Desestabilização do Menisco Medial e Cartilagem Scratch Murine Modelo de Osteoartrite Acelerada

Resumo

O presente protocolo descreve os arranhões controlados da microlâmina na superfície da cartilagem articular após a desestabilização do joelho do camundongo pelo corte do ligamento miniscotibial medial. Este modelo animal apresenta uma forma acelerada de osteoartrite (OA) adequada para estudar a formação de osteófitos, osteosclerose e dor em estágio inicial.

Resumo

A osteoartrite é a doença musculoesquelética mais prevalente em pessoas com mais de 45 anos, levando a um aumento do custo econômico e social. Modelos animais são usados para imitar muitos aspectos da doença. O presente protocolo descreve o modelo de desestabilização e arranhão cartilaginoso (DD) da osteoartrite pós-traumática. Com base na desestabilização amplamente utilizada do modelo do menisco medial (DMM), o DCS introduz três arranhões na superfície da cartilagem. O presente artigo destaca os passos para desestabilizar o joelho por meio da transectação do ligamento meniscotibial medial, seguido de três arranhões superficiais intencionais na cartilagem articular. Os possíveis métodos de análise por suporte dinâmico de peso, tomografia microcomputadorizada e histologia também são demonstrados. Embora o modelo DCS não seja recomendado para estudos que se concentrem no efeito da osteoartrite na cartilagem, ele permite o estudo do desenvolvimento da osteoartrite em uma janela de tempo mais curta, com foco especial em (1) formação de osteófitos, (2) dor osteoartrítica e de lesão, e (3) o efeito do dano da cartilagem em toda a articulação.

Introdução

A osteoartrite (OA) é a doença musculoesquelética mais prevalente em pessoas com mais de 45 anos, com mais de 8,75 milhões de pessoas buscando tratamento no Reino Unido¹. A crescente prevalência da doença tem levado a um aumento do custo econômico e social, é um dos principais contribuintes para a incapacidade e reduz a qualidade de vida dos pacientes¹. Sem tratamentos disponíveis, há uma necessidade urgente de acelerar a pesquisa para entender o desenvolvimento e a progressão da doença. A doença é complexa e também multifatorial em sua natureza. As principais medidas clínicas da doença são a dor e a mobilidade articular², e a OA afeta todos os tecidos da articulação, não apenas a cartilagem³. Um dos principais desafios na compreensão da OA é que ela pode levar anos, às vezes décadas, desde a apresentação/lesão inicial até a progressão sintomática da doença com dor e imobilidade.

A modelagem da osteoartrite em roedores aprimorou nosso conhecimento da fisiopatologia da OA, permitindo-nos entender a iniciação e a progressão em um período de tempo muito mais curto e com um exame detalhado dos tecidos envolvidos. Existem inúmeros modelos murinos de osteoartrite, de animais geneticamente modificados a modelos de intervenção cirúrgica. O modelo murino de OA pós-traumática mais utilizado é a desestabilização do menisco medial (DMM)^4,5. Uma ressalva do modelo é a variabilidade entre diferentes operadores. Cirurgiões experientes podem realizar o procedimento com danos articulares mínimos, enquanto operadores inexperientes expõem a cápsula articular por longos períodos de tempo e infligem danos à cartilagem. Essa variabilidade no processo influencia a gravidade do modelo, com mais danos iniciais levando ao aumento dos escores de dano da cartilagem e à formação de osteófitos. Com a intenção de reduzir a variabilidade entre os operadores e mimetizar o dano cartilaginoso da intervenção clínica, desenvolve-se uma versão modificada desse modelo, pela qual são infligidos danos adicionais controlados na superfície da cartilagem na forma de três arranhões superficiais⁶. Isso também permite modelar a progressão da OA resultante de danos na cartilagem causados por algumas intervenções clínicas. Em comparação com o modelo DMM padrão, o dano diretamente induzido na cartilagem resulta em formação de osteófitos salientes consistentemente acelerados, aumento do dano e inflamação da cartilagem e dor substituta mensurável em camundongos machos.

Este modelo é particularmente adequado para o estudo da OA pós-traumática em estágio inicial, com foco na formação de osteófitos, apresentação de dor (em camundongos machos), sinovite e alterações precoces nos parâmetros ósseos. A consistência da formação de osteófitos nesse modelo torna pertinente o estudo do reparo ósseo e da ossificação endocondral, uma vez que a formação de osteófitos é um processo de reparo via ossificação endocondral⁷. O modelo também imita os danos introduzidos diretamente na cartilagem durante intervenções clínicas, como procedimentos cirúrgicos artroscópicos, e, portanto, também é adequado para o estudo do efeito do dano da cartilagem em toda a articulação.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Painel de Revisão Ética da Universidade de Glasgow e da Universidade do Oeste da Escócia, e realizados seguindo as diretrizes da Lei de Animais (Procedimentos Científicos) de 1986 (Reino Unido). Camundongos machos C57Bl6/J de 10 semanas de idade, pesando cerca de 25 g, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação animal

NOTA: Considere o gênero do camundongo em relação ao objetivo do estudo, pois os modelos de OA pós-traumática apresentam diferenças importantes dependendo do gênero ^8,9,10.

1. Certifique-se de que o reagente anestésico (isoflurano a 2%) está pronto.
   NOTA: A anestesia injetável também pode ser utilizada¹¹. Dada a rápida duração da cirurgia, recomenda-se o uso de anestesia inalatória.
2. Use um grupo separado de idade simulada operada como controle cirúrgico.
   NOTA: O joelho contralateral não deve ser usado como controle cirúrgico (operação simulada na perna contralateral). Isso pode ter problemas em termos de bem-estar animal e provavelmente afetará as medidas de marcha e marcha. O joelho contralateral normaliza parâmetros ósseos intrínsecos¹² e atua como uma comparação pareada nos testes de dor evocada¹³.
3. Use ratos esqueleticamente maduros.
   NOTA: A maioria da literatura induz OA às 8-12 semanas de idade. No presente estudo, os camundongos têm 10 semanas de idade.

2. Cuidados pré-operatórios (realizados por um assistente cirúrgico)

1. Se transportado de uma instalação diferente, aguarde pelo menos 1 semana antes da intervenção cirúrgica para que os ratos se ajustem ao seu novo ambiente.
2. Realize a cirurgia em uma sala estéril adequadamente designada, garantindo que todas as superfícies sejam estéreis (por exemplo, use cortinas estéreis para cobrir áreas da cirurgia).
   NOTA: A cirurgia é asséptica.
3. Organize e coloque instrumentos estéreis em cortinas estéreis.
4. Pese o mouse.
5. Induza a anestesia introduzindo o rato numa gaiola anestésica e, em seguida, introduzindo isofluorano a 2% até 15 minutos utilizando uma carreta de perfuração anestésica padrão (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A gaiola não deve ter anestesia "residual" antes de introduzir o rato.
6. Uma vez anestesiado, tire o rato da câmara anestésica e prenda o pelo sobre o joelho, os lados frontal e lateral do meio da canela até o meio da coxa com pequenos cortadores de cabelo.
   NOTA: A escolha do joelho do membro posterior depende da preferência do operador de qual lado ele acha mais fácil realizar a cirurgia. Este protocolo operava a perna esquerda.
7. Certifique-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado (não responsivo a beliscar o pé).
8. Desinfete a pele aplicando um limpador de pele antibacteriano (por exemplo, contendo clorexidina ou iodóforo, consulte Tabela de Materiais) na pele exposta raspada.
9. Para analgesia, administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea.
10. Coloque o rato no lado dorsal, deixando o joelho a ser operado para cima, e coloque o nariz do rato no bocal ligado à plataforma anestésica.
11. Cubra o rato com uma cortina estéril com uma pequena abertura de fechadura.
12. Posicione a perna a ser operada com o joelho flexionado a menos de 90°, com o ligamento patelar voltado para cima e o pé imobilizado com fita cirúrgica.

3. Desestabilização do procedimento do menisco medial seguido de arranhão cartilaginoso

1. Ajuste o microscópio para se concentrar no ligamento patelar.
2. Aperte a pele do joelho no lado lateral com pinça serrilhada (ver Tabela de Materiais), faça um pequeno corte paralelo ao tendão patelar distal usando tesoura cirúrgica, introduza a tesoura e expanda o corte para cerca de 1 cm. Deslocar a pele para o lado medial, expondo o ligamento patelar e o platô tibial proximal (Figura 1).
3. Com uma lâmina número 11, faça uma incisão ao longo do lado medial do ligamento patelar, de cima para baixo do ligamento (Figura 1A). Ao chegar ao fundo do ligamento patelar, gire a lâmina 90° e estenda a incisão para longe do ligamento patelar em direção ao lado medial para obter acesso à cápsula articular.
   NOTA: Pode ocorrer hemorragia neste ou nos passos subsequentes. Se ocorrer sangramento, use um cotonete estéril e aplique pressão por alguns segundos (5 a 30 s).
4. Aperte o ligamento patelar com pinça de ponta contundente e gire o punho para mover o ligamento patelar para o lado lateral, apenas o suficiente para expor a almofada de gordura infrapatelar (IFP).
   NOTA: Para minimizar os danos ao ligamento patelar, não segure a pinça muito apertada, apenas o suficiente para manter o ligamento ao lado.
5. Enquanto ainda segura o ligamento patelar levemente, aperte o IFP com micropinças (ver Tabela de Materiais) para elevá-lo e movê-lo ligeiramente para cima. Isso permite visualizar o ligamento do menisco medial.
6. Identificar o ligamento meniscotibial medial (MMTL) do menisco medial, que ancora o corno craniano do menisco medial ao platô tibial anterior (Figura 1B).
7. Evite danos e exposição prolongada da cartilagem no platô tibial ou côndilo femoral.
8. Corte cuidadosamente o MMTL com uma pequena tesoura de mola Vannas de lâmina de 2 mm, deixando o menisco medial e outros ligamentos intactos. Neste ponto, o procedimento cirúrgico para o modelo DMM é concluído (Figura 1C).
9. Com uma faca microcirúrgica de 3 mm, marque três reentrâncias uniformemente espaçadas na cartilagem articular tibial em uma direção da parte posterior para a anterior.
   NOTA: Os escores têm cerca de 1 mm de comprimento e danificam apenas a superfície da cartilagem (Figura 2D).
   1. Não use força excessiva com a lâmina na cartilagem (ou seja, certifique-se de que os arranhões sejam superficiais). Esta etapa adicional inflige danos à cartilagem, induzindo o modelo DCS.
10. Feche a pele com dois ou três pequenos clipes metálicos de 7 mm de fechamento de feridas ou suturas cirúrgicas subdérmicas absorvíveis de 6-0 (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: As suturas cirúrgicas subdérmicas são melhores, pois evitam mais intervenção, mas prolongam a duração da cirurgia. Suturas externas aumentam o risco de abertura da ferida pelo roer dos camundongos.
11. Identifique o ligamento meniscotibial medial do menisco medial para cirurgia simulada, mas não corte.
12. Para ratos que recebem apenas arranhões na cartilagem, faça os três arranhões superficiais sem cortar o ligamento.
    NOTA: Entre cada rato, troque as luvas e esterilize os instrumentos através de autoclave. Lembre-se de verificar se os instrumentos esfriaram antes da reutilização.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Se tiver ocorrido hemorragia (>50 uL), injete 500 μL de solução salina estéril quente por via subcutânea (na parte de trás do rato).
   NOTA: Em nossa experiência, embora os ratos tenham sangramentos menores, nunca é mais do que uma pequena gota e, portanto, os fluidos não precisam ser reabastecidos.
2. Após a cirurgia, coloque o rato em uma gaiola de recuperação em um lenço de papel limpo e permita a recuperação da anestesia (5-10 min).
3. Transfira os ratos totalmente conscientes para uma gaiola limpa com roupa de cama fresca após a cirurgia.
4. Nas 72 h após a intervenção cirúrgica, monitore quaisquer sinais de dor ou angústia. Preste atenção a:
   1. Alterações no peso corporal. Embora o peso corporal possa diminuir no primeiro e segundo dia, isso geralmente não é mais do que 5% do peso corporal pré-cirúrgico.
   2. Falta geral de higiene ou excesso de higiene ao redor da incisão.
   3. Sinais de deterioração geral da saúde, como postura curvada, caretas faciais e / ou respiração anormal.
   4. Infecção da ferida, conforme indicado por qualquer inchaço, descarga ou abertura da ferida.
      NOTA: A infecção pode ocorrer se a ferida cirúrgica se abrir. Como o reparo da ferida cirúrgica (por exemplo, substituição de clipes metálicos ausentes ou re-sutura) é um procedimento regulamentado, certifique-se de que a aprovação relevante seja obtida antes de realizar os reparos.
5. Remova os clipes de metal entre 5-7 dias após a cirurgia.
6. Manter os ratos tipicamente 2-52 semanas de pós-operatório, dependendo do desenho do estudo.
7. Avalie a dor/marcha em qualquer momento durante o estudo.
   NOTA: O presente estudo utiliza o suporte dinâmico de peso, conforme descrito na etapa 5.1.
8. Eutanasiar o animal por um método aprovado, de acordo com os acordos nacionais de licenciamento, diretrizes locais e aprovação experimental.
   NOTA: No presente estudo, os animais foram eutanasiados via exsanguinação (punção cardíaca) sob anestesia terminal seguida de luxação cervical¹⁴.

5. Avaliação da doença osteoartrítica

1. Meça a sustentação dinâmica de peso como uma medida substituta da dor seguindo as etapas abaixo.
   NOTA: Como os ratos são animais presas, eles tendem a esconder comportamentos de dor. Isso dificulta a medição da dor. Existem muitas maneiras de medir a dor evocada, como Von Frey¹⁵ e a análise da marcha¹⁶. O presente estudo mediu a carga diferencial entre a perna osteoartrítica operada e a perna controle não operada em um tapete de pressão enquanto o camundongo estava em uma gaiola (ver Tabela de Materiais, Figura 2A).
   1. Pese o mouse. Reboque e calibre o tapete de pressão de acordo com as instruções específicas do fabricante (consulte Equipamento dinâmico de suporte de peso na Tabela de materiais). Introduza o rato na gaiola.
   2. Registre o movimento e a pressão da pata do rato na gaiola por 5 min. Analise os dados adquiridos para validar 1 min, seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: A análise automatizada do fabricante no software DWB (ver equipamento dinâmico de suporte de peso na Tabela de materiais) fornece medições em cada pata proporcionalmente ao peso corporal total, a quantidade do tempo validado que cada pata permaneceu no tapete e uma estimativa da área do tapete ocupada por cada pata. Isso permite o cálculo da carga diferencial entre as duas patas traseiras, a carga diferencial entre as patas dianteira e traseira, um aumento da carga da pata dianteira (se o mesmo rato tiver sido medido ao longo de um período de tempo), o tempo gasto levantando a perna OA em comparação com a perna contralateral e a superfície da pata.
2. Quantificar tecido calcificado através de tomografia microcomputadorizada (μCT).
   NOTA: Embora a osteosclerose óssea subcondral e a formação de osteófitos possam ser medidas em cortes histológicos, a μCT oferece a oportunidade de quantificar tridimensionalmente. A resolução da captura de imagem em μCT a 5 μm é suficiente, pois permite a visualização de estruturas menores, como os osteófitos, embora quanto maior a resolução, melhor.
   1. Fixe as articulações do joelho em solução de paraformaldeído a 4% por 24 h, depois transfira para 70% de EtOH.
   2. Analise as articulações do joelho em um scanner de μCT.
      NOTA: No presente estudo, as amostras foram escaneadas em um scanner de μCT (ver Tabela de Materiais) com filtro de alumínio 0,5 ajustado a 50 kV e 200 μA. As amostras foram examinadas em um tamanho de voxel de 4,5 μm; 2 μm, ângulo de rotação de 0,2° para imagens e ângulo de rotação de 0,5° para quantificação.
   3. Reconstrua digitalizações para permitir a visualização 3D. As varreduras aqui apresentadas foram reconstruídas usando software compatível (ver Tabela de Materiais).
   4. Analise a esclerose óssea subcondral (Figura 2B) seguindo os passos abaixo.
      1. Selecione um volume de interesse (VOI) de 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm no centro da carga do platô tibial medial¹⁷.
      2. Normalize contra o fenótipo ósseo intrínseco do rato, analisando a perna não operada.
      3. Determine a densidade óssea subcondral e a microarquitetura selecionando uma região de interesse (ROI) delineando a estrutura trabecular dentro da epífise tibial, a placa subcondral ou o osso subcondral total na visão coronal bidimensional da pilha usando o software CTan (consulte Tabela de Materiais).
         NOTA: À medida que a doença progride, a separação entre a placa subcondral e a região trabecular subcondral torna-se mais difícil de distinguir. Recomenda-se então analisar a área do osso subcondral selecionada do espaço articular até a placa de crescimento.
   5. Quantificar osteófitos (Figura 2C) seguindo os passos abaixo.
      1. Identifique osteófitos nas pilhas de imagens tridimensionais reconstruídas usando o software CTvol (consulte Tabela de Materiais).
         NOTA: Os osteófitos mineralizados são saliências semelhantes ao osso tecido visível no lado medial do osso subcondral¹⁸. Um exemplo disso é indicado com setas amarelas na Figura 2C.
      2. Conte manualmente o número de osteófitos identificados no lado medial da articulação do joelho.
      3. Medir o volume de osteófitos na análise de imagens sequenciais 2D (utilizando o analisador de TC) delineando a borda dos osteófitos manualmente, projetando-se da placa subcondral como a região de interesse (ROI) para análise.
      4. Calcule a densidade óssea osteófita como a razão entre o volume ósseo e o volume osteófito usando o software analisador de TC (consulte Tabela de Materiais).
3. Avaliar o dano cartilaginoso e a sinovite (Figura 2D) de acordo com o escore de dano da cartilagem OARSI¹⁹ e o escore de sinovite²⁰ em cortes de 6 μm embebidos em parafina.
   1. Após a varredura, descalcificar as articulações do joelho em EDTA a 10% a 4 °C por um período mínimo de 2 semanas, mudando de solução duas vezes por semana.
   2. Incorporar amostras em parafina. Para tratamentos e períodos de incubação, ver Ficheiro Suplementar 1.
   3. Corte seções coronais de 5 μm de amostras embutidas em parafina em um micrótomo rotativo (ver Tabela de Materiais).
   4. Selecione seções na área onde os côndilos tibial e femoral se encontram (Figura 2D). Selecione duas seções em três áreas igualmente distanciadas da articulação.
      NOTA: As seções pontuadas no presente estudo foram selecionadas em áreas de 80-100 μm de distância.
   5. Seções de coloração com Safranin-O e verde rápido (consulte Tabela de materiais) seguindo as etapas abaixo.
      1. Desparafinizar seções submergindo-as (na sequência mencionada) em Xileno por 5 min (2x), etanol a 100% por 2 min, etanol a 95% por 2 min, etanol a 80% por 2 min e etanol a 70% por 2 min.
      2. Coloração com hematoxilina filtrada (ver Tabela de Materiais) por 30 s. Em seguida, enxágue em água da torneira por 5 min (três vezes).
      3. Lavar com tampão Scott (2 g de bicarbonato de sódio e 10 g de sulfato de magnésio em 1 L de água destilada) durante 2 min. Enxaguar em 'água da torneira' por 5 min (três vezes).
      4. Mancha por 4 min com 0,2% de verde rápido. Mergulhe em 1% de ácido acético glacial, cinco vezes (recém-feito a cada sessão). Enxaguar rapidamente em água da torneira.
      5. Coloração por 5 min com Safranin-O a 0,5%. Enxaguar em etanol a 95%. Cortes desidratados em etanol a 100% por 3 min seguidos por 3 min em xileno.
   6. Seções de pontuação conforme indicado em Glasson et al. para cartilagem¹⁹ e Jackson et al. para sinovite²⁰.
      NOTA: Existem outros métodos de quantificação, como a quantificação computadorizada por Pinamont et ^al.21.
   7. Valide o sistema de pontuação com dois marcadores diferentes, cegos para o experimento.

Resultados

A carga percentual por peso corporal total da perna traseira/OA foi comparada com a perna contralateral/controle. Embora outros parâmetros também possam dar diferenças significativas, como o aumento da carga da pata dianteira após a intervenção cirúrgica, uma mudança consistente na carga da pata traseira indica uma preferência pelo uso de uma perna sobre a outra e é um indicador mais direto de desconforto significativo para o camundongo devido ao desenvolvimento de OA. Não houve alterações significativas na carga da perna traseira no modelo DMM dentro de 8 semanas após a indução, enquanto os camundongos DCS favorecem a perna contralateral/controle significativamente 2 semanas após a intervenção (Figura 3A).

O osso subcondral foi analisado com foco no volume sob a região carregada medial do côndilo tibial. Aqui avaliamos a densidade óssea dessa área determinando a porcentagem de osso mineralizado dentro da região de interesse e calculamos a razão entre a perna contralateral e a ipsilateral. A razão indica que ambos os modelos apresentaram aumento da densidade óssea no membro acometido (razão acima de 1) 4 semanas após a indução (Figura 3B). O surgimento de osteófitos é mais proeminente no modelo DCS, onde há um aumento significativo no número e volume em comparação com o modelo DMM 2 semanas após a intervenção (Figura 3C,D). A DD apresenta lesão cartilaginosa elevada nos compartimentos tibial e femoral medial e sinovite (Figura 3E,F) 4 semanas após a indução.

Figura 1: Intervenção cirúrgica para induzir OA pós-traumática em camundongo. As imagens sequenciais representam as diferentes etapas do procedimento. (A) Exposição da cápsula articular cortando a membrana superficial ao redor do joelho inserindo uma lâmina de bisturi número 11 no lado medial do ligamento patelar e longe do ligamento. Isso irá expor a almofada de gordura infrapatelar. (B) Identificação e transecção do ligamento meniscotibial medial. Para identificar o ligamento, mova o ligamento patelar em direção ao lado lateral e, em seguida, empurre a almofada de gordura para cima. Isso permite a visualização do ligamento como uma pequena linha branca horizontal logo acima do côndilo tibial (indicado aqui com uma seta preta). Para cortar o ligamento, a lâmina inferior da tesoura da mola é colocada sob o ligamento, tomando cuidado para não danificar a cartilagem. Mova o menisco em direção ao lado medial para visualizar o côndilo tibial. (C) Coçar a superfície da cartilagem exposta e fechamento da ferida. Para arranhar a cartilagem, a microlâmina é inserida em direção ao lado posterior, onde entra em contato com a cartilagem e, em seguida, se move para a frente em direção à parte anterior da articulação. Uma vez que os arranhões são feitos, puxe a pele sobre o joelho e feche a ferida por sutura subdérmica ou com clipes de ferida. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Avaliação da osteoartrite no rato . (A) A sustentação dinâmica de peso consiste em combinar a carga num tapete de pressão com a pata correspondente. A carga é então expressa como uma porcentagem do peso total. (B) O osso subcondral é medido selecionando um volume de interesse na região de carga do côndilo tibial medial e selecionando a placa subcondral ou osso trabecular. Essas imagens estão em uma resolução de 4,5 μm. (C) Os osteófitos são identificados e quantificados em uma visão tridimensional das imagens μCT adquiridas. O volume de osteófitos é medido selecionando um ROI delineando a borda do osteófito. A densidade óssea é calculada como o volume ósseo por volume osteófito. As imagens aqui apresentadas foram obtidas a uma resolução de 2 μm, mas a quantificação é geralmente feita com uma resolução de 4,5 μm. (D) Os escores de cartilagem e sinovite são retirados de seções de 6 μm coradas com Safranin-O e Fast green. Uma seção coronal do joelho do rato onde todos os quadrantes, marcados com uma caixa preta, são visíveis para pontuação e uma ampliação do lado medial é mostrada. A sinovite que envolve o lado medial da articulação do joelho também é visível, especialmente acima e abaixo do menisco deslocado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Avaliação representativa da OA nos modelos DMM e DCS. (A) O DBD medido até 8 semanas após a indução em experimentos realizados pelo mesmo operador especialista. A carga é expressa como uma razão entre a carga operada/OA versus a carga contralateral/controle. Testes t emparelhados de ambas as pernas também são mostrados nos modelos Sham (cinza), DMM (azul) e DCS (rosa). Análise μCT 4 semanas após a intervenção cirúrgica. (B) O osso subcondral foi analisado 4 semanas após a intervenção cirúrgica e expresso como a razão entre o ipsilateral e o %BV/TV contralateral. (C) O número de osteófitos e (D) o volume de osteófitos foram analisados 2 semanas após a indução. A avaliação histológica 4 semanas após a indução do dano cartilaginoso (E) da cartilagem tibial e articular femoral medial e da (F) sinovite foi pontuada com métodos padronizados^19,20. Os dados são expressos em média ± desvio padrão, n ≥ 5. Os dados foram comparados por ANOVA de medidas repetidas com correção do teste de Šídák (A), teste t pareado (A) ou teste t de Student padrão (B-F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns = não significativo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Condição de tratamento e incubação para incorporação de parafina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Para realizar a indução cirúrgica da osteoartrite pós-traumática (POAT), o apoio de um assistente é altamente recomendado (por exemplo, para preparar os camundongos enquanto o operador se concentra na cirurgia). Isso facilita a cirurgia asséptica, reduzindo assim os riscos de infecções e tornando a intervenção mais eficiente em grandes experimentos. É fácil perder o plano de foco durante a cirurgia, portanto, um microscópio que inclua pedais para foco é uma característica valiosa para ajudar a manter a esterilidade durante toda a cirurgia. A posição do rato e do joelho é crucial. O joelho deve estar voltado para cima e suficientemente dobrado para maximizar a abertura do espaço articular do joelho, facilitando o acesso ao ligamento para a introdução da microlâmina para arranhar a superfície do côndilo. Identificar o MMTL pode ser um desafio, especialmente quando a almofada de gordura é maior do que o habitual ou há um pequeno sangramento. Para evitar sangramentos, empurre a almofada de gordura para cima para evitar lágrimas e sangramento subsequente. Se a almofada de gordura for grande, isso pode demorar um pouco mais, mas pacientemente continue a empurrá-la para cima.

O MMTL é bastante próximo ao côndilo tibial, por isso deve-se tomar cuidado para não ferir a cartilagem ao posicionar a lâmina inferior da tesoura de mola curva sob o MMTL. As lâminas curvas devem apontar para o lado medial e ligeiramente para cima, paralelas ao côndilo. Para uma melhor seccionamento do MMTL, certifique-se de que a tesoura esteja afiada. Verifique se o menisco pode se mover medialmente após o corte do ligamento, pois às vezes permanece um pequeno acessório que precisa de mais cortes. Ao introduzir a microlâmina para arranhar o côndilo, ela deve ser perpendicular ao côndilo. Faça o primeiro arranhão mais perto do meio da articulação, mas tome cuidado para não danificar o ligamento cruzado anterior. Em seguida, mova-se em direção ao lado medial e, em seguida, atrás do menisco. Os arranhões podem ser visíveis como linhas brancas fracas na cartilagem. Como costumamos usar clipes, a incisão inicial é realizada no lado lateral, de modo que os clipes são posicionados na lateral da perna após o fechamento da ferida. Isso evita que os clipes esfreguem o joelho à medida que o mouse recupera o movimento. Ao usar suturas, o uso de pontos subdérmicos é fortemente recomendado. Se estiver usando pontos externos, é provável que os ratos corram os pontos e abram a ferida, o que aumentará as chances de infecção. Quando feita corretamente, esta cirurgia não deve levar mais de 5-10 min, desde a incisão até o fechamento da ferida, minimizando assim a exposição da cartilagem e qualquer dano adicional descontrolado que possa ocorrer. Após a cirurgia, os ratos se recuperam muito rapidamente e quase imediatamente podem subir na gaiola e se mover normalmente. Se os ratos não estiverem ativos, o especialista apropriado na unidade deve ser consultado.

Para a avaliação comportamental da dor, avaliou-se a sustentação dinâmica do peso. No entanto, esse método pode ser considerado menos sensível do que outros testes de dor evocada, como o teste de von Frey¹⁵. Recomenda-se que mais de um método seja usado para monitorar e avaliar a dor. As alterações observadas 2 semanas após a intervenção na DD, embora transitórias, indicam uma carga geralmente diminuída da perna OA em comparação com a perna saudável. Portanto, 2 semanas após a intervenção da DD podem ser usadas para avaliar a dor osteoartrítica ou lesiva precoce em modelos de camundongos. A visualização de osteófitos mineralizados por μCT permite a quantificação tridimensional, que também pode ser pareada aos cortes histológicos¹², acrescentando outra dimensão ao estudo da emergência e evolução dos osteófitos. Em nosso grupo, a presença de osteófitos foi variável no modelo DMM entre e dentro dos operadores (2,3 ± 1 vs. 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), enquanto a indução de DD robustamente levou à geração de osteófitos em todos os casos, independentemente do operador (2,6 ± 0,7 vs. 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Além disso, existem significativamente mais e maiores osteófitos no modelo DCS em comparação com o DMM. Assim, a DD é um modelo ideal para o estudo da formação de osteófitos. A quantificação da osteosclerose limitada à área de carga do osso subcondral também é uma melhora na detecção de pequenas alterações. A comparação do compartimento medial da perna operada com a perna contralateral também oferece uma maneira de normalizar contra o fenótipo ósseo intrínseco desse camundongo em particular¹². A adição dos arranhões de cartilagem no modelo DCS é um meio controlado de induzir danos na cartilagem focada durante a cirurgia que acelera muitos dos aspectos da doença. Uma das consequências do procedimento experimental envolvendo danos intencionais à própria cartilagem é que esse dano artefactual precisa ser excluído ou ajustado no sistema de classificação da cartilagem. Devido a essa limitação, não recomendamos este modelo se o principal objetivo do estudo é entender o efeito da osteoartrite na própria cartilagem. Finalmente, também é altamente recomendável ter pelo menos dois pontuadores cegos classificando os escores de dano na cartilagem e sinovite. Isso valida e aprimora a padronização dos sistemas de pontuação.

Uma limitação deste estudo é que a extensão da variabilidade entre todos os parâmetros que compararam os modelos DCS e DMM não foi totalmente avaliada. Esta questão será abordada no futuro com estudos mais aprofundados, que poderão também incluir uma avaliação da variabilidade entre operadores de diferentes instituições.

Em conclusão, a patogênese acelerada da OA no atual modelo de DCS permite a representação da OA pós-traumática e fornece uma ferramenta de pesquisa poderosa e robusta para investigar e elucidar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes da OA que impulsionam essa doença articular crônica debilitante. Além disso, permite que a OA seja explorada em uma janela de tempo mais curta, concentrando-se na osteofitogênese, na dor da OA e no efeito do dano da cartilagem em toda a articulação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#11 lâmina de bisturi (e cabo de bisturi).	Instrumentos de precisão mundiais	500240	acessam a cápsula articular
15° Faca de facada microcirúrgica de ângulo de corte	MSP	REF7503	arranhar a cartilagem
6-0 vicryl rapide	Qualquer fornecedor de suprimentos médicos	-	método alternativo para fechar feridas
Equipamento anestésico	Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-
Pinça de pele antibacteriana (Hibiscrub)	Amazon-Para	esterilizar a área cirúrgica da pele
Aplicador para clipes de 7 mm	Instrumentos de precisão mundial	500343	fechar a ferida
Equilíbrio	Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-	Para pesar o rato
Pinça curva sem corte	Ferramentas de ciências finas	500232	mover o ligamento patelar para o lado
Buprenorfina (Vetergesic)	Fornecido pela unidade, pois é um medicamento prescrito-Analgesia
CT analyser	Bruker	3d. Software SUITE
Software Ctvol	Bruker	3D. Software Software
Visualizador de dados	Bruker	3D. Software Software
Equipamento dinâmico de suporte de peso	Bioseb	BIO-DWB-DUAL	Meça a carga do membro e tem gaiola, fosco de pressão e software para análise
EDTA	Merck	E9884	Solução a 10% em PBS (ou água) para descalcificar o osso pH 7,4
Etanol	Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-	para incorporar ossos descalcificados
Fast Green FCF	Merck	F7252	Para seções de coloração
Ácido acético glacial	Merck	1005706	Para seções de coloração
hematoxilina	Merck	GHS132	Coloração nuclear em seções de parafina.
Pinças Hoskins #21.	Cameron cirúrgico limitado	PHF1085	mover a almofada de gordura
Isofluorano	Fornecido pela unidade, pois é um medicamento prescrito	-
Ratos	Charles		river-C57Bl6 / J macho 8 semanas de idade (para permitir a aclimatação na unidade)
Scanner de tomografia computadorizada	Bruker	SKYSCAN 1272 CMOS&	micro;
Fita de papel cirúrgico CT Micropore	FisherScientific	12787597	manter a perna na posição
Cera de parafina	Genérica (muitos fornecedores diferentes)	-	para incorporar ossos descalcificados
Reflex 7 mm clipes de aço inoxidável ou	ferramentas de ciência fina	12032-07	fecham a ferida
Removedor para clipes de 7 mm Instrumentos	de precisão mundial	500347	remover clipes de ferida
Micrótomo Rotativo	Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-	Para cortar a seção de tecido embebido em parafina.
Safranin-O	Merck	S2255	Para seções de coloração
Pinça curva serrilhada	Ferramentas de ciência fina	15915	seguram a pele
Campo estéril	Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-	Para garantir a esterilidade da área cirúrgica
Campo estéril com orifício de fechadura	Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-	Para cobrir o rato e expor a perna
Solução salina estéril	Genérico (muitos fornecedores diferentes)
Campo cirúrgico estéril	Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-	manter o ambiente estéril para ferramentas cirúrgicas
Campo cirúrgico estéril com orifício	de fechadura Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-	cobrir o mouse e manter a perna através do orifício da fechadura
Tesoura reta	Instrumentos de precisão mundiais	14393	abrem a ferida
Microscópio cirúrgico.	Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-	Foco ajustável.
Tesoura de mola Vannas com lâminas de 2 mm.	As ferramentas de ciência fina	15000-04	cortam o MMTL
Xileno	Genérico (muitos fornecedores diferentes)	-	para incorporar ossos descalcificados