 min18.
    9. Usando técnica estéril, tratar o canal com 2,0 μg/mL de fibronectina humana (ver Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubar por pelo menos 30 min a 37 °C19.
  2. Realizar cultura celular no canal microfluídico seguindo os passos abaixo.
    1. Em uma capela de fluxo laminar estéril, use uma micropipeta para transferir uma suspensão uniforme de células NCI-H441 em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS) (ver Tabela de Materiais) para semear dois canais microfluídicos, cada um com células a uma densidade de superfície de 150.000 células/cm2.
      1. Para canais de 50 mm x 5 mm x 0,6 mm, use 0,25 mL de uma suspensão de 2,5 x 106 células/mL para preencher cada canal, bem como uma parte dos portos. Verifique se as células foram distribuídas uniformemente dentro dos canais usando um microscópio de campo claro.
    2. Cultivar os dois canais por 24 h e 48 h, respectivamente, a 37 °C com 5% de CO2 usando uma bomba de seringa programável (ver Tabela de Materiais), extraindo mídia gasta do canal e mídia fresca para o canal a partir de um reservatório de meio estéril conectado à entrada do canal composto por uma seringa de 20 mL aberta coberta com filme de parafina.
      1. Após um período de espera de 10 minutos após a semeadura celular, introduzir e bombear meios frescos do reservatório através do canal a uma taxa de fluxo variável começando em 0,2 μL/min e aumentando até 10 μL/min por 4 h, mantendo-se nessa taxa a partir de20.
        NOTA: Esta taxa de fluxo variável fornece condições de cultura que permitem que as células (1) se estabeleçam gravitacionalmente na superfície de cultura, (2) adiram à superfície de cultura e (3) formem uma monocamada confluente.
  3. Realizar fixação celular dentro dos canais microfluídicos utilizando solução de formaldeído.
    CUIDADO: O formaldeído é tóxico e deve ser manuseado em exaustor químico apropriado21.
    1. Em uma capela de fumaça química, prepare soluções de formaldeído usando formaldeído a 4% em PBS (livre de metanol) (ver Tabela de Materiais) para criar duas porções de 4 mL, diluindo a primeira para uma concentração de formaldeído a 1% e a segunda para formaldeído a 2% usando solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS; com Ca 2+ e Mg2+) como diluente. Transfira soluções de formaldeído para separar seringas de 5 mL e rotule de acordo. Extrair 20 ml de DPBS para uma seringa separada de 20 ml.
    2. Remova os canais microfluídicos do aparelho de cultura e coloque-os no exaustor de fumaça química.
    3. Montar o aparelho de fixação e coloração.
      1. Conecte um segmento de 10 cm de tubulação de transferência à porta lateral de uma torneira de três vias por meio de uma trava Luer macho para o adaptador de farpa da mangueira (consulte Tabela de Materiais) e, em seguida, conecte a torneira à porta de entrada da matriz de fluxo.
      2. Em seguida, conecte outro segmento de 10 cm de tubulação de transferência à porta de saída da matriz de fluxo usando o mesmo tipo de adaptador de farpa de mangueira.
      3. Finalmente, fixe as extremidades livres de ambos os tubos de transferência em um recipiente de resíduos químicos e biohazard-appropriate, como um tubo de centrífuga cônica vazio rotulado de 50 mL.
    4. Gire a torneira para bloquear a porta de entrada do fluxo e limpe a linha de resíduos com DPBS. Em seguida, gire a torneira para bloquear a linha de resíduos e lave lentamente as células com 2 mL de DPBS. Repita sempre a etapa de lavagem usando a nova solução. Uma nova solução (ou concentração de solução) é introduzida no canal.
    5. Empurre lentamente 2 mL de solução fixadora a 1% através do canal e, em seguida, deixe descansar por 5 min22.
    6. Empurre lentamente 2 mL de solução fixadora a 2% através do canal e, em seguida, deixe descansar por 15 minutos.
    7. Lave as células introduzindo lentamente 2 mL de DPBS fresco no canal em três instâncias separadas (5 min cada).
    8. Conclua as etapas 1.3.3-1.3.7 para ambos os canais microfluídicos em paralelo.
  4. Corar, permeabilizar, e adicionar meios de montagem às células no canal microfluídico.
    1. Preparar uma solução de saponina a 0,1% adicionando 1 mg de saponina (ver Tabela de Materiais) por ml de DPBS para produzir 4 ml de solução e vórtice suavemente para misturar23. Introduzir 8 ml de DPBS numa seringa de 20 ml.
    2. Adicionar um reagente de faloidina corante com F-actina e um reagente Hoechst corante de núcleo (ver Tabela de Materiais) à solução de saponina a 0,1%, a duas gotas (0,1 ml) de cada reagente por ml de solução de saponina. Manter preparada a solução de coloração/permeabilização longe da luz, cobrindo com folha de alumínio24.
    3. Lavar a linha com uma pequena quantidade de solução corante/permeabilizante (conforme descrito no passo 1.3.4), introduzir 2 ml da solução no canal microfluídico e cobrir o canal com folha de alumínio antes de deixar descansar à temperatura ambiente durante 30 minutos.
    4. Lavar a solução de coloração/permeabilização duas vezes com 2 mL de DPBS por 5 minutos por lavagem.
    5. Para uma melhor qualidade de imagem, adicione um meio de montagem adequado (com um índice de refração que corresponda ao óleo da objetiva do microscópio e ao vidro da tampa, consulte Tabela de Materiais) no canal.
      1. Usando uma micropipeta, introduza uma quantidade mínima de um suporte antifade soft-set em cada porta do canal microfluídico, garantindo que a superfície inferior esteja completamente coberta e nenhuma bolha fique presa dentro da área de imagem desejada25. Sele as extremidades do canal e verifique a integridade da camada celular observando sob um microscópio de campo claro.
    6. Conclua as etapas 1.4.3-1.4.5 para ambos os canais microfluídicos em paralelo.
      NOTA: Células de imagem o mais rápido possível após a coloração para máxima qualidade de imagem. Se ocorrer fotobranqueamento ou se o armazenamento a longo prazo for desejado, outros meios de montagem com propriedades antifade ou de preservação de amostras podem ser usados. Observe que a mídia de montagem de cura dura distorcerá a estrutura 3D das células e, por extensão, a camada de células; Por essa razão, a mídia de montagem de ajuste suave é preferível26.
  5. Células de imagem no canal microfluídico seguindo as etapas abaixo.
    1. Ajuste as configurações do microscópio confocal (consulte Tabela de Materiais), incluindo potência do laser, ganho, deslocamento e parâmetros de varredura, como velocidade de varredura, área de varredura, formato de varredura, resolução e diâmetro do orifício27.
    2. Teste a localização da imagem fazendo varreduras de referência, bem como pilhas Z até que os parâmetros e condições de imagem desejados tenham sido atendidos. Parâmetros de discagem em objetivas de ampliação sequencialmente mais altas até que a objetiva de imersão em óleo de 40x tenha sido atingida e otimizada28.
    3. Usando a placa de base de matriz de fluxo como referência, construa pilhas Z em cinco locais, na localização do primeiro eletrodo no lado de entrada, a meio caminho entre o centro e o local anterior, o centro, a meio caminho entre o centro e a localização do último eletrodo (no lado de saída), e no último eletrodo, conforme indicado na Figura 2.
  6. Realizar processamento de imagens e análise de dados.
    1. Exporte seções transversais XZ e YZ usando o pacote de software de microscópio confocal (consulte Tabela de Materiais).
    2. Usando um software de processamento de imagem (consulte Tabela de Materiais) com recursos de detecção de borda (valor de limite 15,0), meça a área total da imagem em pixels usando a ferramenta Varinha Mágica fora da imagem e, em seguida, a área excluindo a área transversal total da camada de célula em pixels usando a ferramenta Varinha Mágica na parte da imagem externa à camadade célula 29.
    3. Usando o software de processamento de dados (consulte Tabela de materiais), subtraia o valor de pixel de área externa do valor de pixel de área total para encontrar o valor de pixel de área transversal.
    4. Converta valores de pixel de área transversal para valores de μm2 multiplicando os valores de pixel pelo quadrado do valor de μm/pixel, conforme indicado no software do microscópio para a imagem específica (0,31 μm/pixel para pilhas Z tomadas em resolução de 1024p sem zoom em uma lente de imersão em óleo de 40x).
    5. Calcular médias e desvios-padrão dos dados e resultados gráficos.

figure-protocol-1
Figura 1: Esquema de visão explodida da construção do canal microfluídico. O elemento superior é a porção superior da matriz de fluxo, os elementos cinzentos finos são tiras adesivas, os elementos azuis finos são espaçadores mylar e o elemento inferior é o vidro de cobertura retangular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-2
Figura 2: Cinco locais de imagem ao longo da região consistentemente produtora de camadas do canal de cultura microfluídica. Os locais de aquisição de imagens são os seguintes: lado de entrada, próximo de onde o primeiro eletrodo estaria no arranjo de fluxo intacto; a meio caminho entre a localização do lado da entrada e o centro do canal; centro do canal; a meio caminho entre o centro e o lado da saída, e o lado da saída, perto de onde o último eletrodo estaria na matriz de fluxo intacta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Cultura celular na tampa de oito poços com câmara

  1. Realizar o pré-tratamento do vidro de cobertura com câmara de oito poços.
    1. Obter um vidro de cobertura estéril com câmara de oito poços fabricado com um vidro de cobertura #1.5 e tratamento de superfície que aumenta a aderência celular (Figura 3, consulte a Tabela de Materiais).
    2. Usando técnica estéril, tratar a superfície dos poços de cultura com 2,0 μg/mL de fibronectina humana em PBS e incubar por pelo menos 30 min a 37 °C19.
  2. Realizar cultura celular na tampa da câmara seguindo os passos abaixo.
    1. Em uma capela de fluxo laminar estéril, transfira porções de 0,5 mL de soluções de células NCI-H441 uniformemente suspensas em meio RPMI 1640 com FBS de 10% nas densidades volumétricas de 81.000, 162.000 e 324.000 células/mL para semear os poços de cultura nas densidades superficiais de 45.000, 90.000 e 180.000 células/cm2, respectivamente. Verifique se as células foram distribuídas uniformemente dentro dos poços usando um microscópio de campo claro.
    2. Células de cultura por 24 h, 48 h e 96 h a 37 °C com 5% de CO2, substituindo os meios diariamente.
  3. Realizar a fixação com formaldeído no vidro de cobertura com oito poços.
    CUIDADO: O formaldeído é tóxico e deve ser manuseado em exaustor químico apropriado21.
    1. Em uma capela de fumo químico, prepare soluções de formaldeído fazendo duas porções de formaldeído a 4% em PBS (livre de metanol), diluindo a primeira a uma concentração de formaldeído a 1% e a outra a formaldeído a 2% usando solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS; com Ca 2+ e Mg2+) como diluente.
    2. Retire o vidro de cobertura com câmara de cultura de oito poços da incubadora e coloque-o no exaustor de fumaça química.
    3. Lave suavemente as células com 0,5 mL de DPBS usando uma micropipeta, introduzindo lentamente o líquido ao longo da porção superior do canto de cada poço.
    4. Remova o líquido existente em cada poço extraindo-o lentamente do canto dos poços usando uma micropipeta. Usando o método de introdução de líquidos (passo 2.3.3), introduzir 0,5 mL de solução fixadora a 1% em cada poço e deixá-lo descansar por 5 min22.
    5. Remover o líquido existente em cada poço utilizando o método de extracção de líquidos mencionado no ponto 2.3.4. Usando o método de introdução de líquidos mencionado na etapa 2.3.3, introduzir 0,5 mL de solução fixadora a 2% em cada poço e deixá-lo descansar por 15 min.
    6. Usando os métodos de introdução e extração de líquidos (etapas 2.3.3 e 2.3.4), lave as células introduzindo e removendo 0,5 mL de DPBS fresco em cada poço em três instâncias separadas por 5 min cada.
  4. Execute a adição de manchas, permeabilização e mídia de montagem no vidro de cobertura com câmara de oito poços.
    1. Preparar solução de saponina a 0,1% adicionando 1 mg de saponina por ml de DPBS e vórtice suavemente para misturar23.
    2. À solução de saponina a 0,1%, adicionar duas gotas (0,1 mL) cada de um reagente faloidina corante com F-actina e um reagente Hoechst corante para núcleo por mL de solução de saponina. Mantenha a solução preparada longe da luz, cobrindo com papel alumínio24.
    3. Introduzir 0,2 mL de solução corante/permeabilizante em cada poço e cobrir o vidro de cobertura com folha de alumínio antes de deixá-lo descansar à temperatura ambiente por 30 min.
    4. Eliminar a solução corante/permeabilizante duas vezes com 0,5 mL de DPBS.
    5. Para uma melhor qualidade de imagem, adicione um meio de montagem adequado (com um índice de refração que corresponda ao óleo da objetiva do microscópio e ao vidro da tampa) nos poços.
      1. Usando uma micropipeta, introduza uma quantidade mínima de um suporte antifade suave em cada poço, garantindo que a superfície inferior esteja completamente coberta e nenhuma bolha fique presa dentro da área de imagem desejada25. Verifique a integridade da camada celular observando sob um microscópio de campo claro.
        NOTA: Células de imagem o mais rápido possível após a coloração para máxima qualidade de imagem. Se ocorrer fotobranqueamento ou se o armazenamento a longo prazo for desejado, outros meios de montagem com propriedades antifade ou de preservação de amostras podem ser usados. Observe que a mídia de montagem de cura dura distorcerá a estrutura 3D das células e, por extensão, a camada de células, de modo que a mídia de montagem de ajuste suave é preferível26.
  5. Realize imagens no vidro de cobertura com câmara de oito poços.
    1. Ajuste as configurações do microscópio confocal, incluindo potência do laser, ganho, deslocamento e parâmetros de varredura, como velocidade de varredura, área de varredura, formato de varredura, resolução e diâmetro do orifício27.
    2. Teste a localização da imagem fazendo varreduras de referência, bem como pilhas Z até que os parâmetros e condições de imagem desejados tenham sido atendidos. Parâmetros de discagem em objetivas de ampliação sequencialmente mais altas até que a objetiva de imersão em óleo de 40x tenha sido atingida e otimizada28.
    3. Construa pilhas Z de três locais aleatórios em cada correspondência de densidade de semeadura/duração da cultura.
  6. Realizar processamento de imagens e análise de dados.
    1. Exporte seções transversais XZ e YZ usando o pacote de software de microscópio confocal.
    2. Usando um software de processamento de imagem com recursos de detecção de borda (valor limite 15.0), meça a área total da imagem em pixels usando a ferramenta Varinha Mágica fora da imagem e, em seguida, a área excluindo a área transversal total da camada de célula em pixels usando a ferramenta Varinha Mágica na parte da imagem externa à camada de célula29.
    3. Usando um software de processamento de dados, subtraia o valor de pixel de área externa do valor de pixel de área total para encontrar o valor de pixel de área transversal.
    4. Converta valores de pixel de área transversal para valores de μm2 multiplicando os valores de pixel pelo quadrado do valor de μm/pixel, conforme indicado no software do microscópio para a imagem específica (0,31 μm/pixel para pilhas Z tomadas em resolução de 1024p sem zoom em uma lente de imersão em óleo de 40x).
    5. Calcule médias e desvios-padrão e resultados gráficos.

figure-protocol-3
Figura 3: Diagrama do vidro de cobertura com câmara de oito poços usado para o experimento de cultura, coloração e imagem de poço fixo, comparando os efeitos da densidade inicial de semeadura celular e da duração do cultivo na formação de camadas celulares. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método apresentado permite a visualização de camadas de células epiteliais cultivadas em canais de cultura microfluídica e utiliza como validação uma demonstração em ambientes tradicionais de cultura celular de poço fixo. As imagens adquiridas existirão em um espectro de qualidade, intensidade de sinal e especificidade do alvo celular. As imagens bem sucedidas demonstrarão alto contraste, permitindo a análise das imagens e a quantificação dos dados para posterior avaliação estatística. As imagens malsucedidas serão fra...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo apresentado descreve a cultura, fixação de reticulação, coloração, permeabilização e visualização microscópica confocal de células epiteliais pulmonares humanas NCI-H441 no ambiente dinâmico de um arranjo de fluxo microfluídico de canal único, bem como no ambiente estático de uma cobertura tradicional de oito poços. Com qualquer protocolo de cultura de células microfluídicas, as condições de fluxo do meio de cultura celular são de suma importância, pois o fluxo de alta taxa tem o potencial de lavar as células...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem a Alan Shepardson por projetar o padrão de corte para o adesivo 3M e a folha de mylar usados na construção de canais microfluídicos e por testar a taxa de fluxo do meio de cultura celular e a programação da bomba de seringa. O financiamento foi fornecido pelo NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 e Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sistema de microscópio confocal A1R HD25NikonA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagente (AlexaFluor 488 faloidina)InvitrogenR37110https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Fita Adesiva de Transferência Dupla Linered3M468MPhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
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