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Artigo de método

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

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DOI:

10.3791/64172

⸱

16 de junho de 2022

 ,  ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2The University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O pintinho é um organismo modelo econômico, acessível e amplamente disponível para uma variedade de estudos. Aqui, uma série de protocolos é detalhada para entender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e regeneração do ouvido interno das aves.

Resumo

O ouvido interno percebe o som e mantém o equilíbrio usando a cóclea e o vestíbulo. Ele faz isso usando um tipo de célula mecanossensorial dedicada conhecida como célula ciliada. A pesquisa básica no ouvido interno levou a uma compreensão profunda de como as células ciliadas funcionam e como a desregulação pode levar à perda auditiva e vertigem. Para esta pesquisa, o mouse tem sido o sistema modelo proeminente. No entanto, os ratos, como todos os mamíferos, perderam a capacidade de substituir as células ciliadas. Assim, ao tentar entender as terapias celulares para restaurar a função do ouvido interno, estudos complementares em outras espécies de vertebrados poderiam fornecer mais insights. O epitélio auditivo de aves, a papila basilar (PA), é uma folha de epitélio composta por células ciliadas mecanossensoriais (HCs) intercaladas por células de suporte (SCs). Embora a arquitetura anatômica da papila basilar e da cóclea de mamíferos difiram, os mecanismos moleculares do desenvolvimento da orelha interna e da audição são semelhantes. Isso torna a papila basilar um sistema útil não apenas para estudos comparativos, mas também para entender a regeneração. Aqui, descrevemos técnicas de dissecação e manipulação para o ouvido interno da galinha. A técnica mostra métodos genéticos e de inibição de moléculas pequenas, que oferecem uma ferramenta potente para estudar os mecanismos moleculares do desenvolvimento do ouvido interno. Neste trabalho, discutimos em ovo-eletroporação técnicas para perturbar geneticamente a papila basilar utilizando deleções CRIPSR-Cas9, seguidas de dissecção da papila basilar. Também demonstramos a cultura de órgãos da PA e o uso ideal das matrizes de cultura, para observar o desenvolvimento do epitélio e das células ciliadas.

Introdução

A orelha interna de todos os vertebrados é derivada de um epitélio simples conhecido como placode ótico 1,2. Isso dará origem a todos os elementos estruturais e aos tipos de células necessários para transduzir a informação mecanossensorial associada à audição e à percepção de equilíbrio. As células ciliadas (HCs), o sensor ciliado do ouvido interno, são cercadas por células de suporte (SCs). Os HCs transmitem informações para o rombencéfalo auditivo através dos neurônios do oitavo nervo craniano. Estes também são gerados a partir do placode ótico3. A transdução primária do som é realizada na superfície apical do HC auditivo, através de um feixe capilar mecanicamente sensível4. Isso é mediado por meio de saliências modificadas à base de actina chamadas estereocílios, que são dispostas em um padrão de escada graduada5. Além disso, um cílio primário modificado, chamado de cinocílio, organiza a formação de feixes capilares e é adjacente à fileira mais alta de estereocílios 6,7,8. A arquitetura dos estereocílios é fundamental para esse papel na conversão de estímulos mecânicos derivados da energia acústica em sinais neurais elétricos9. Danos à HC auditiva por envelhecimento, infecção, trauma otoacústico ou choque ototóxico podem resultar em perda auditiva parcial ou completa que, em mamíferos, é irreversível10.

Terapias de substituição celular têm sido propostas que podem reparar tais danos11,12. A abordagem desta pesquisa tem sido compreender o desenvolvimento normal da célula ciliada de mamíferos e perguntar se os programas de desenvolvimento podem ser reiniciados em células semelhantes a progenitores que possam existir dentro da orelha interna13. Uma segunda abordagem tem sido olhar para fora dos mamíferos, para vertebrados não mamíferos nos quais ocorre regeneração robusta das células ciliadas auditivas, como as aves14,15. Em aves, a regeneração das células ciliadas ocorre predominantemente através da desdiferenciação de uma célula de suporte para um estado semelhante ao de progenitor, seguida de divisão mitótica assimétrica para gerar uma célula ciliada e uma célula de suporte16. Além disso, a diferenciação direta de uma célula de suporte para gerar uma célula ciliada também tem sido observada17.

Embora os mecanismos de desenvolvimento auditivo aviário mostrem semelhanças significativas com os dos mamíferos, existem diferenças18. A diferenciação de HC e SC na PA do pintinho é aparente a partir do dia embrionário (E) 7, tornando-se mais distinta ao longo do tempo. Por E12, uma papila basilar (PA) bem padronizada e bem polarizada pode ser visualizada, e por E17 células ciliadas bem desenvolvidas podem ser vistas19. Esses pontos de tempo fornecem janelas para os mecanismos de diferenciação, padronização e polaridade, bem como a maturação das células ciliadas. Entender se tais mecanismos são conservados ou divergentes é importante, pois eles fornecem insights sobre a homologia profunda das origens das células ciliadas mecanossensoriais.

Aqui, demonstramos uma série de técnicas realizadas em estágios embrionários iniciais e tardios para estudar processos celulares, como proliferação, especificação de destino, diferenciação, padronização e manutenção ao longo do desenvolvimento do órgão do ouvido interno. Isso complementa outros protocolos de compreensão do desenvolvimento da orelha interna em cultura de explante20,21,22. Primeiro, discutimos a introdução de DNA ou RNA exógeno em precursores da PA dentro do otocisto E3.5 usando na ovo-eletroporação. Embora as manipulações genéticas possam fornecer informações valiosas, os fenótipos assim gerados podem ser pleiotrópicos e, consequentemente, confusos. Isto é particularmente verdadeiro durante o desenvolvimento posterior do ouvido interno, onde processos fundamentais, como o remodelamento citoesquelético, desempenham múltiplos papéis na divisão celular, morfogênese tecidual e especialização celular. Apresentamos protocolos de inibição farmacológica em explantes cultivados, que oferecem vantagens no controle da dosagem e do tempo e duração do tratamento, oferecendo manipulação espaço-temporal precisa dos mecanismos de desenvolvimento.

Diferentes métodos de cultura de órgãos podem ser utilizados, dependendo da duração do tratamento de pequenos inibidores. Aqui demonstramos dois métodos de cultura de órgãos que permitem insights sobre a morfogênese epitelial e a especialização celular. Um método para cultura 3D usando colágeno como matriz para cultivar o ducto coclear permite a cultura robusta e a visualização ao vivo da PA em desenvolvimento. Para a compreensão da formação de estereocílios, apresentamos um método de cultura de membrana de tal forma que o tecido epitelial seja cultivado em uma matriz rígida, permitindo que as saliências de actina cresçam livremente. Ambos os métodos permitem o processamento a jusante, como imagens de células vivas, imuno-histoquímica, microscopia eletrônica de varredura (MEV), gravação celular, etc. Essas técnicas fornecem um roteiro para o uso efetivo do pintinho como um sistema modelo para entender e manipular o desenvolvimento, maturação e regeneração do epitélio auditivo aviário.

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Protocolo

Protocolos envolvendo a aquisição, cultura e uso de ovos de galinha fertilizados e embriões não eclodidos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal Institucional do Centro Nacional de Ciências Biológicas, Bengaluru, Karnataka.

1. Na eletroporação de ovoporação de precursores auditivos de pintos

  1. Projeto de sgRNA e clonagem para knockout do gene CRISPR/Cas9
    1. Para criar nocautes de genes, o projeto guia RNAs para interromper as regiões éxons do gene, de preferência mais perto da extremidade 5' da região codificadora.
    2. Selecione os potenciais RNAs guia usando uma ferramenta web CRISPOR23. Defina os dados do navegador como Gallus gallus e a sequência de motivos adjacentes do protoespaçador (PAM) como 5'- NGG -3'. O programa determina os RNAs de guia a partir da sequência de entrada e atribui pontuações diferentes com base na atividade no alvo e fora do alvo. Selecione os quatro principais guias para estudos adicionais.
    3. Para o projeto de oligos específicos do modelo para a produção de RNA do guia (g), remova a sequência PAM (5′- NGG -3′) da saída da ferramenta de projeto do gRNA. Isso não é necessário para a segmentação, mas contém a sequência de reconhecimento de clivagem Cas9. Sintetizar dois oligos complementares purificados por HPLC com local de restrição de BsmBI em ambas as extremidades, para cada potencial gRNA.
    4. Clone a sequência guia em quadro com um andaime de tracrRNA de um vetor de escolha (aqui, pcU6_1sgRNA vetor foi utilizado24).
    5. Dissolver os oligonucleotídeos de sgRNA a uma concentração de 100 μM em água isenta de DNase/RNase. Realizar o recozimento das duas guias oligo sense e antisense usando um termociclador com os seguintes parâmetros: 95 °C por 3 min, depois 37 °C por 15 min e, em seguida, diminuir para 4 °C.
    6. Usando técnicas padrão de biologia molecular, conforme descrito em25, a digestão de restrição de configuração dos oligos recozidos e pcU6_1sgRNA vetor de clonagem com a enzima BsmBI durante a noite. Ajuste a ligadura com o vetor de pcU6_1sgRNA linear BsmBI digerido por gel e oligos de sgRNA digeridos. Transformar-se em uma célula competente DH5-alfa e sequência confirmar o clone obtido.
  2. Manuseamento e janelas de ovos
    1. Procure ovos recém-postos e limpe-os limpando-os com etanol a 70% para evitar a contaminação. Incubar a 37-38 °C, com 45% de umidade por 3,5-4 dias.
    2. Após a incubação, coloque o ovo de lado por pelo menos 5 minutos antes de abrir. Isso permite que o embrião se reposicione no topo da gema. Use fórceps para fazer pequenos orifícios na parte superior e na extremidade romba do ovo, de modo que uma agulha 21G possa passar.
    3. Para evitar danos durante a janela, remova a albumina para abaixar o embrião para longe da casca. Para fazer isso, use uma seringa de 5 mL e uma agulha 21G para extrair cuidadosamente 2 mL de albumina de um orifício na extremidade contundente do ovo. Use fita adesiva transparente para cobrir o orifício na extremidade contundente.
    4. Para fazer a janela do ovo, afixe fita adesiva no topo da casca do ovo. Corte uma janela, com cerca de 2 cm de comprimento e 1,5 cm de largura, usando uma tesoura de arco de mola e exponha o embrião. Use fórceps para abrir as membranas coriônicas que recobrem o embrião, permitindo o acesso ao embrião.
  3. Plasmídeos de microinjeção
    1. Para o experimento de knockout de genes, prepare duas soluções: a mistura knock-down contendo a proteína SpCas9 e o plasmídeo guia - pcU6_1sgRNA, e a mistura de plasmídeo traçador de T2K-eGFP (este é um de GFP de condução de chick ß-actin conduzindo GFP cercado pelos locais de transposon de Tol2) juntamente com o T2TP (a transposase de Tol2 clonada na construção de Tol226,27). O traçador é usado para rastrear a eficiência da eletroporação.
    2. Ao eletroporar múltiplos plasmídeos, certifique-se de que a concentração final de DNA seja de pelo menos 4 μg/μL. Misture as três construções, plasmídeo guia - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP e T2TP, em uma proporção de 1:1:1 com 1 μg de proteína SpCas9, 30% de sacarose e 0,1% de corante Fast Green em um volume final de 10 μL.
    3. Puxe as agulhas para microinjeção dos capilares de vidro padrão (comprimento 3 pol, OD 1,0 mm) usando um puxador de pipeta vertical. Use pinça fina para quebrar a ponta capilar após a tração para obter um diâmetro da ponta de aproximadamente 50 μm com uma extremidade cônica.
    4. Coloque os embriões em E3.5 no lado esquerdo com a cabeça voltada para a direita. Desta forma, apenas a vesícula ótica direita é acessível para micro-injeção. Micro-injete a mistura knock-down na vesícula ótica. Injete cerca de um volume de 200 nL de mistura de solução de DNA para encher a vesícula ótica.
    5. Determinar a eficiência da guia usando um ensaio de endonuclease T728.
  4. Eletroporação
    1. Adicione algumas gotas de solução salina a 0,719% em cima do embrião antes da eletroporação para diminuir a resistência elétrica e evitar o superaquecimento do embrião.
    2. Coloque o eletrodo positivo através do orifício feito no lado rombudo do ovo quando a albumina foi removida. Manobrar o eletrodo para que ele fique sob a gema. Coloque o eletrodo negativo sobre o otocisto cheio.
    3. Use eletroporação para transfectar plasmídeos para as células do embrião. Use um gerador de pulso quadrado e aplique cinco pulsos de 25 V e 100 ms de duração cada, separados por 50 ms. Determine as condições empiricamente com base em uma configuração de eletroporação individual.
    4. Hidrate o embrião após a eletroporação adicionando algumas gotas de solução salina a 0,719%. Para limpar a albumina desnaturada da superfície dos eletrodos, enxágue-a completamente com água destilada. Voltar a selar o ovo com fita adesiva e regressar à incubadora humidificada a 37-38 °C para posterior incubação.
      NOTA: Os embriões podem ser cultivados até a eclosão após a eletroporação, no entanto, há uma redução acentuada na viabilidade.

2. Dissecção da papila basilar

  1. Use etanol a 70% para desinfetar a mesa cirúrgica, o estágio do microscópio e a área circundante. O calor ou o álcool esterilizam equipamentos de microdissecação que incluem tesouras de arco de mola mínimas, microcurette e dois pares de pinças finas.
  2. Prepare as seguintes placas de dissecação: uma placa de Petri de vidro com uma base de silício preto, uma placa de Petri de plástico de 90 mm e uma placa de Petri de 60 mm. Resfrie a solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou a Solução Salgada Balanceada de Hanks (HBSS) para dissecações.
  3. Quebre suavemente o ovo na placa de Petri de 90 mm. Identifique a orelha externa do pintinho. Decapitar o embrião cortando o pescoço logo abaixo do nível da mandíbula inferior usando uma tesoura. Transfira a cabeça para uma placa de Petri de 60 mm cheia de PBS gelada.
  4. Oriente o embrião com a parte superior do bico voltada para o experimentador e segure o bico usando uma das pinças #5. Retire os olhos usando o segundo fórceps #5. Indo de rostral para caudal, corte o crânio ao longo de sua linha média. Tire o cérebro.
  5. Adicione mais PBS ou HBSS gelado e localize as duas estruturas brilhantes, perto do nível do pavilhão auricular. Estes são os otólitos da lagena no final do ducto coclear e são encontrados perto da linha média.
  6. Corte aproximadamente entre as duas lagenas, e bem acima e abaixo desta região para isolar duas orelhas internas. Sob iluminação oblíqua, visualize o contorno do ouvido interno. Remova o tecido estranho e o vestíbulo.
  7. Transfira a cóclea isolada para uma placa de base de silicone preto com PBS gelado. Usando pinça # 5, descasque a cápsula coclear cartilaginosa para obter o ducto coclear. Localize a camada ondulada (tegmento) do ducto coclear e remova usando pinça #55 para expor a PA. Usando pinça #55, remova a membrana tectorial para expor HCs e SCs.

3. Cultura de explantes de papila basilar

  1. Cultura de membrana da PA
    1. Pegue uma placa de cultura de tecido de seis poços e organize uma inserção de membrana de cultura por poço.
    2. Recolher a papila basilar dissecada (explante) numa pipeta de 200 μL com 1x tampão HBSS e transferi-la para uma membrana. Para evitar que o tecido grude na parede da pipeta, desenhe alguns meios antes de aspirar o tecido.
    3. Oriente o explante de tal forma que a papila basilar esteja voltada para cima, de modo que o cabelo e as células de suporte sejam visíveis a partir do topo29. Uma vez que o explante esteja posicionado, aspirar o tampão HBSS lentamente da superfície da membrana de cultura. Neste processo, o explante se ligará à membrana de cultura.
    4. Adicione 1,2 mL do meio de cultura Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco entre a inserção da membrana e a parede do poço para encher os poços da placa de seis poços. Até seis explantes podem ser cultivados em uma única membrana de cultura de 30 mm.
  2. Cultura de colágeno do ducto coclear
    1. Prepare a mistura de colágeno adicionando 400 μL de 3 mg/mL de colágeno de cauda de rato, 50 μL de 10x DMEM, 30 μL de 7,5% de NaHCO3 e 5 μL de HEPES em um exaustor de cultura de tecidos.
    2. Pegue um prato de quatro poços e adicione três gotas de mistura de colágeno em cada poço. Transfira o ducto coclear dissecado para cada gota de colágeno. Incubar a placa por 10 min a 37 °C, 5% de CO2 para curar a matriz de colágeno.
  3. Tratamento de pequenas moléculas de culturas
    1. Preparar meios de cultura (DMEM, suplemento de N-2, penicilina) com o modulador farmacológico ou seu solvente sozinho (para uso como controle). Substitua o meio de cultura por 700 μL de meio suplementado com o inibidor. Cultivar os explantes em incubadora a 37 °C, 5% de CO2.
    2. Substitua 50% da mídia cultural todos os dias. Após o tempo de incubação adequado, remova o meio de cultura e utilize os explantes para ensaios a jusante.

4. Imagem e análise

  1. Análise imunofluorescente
    1. Remova os meios de cultura dos poços e lave os explantes duas vezes com 1x HBSS. Usando uma pipeta, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) ao poço e incube por 20 min à temperatura ambiente.
    2. Retire o PFA e lave os explantes três vezes com 1x PBS à temperatura ambiente. Para coletar os explantes da membrana de cultura, faça um pequeno corte ao redor da membrana contendo o pedaço do tecido usando uma pequena tesoura de arco de mola e transfira o tecido junto com a membrana para uma placa de cultura de 48 poços usando pinça.
      NOTA: Se os tecidos estiverem flutuando após a fixação, aspirar com uma pipeta de 200 μL e transferi-la para placas de 48 poços para processamento adicional. Evite o descolamento forçado do tecido da membrana.
    3. Para a cultura de gotículas de colágeno, use fórceps para transferir toda a gota de colágeno para uma placa de silício. Adicione 200 μL de 1x PBS e remova o colágeno com a ajuda de fórceps e, em seguida, transfira o tecido para uma placa de cultura de 48 poços.
    4. Permeabilizar os explantes com 1 mL de 1x PBS suplementado com Tween-20 a 0,3% (PBST) por 30 min à temperatura ambiente. Incubar os explantes com 200 μL de tampão bloqueador (10% de soro de cabra + 1% de albumina sérica bovina em PBST) por 1 h à temperatura ambiente.
    5. Incubar os explantes com 200 μL de solução de anticorpos primários (1:300, em tampão de bloqueio) durante a noite a 4 °C. Retire a solução primária de anticorpos e lave bem os explantes 5 x 20 min com PBST.
    6. Incubar os explantes com 200 μL de faloidina e solução de anticorpos secundários (em tampão de bloqueio) por 1 h à temperatura ambiente no escuro. Retire a faloidina e a solução de anticorpos secundários e lave bem os explantes 5 x 20 min com PBST.
      NOTA: A concentração secundária de anticorpos e o comprimento de lavagem devem ser determinados para cada aplicação individual de imagem. Para imagens usando microscopia de super resolução, normalmente aumentamos a concentração do anticorpo secundário de 1:500 para 1:200 e aumentamos a concentração de faloidina de 1:400 para 1:200.
    7. Incubar os explantes com uma solução de DAPI (1:1000 em PBST) durante 15 min à temperatura ambiente. Retire a solução DAPI e lave os explantes 3 x 5 min com PBST.
    8. Use o meio de montagem para montar explantes em uma lâmina com a pressão arterial voltada para cima (contra a tampa). Para imagens confocais, use meios de montagem antifade. Deixe o meio de montagem secar durante a noite à temperatura ambiente no escuro. Escreva a imagem diretamente ou armazene os slides a 4 °C até a geração de imagens.
  2. Fixação ototo para análise de MEV
    1. Prepare todas as soluções frescas e manuseie de acordo com as diretrizes de segurança locais. Fixar explantes cultivados por membrana (a partir da etapa 4.1.4) em glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,3) com CaCl2 3 mM. Efectuar a fixação a 4 °C durante 24 a 72 h com uma mudança de fixador a cada 24 h.
    2. Retire o fixador e lave o tecido com cacodilato de sódio 0,1 M 3 x 5 min à temperatura ambiente. Fixação secundária com 1% de OsO 4 (diluído a partir de um estoque de OsO 4a 4% usando tampão de cacodilato de sódio 0,1 M) por 1 h à temperatura ambiente. Execute esta e as etapas subsequentes até a desidratação em um exaustor.
    3. Enxaguar com tampão de cacodilato de sódio 0,1 M 3 x 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, enxaguar em água duplamente destilada ou ultrapura 3 x 5 min à temperatura ambiente.
    4. Preparar uma solução a 0,5% de tiocarbohidrazida (TCH) em água ultrapura. Agitar a 75 °C durante 10 min e filtrar a solução quando esta tiver arrefecido à temperatura ambiente.
      NOTA: O TCH é extremamente perigoso. O uso deve ser aprovado pelo comitê de segurança local e deve-se tomar cuidado ao manusear.
    5. Remova a água ultrapura da amostra e adicione 0,5% de TCH gota a gota. Se a solução ficar castanha, pare e lave a amostra com água ultrapura, antes de adicionar cuidadosamente a solução de TCH a 0,5%. Quando a solução estiver limpa, substitua-a por 0,5% de TCH. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min30,31.
    6. Enxaguar a amostra com água ultrapura 3 x 5 min à temperatura ambiente. Repita as etapas 4.2.2, 4.2.3 e 4.2.5 mais duas vezes, terminando com a incubação de OsO4 seguida de enxágue.
    7. Desidratar as amostras em uma série de etanol para etanol 100% anidro (EtOH). Incubar primeiro em 25% ETOH por 10 min, depois 50% ETOH por 10 min, 75% EtOH por 10 min, 95% ETOH por 10 min, antes de incubar por um total de 3x por 10 min cada em 100% ETOH.
    8. Realizar secagem por ponto crítico utilizando COlíquido 2. Monte imediatamente as amostras em um stub SEM com fita adesiva de carbono de dupla face. Prossiga para o revestimento de esguicho para fornecer 5-10 nm de revestimento. Se não houver imagens imediatas, armazene as amostras em um exsicador sob vácuo.

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Resultados

Na configuração de eletroporação, o posicionamento do eletrodo pode desempenhar um papel no domínio da transfecção. O eletrodo positivo é colocado sob a gema e o negativo acima do embrião (Figura 1A). Isso resulta em maior expressão de GFP em grande parte da orelha interna e em ambos os órgãos vestibulares (Figura 1B) e na papila basilar auditiva (Figura 1C,D), confirmando a transfecção.

...

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Discussão

O pintinho é uma adição econômica e conveniente aos organismos modelo que um laboratório pode usar para pesquisar o ouvido interno. Os métodos descritos aqui são rotineiramente usados em nosso laboratório e complementam a pesquisa em andamento no ouvido interno dos mamíferos. No ovo, a eletroporação é usada para introduzir manipulações genéticas no genoma do pintinho. A eletroporação também pode ser usada para introduzir construtos que codificam proteínas fluorescentes direcionadas a organelas ou estruturas subc...

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Divulgações

Os autores não têm interesses concorrentes a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio do NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB e do Royal National Institute for the Deaf. Gostaríamos de agradecer à Organização Central de Desenvolvimento Avícola e ao Instituto de Treinamento, Hesaraghatta, Bangalore. Somos gratos ao CIFF e ao apoio laboratorial e às instalações do EM no NCBS. Agradecemos a Yoshiko Takahashi e Koichi Kawakami pelas construções Tol2-eGFP e T2TP, e a Guy Richardson pelo HCA e anticorpo G19 Pcdh15. Somos gratos aos membros da Earlab por seu apoio constante e feedback valioso sobre o protocolo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 488 FaloidinaThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 647 FaloidinaThermo Fisher ScientificA22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 TecnologiasDNA Integradas1081061Proteína Cas9 de alta fidelidade
Anticorpo anti-GFPAbcamab290Coelho policlonal para soro bovino GFP
AlbuminaSigma-AldrichA9647
Cloreto de cálcio di-hidratadoThermo Fisher ScientificQ12135
Colágeno I, cauda de ratoThermo Fisher ScientificA1048301
Secador de ponto crítico Leica EM CPD300Leica
CUY-21 EletroporadorNepageno
Dimetilsulfóxido (DMSO)Microscópio de Campo Amplo Sigma-AldrichD8418
DM5000BLeica
DMEM, glicose alta, suplemento GlutaMAX, piruvatoThermo Fisher Scientific10569010
Dumont #5 FórcepsFine Science Tools11251-20
Dumont #55 FineScience Tools11255-20
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252
FluoroshieldSigma-AldrichF6182
FLUOVIEW 3000 Microscópio de varredura a laserOlympus
Glutaraldeído (25%)Sigma-Aldrich340855
Cabra anti-Mouse IgG Secundário, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11001
Cabra anti-Mouse IgG Secundária Anticorpo, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
Anticorpo secundário anti-coelho IgG de cabra, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
Soro de cabra filtrado estérilHiMediaRM10701
salina balanceada de Hanks inativada por calor (HBSS)Thermo Fisher Scientific14025092
LSM980 Airyscan MicroscópioZeiss
Millicell Cell Cell Culture Insert, 30 mm, PTFE hidrofílico, 0.4 µ mSigma-AldrichPICM03050
MVX10 Microscópio EstéreoOlympus
MYO7A anticorpoDSHB138-1monoclonal de camundongo para miosina não convencional-VIIa
MZ16Leica
N-2 (100X)Tesoura Thermo Fisher Scientific17502048
Noyes, 14cm (5,5' ')World Precision Instruments501237
tetróxido de ósmio (4%)Sigma-Aldrich75632
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127
PC-10 ExtratorNarishige
pcU6_1sgRNAAddgene92395Mini vetor com frango modificado U6
promotor Penicilina G salde sódioSigma-AldrichP3032
Fosfato Tampolado Salino (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
SMZ1500 Microscópio de dissecaçãoTampão
, 0.2MMicroscopia Eletrônica Ciências11652
Sódio cloretoHiMediaGRM853
Sputtre Coater K550XEmitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, Sem FilamentoWorld Precision Instruments1B100-3
SucroseSigma-Aldrich84097
O MERLIN Compact VPZeiss
ThiocarbohydrazideAlfa AesarL01205
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379
de Solução Microscópio de dissecação Suplemento de Cacodilato de Sódio Nikon

Referências

  1. Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).
  2. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
  3. Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
  4. Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142(2019).
  5. Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
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