Culturas organotípicas de explantes da retina de macacos

Resumo

Explantes retinianos obtidos de macacos selvagens foram cultivados in vitro. A degeneração retiniana e a via de sinalização GMPc-PKG foram induzidas com o uso do inibidor de PDE6 zaprinast. O acúmulo de GMPc nos explantes em diferentes concentrações de zaprinast foi verificado por imunofluorescência.

Resumo

A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras. A superativação da via da proteína quinase dependente de guanosina monofosfato (GMPc) cíclica (PKG) em células fotorreceptoras causa morte celular fotorreceptora, especialmente em modelos que abrigam mutações na fosfodiesterase 6b (PDE6b). Estudos prévios sobre DR utilizaram principalmente modelos murinos, como camundongos rd1 ou rd10 . Dadas as diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, é importante entender até que ponto as retinas de primatas e roedores são comparáveis. Os macacos compartilham um alto nível de semelhança genética com os seres humanos. Portanto, macacos selvagens (com idade entre 1-3 anos) foram selecionados para o cultivo in vitro de explantes da retina que incluíram o complexo retina-epitélio pigmentar da retina (EPR)-coroide. Esses explantes foram tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast para induzir a via de sinalização GMPc-PKG e simular a patogênese da DR. O acúmulo de GMPc e a morte celular em explantes de retina de primatas foram posteriormente verificados usando imunofluorescência e o ensaio TUNEL. O modelo de retina de primatas estabelecido neste estudo pode servir para estudos relevantes e efetivos sobre os mecanismos da DR dependente de GMPc-PKG, bem como para o desenvolvimento de futuras abordagens de tratamento.

Introdução

A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras e causada por mutações em uma grande variedade de genes patogênicos1. O resultado final da DR é a perda da visão e, na grande maioria dos casos, a doença permanece intratável até hoje. Portanto, é importante estudar os mecanismos celulares que levam à morte dos fotorreceptores usando modelos que representem fielmente a condição da doença humana. Aqui, os modelos baseados em primatas são de particular interesse devido à sua proximidade com os humanos. Notadamente, tais modelos podem avançar no desenvolvimento de inter....

Protocolo

O estudo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Instituto de Zoologia da Academia Chinesa de Ciências (IACUC-PE-2022-06-002), e revisão de ética animal e protocolo animal da Universidade de Yunnan (YNU20220149).

1. Preparação de explantes de retina

1. Obter globos oculares de primatas de macacos selvagens, com idades entre 1 e 3 anos de idade, armazenar em solução de armazenamento de tecidos e transportá-los no gelo dentro de 3 h após a enucleação após o sacrifício dos macacos ou após a morte natural.
2. Para a preparação da solução de proteinase K, dissolver 25 mg de proteinase K em....

Resultados

Neste estudo, a cultura de explantes de retina de macacos macacos foi realizada utilizando explantes contendo o complexo retina-EPR-coróide (Figura 1, Figura Suplementar S1). Em comparação com a cultura in vitro de células da retina usando a retina sem o EPR e a coroide anexados, nossa cultura de explantes facilita uma melhor sobrevivência celular e, consequentemente, prolonga a sobrevivência das células fotorreceptoras.

Foram utilizadas .......

Discussão

A fototransdução visual refere-se ao processo biológico pelo qual os sinais luminosos são convertidos em sinais elétricos por células fotorreceptoras dentro da retina do olho. As células fotorreceptoras são neurônios polarizados capazes de fototransdução, e existem dois tipos diferentes de fotorreceptores denominados bastonetes e cones após as formas de seus segmentos externos. Os bastões são responsáveis pela visão escotópica e os cones são responsáveis pela visão fotópica e de alta acuidade. A DR hereditária relaciona-.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	B2064	Solução de bloqueio
Corticosterona	Sigma	C2505	Suplementos de
DL-tocoferol	Sigma	T1539	Suplementos de
burro médio completo anti ovelhas, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Anticorpo secundário de cGMP
Solução de ácido etanol-acético	Shyuanye	R20492	Fixação de
soro bovino fetal	líquido Gemini	900-108	Solução de bloqueio
Microscópio de fluorescência	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Imagem de imunofluorescência
Glutamina Sigma	G8540	Suplementos de Glutationa Média
	Completa Sigma	G6013	Suplementos de Meio Completo
Detecção de Morte Celular In Situ, TMR red	Roche	12156792910	ensaio TUNEL
Insulina	Sigma	16634	Suplementos de Meio Completo
L-cisteína HCl	Sigma	C7477	Suplementos de
Ácido Linoleico	Sigma	L1012	Suplementos de
Meio Completo MACS Armazenamento de Tecido Solução	Miltenyi	130-100-008	Armazenamento otimizado de amostras frescas de órgãos e tecidos
Soro de burro normal	Solarbio	SL050	Solução de bloqueio
Paraformaldeído (PFA)	Biosharp	BL539A	Agente de fixação
PEN. / STREP. 100&vezes;	Millipore	TMS-AB2-C	Antibióticos penicilina / estreptomicina
Tampão fosfato salino (PBS)	Solarbio	P1010	Solução tampão
Povidona-iodo	Shanghailikang 310411		Agente desinfetante
Progesterona	Sigma	P8783	Suplementos de proteinase média completa
K	Millpore	539480	Quebra de proteína
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Retinol médio básico
	Sigma	R7632	Suplementos de
acetato de retinil	Sigma	R7882	Suplementos de ovelhas médias completas
anti-cGMP Jan	de Vente, Universidade de Maastricht, Holanda		Anticorpo primário de sacarose
	cGMPGHTECH	57-50-1	Agente desidratante
T3	Sigma	T6397	Suplementos de meio completo
Tissue-Tek (O.C.T. Composto)	SAKURA	4583	Meio de incorporação
Acetato de tocoferol	Sigma	T1157	Suplementos de meio completo
Transferrina	Sigma	T1283	Suplementos de meio completo
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cultura de células / tecidos
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Buffer de bloqueio
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Agente tensativo
VECTASHIELD Meio com DAPI	Vector	H-1200	Meio de montagem
Vitamina B1	Sigma	T1270	Suplementos de meio completo
Vitamina B12	Sigma	V6629	Suplementos de Vitamina C Completa
Média	Sigma	A4034	Suplementos de Meio Completo
Zaprinast	Sigma	Z0878	Inibidor de PDE6
Microscópio Zeiss Imager M2	Zeiss, Oberkochen, Alemanha		microscópio vertical
LSM 900 Airyscan			microscópio de varredura a laser de alta resolução
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen, Alemanha		câmera digital
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Globos oculares de primatas de macaco selvagem	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japão
TUNEL kit solução (REF12156792910, Roche, Alemanha),

médio completo Kit de Médio Completo médio completo