Artigo de método

Culturas organotípicas de explantes da retina de macacos

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DOI:

10.3791/64178

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24 de agosto de 2022

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1Yunnan Eye Institute & Key Laboratory of Yunnan Province, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center, Affiliated Hospital of Yunnan University, Yunnan University, 2Institute for Ophthalmic Research, Eberhard-Karls-Universität Tübingen

Neste artigo

Resumo

Explantes retinianos obtidos de macacos selvagens foram cultivados in vitro. A degeneração retiniana e a via de sinalização GMPc-PKG foram induzidas com o uso do inibidor de PDE6 zaprinast. O acúmulo de GMPc nos explantes em diferentes concentrações de zaprinast foi verificado por imunofluorescência.

Resumo

A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras. A superativação da via da proteína quinase dependente de guanosina monofosfato (GMPc) cíclica (PKG) em células fotorreceptoras causa morte celular fotorreceptora, especialmente em modelos que abrigam mutações na fosfodiesterase 6b (PDE6b). Estudos prévios sobre DR utilizaram principalmente modelos murinos, como camundongos rd1 ou rd10 . Dadas as diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, é importante entender até que ponto as retinas de primatas e roedores são comparáveis. Os macacos compartilham um alto nível de semelhança genética com os seres humanos. Portanto, macacos selvagens (com idade entre 1-3 anos) foram selecionados para o cultivo in vitro de explantes da retina que incluíram o complexo retina-epitélio pigmentar da retina (EPR)-coroide. Esses explantes foram tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast para induzir a via de sinalização GMPc-PKG e simular a patogênese da DR. O acúmulo de GMPc e a morte celular em explantes de retina de primatas foram posteriormente verificados usando imunofluorescência e o ensaio TUNEL. O modelo de retina de primatas estabelecido neste estudo pode servir para estudos relevantes e efetivos sobre os mecanismos da DR dependente de GMPc-PKG, bem como para o desenvolvimento de futuras abordagens de tratamento.

Introdução

A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras e causada por mutações em uma grande variedade de genes patogênicos1. O resultado final da DR é a perda da visão e, na grande maioria dos casos, a doença permanece intratável até hoje. Portanto, é importante estudar os mecanismos celulares que levam à morte dos fotorreceptores usando modelos que representem fielmente a condição da doença humana. Aqui, os modelos baseados em primatas são de particular interesse devido à sua proximidade com os humanos. Notadamente, tais modelos podem avançar no desenvolvimento de intervenções terapêuticas apropriadas que possam deter ou retardar a morte celular dos fotorreceptores.

Pesquisas prévias sobre os mecanismos de morte celular na DR demonstraram que a diminuição ou perda da atividade da fosfodiesterase 6 (PDE6) causada por mutações no gene desencadeante da DR leva à redução da hidrólise do monofosfato de guanosina cíclico (GMPc)2,3. O GMPc é um agonista específico dos canais iônicos dependentes de nucleotídeo cíclico (CNGCs) nos segmentos externos dos bastonetes (ROSs) e também é uma molécula-chave responsável pela conversão de sinais luminosos em sinais elétricos em células fotorreceptoras devertebrados4. A hidrólise reduzida do GMPc causa o acúmulo de GMPc em ROSs, levando à abertura de CNGCs 5. Consequentemente, as vias de fototransdução são ativadas, resultando em um aumento nas concentrações de cátions nas células fotorreceptoras. Esse processo impõe uma carga metabólica aos fotorreceptores, que quando superativados, por exemplo, por mutações na PDE6, podem causar morte celular.

Muitos estudos têm demonstrado que um acúmulo significativo de GMPc em fotorreceptores de modelos de camundongos com diferentes mutações no gene da DR pode causar a ativação da proteína quinase dependente de GMPc (PKG)3,6. Isso leva a um aumento substancial de células TUNEL-positivas e a um afinamento gradual da camada de células fotorreceptoras. Estudos prévios sugerem que a superativação de PKG causada por níveis elevados de GMPc é uma condição necessária e suficiente para a indução de morte de células fotorreceptoras 2,5. Estudos em diferentes modelos murinos de DR também mostraram que a ativação de PKG induzida por níveis elevados de GMPc em fotorreceptores leva à superativação de efetores a jusante, como poli-ADP-ribose polimerase 1 (PARP1), histona desacetilase (HDAC) e calpaína 2,7,8,9. Isso implica associações causais entre essas diferentes proteínas-alvo e a morte de células fotorreceptoras.

No entanto, pesquisas anteriores sobre a patologia, toxicofarmacologia e terapia da DR foram baseadas principalmente em modelos murinos para DR10,11,12. No entanto, ainda persistem imensas dificuldades na tradução clínica desses resultados. Isso se deve às consideráveis diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, especialmente no que diz respeito à estrutura da retina. Em contraste, primatas não humanos (NHPs) também compartilham um alto grau de similaridade com humanos no que diz respeito a características genéticas, padrões fisiológicos e regulação de fatores ambientais. Por exemplo, a terapia optogenética foi investigada como um meio de restaurar a atividade retiniana em um modelo de PNH13. Lingam e seus colegas demonstraram que as células precursoras de fotorreceptores da retina derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de boa prática de fabricação podem resgatar danos ao fotorreceptor do cone no NHP14. Portanto, modelos de PNH são importantes para a exploração da patogênese da DR e o desenvolvimento de métodos de tratamento eficazes. Em particular, modelos de PNH de DR, exibindo mecanismos patogênicos semelhantes aos de humanos, poderiam desempenhar um papel crítico em estudos sobre o desenvolvimento e análise toxicofarmacológica in vivo de novos fármacos.

Tendo em vista o longo ciclo de vida, o alto nível de dificuldades técnicas e o alto custo envolvido no estabelecimento de modelos in vivo de primatas, estabelecemos um modelo in vitro de primata não humano (NHP) usando culturas de retina de macaco explantado. Primeiramente, macacos selvagens com idade entre 1 e 3 anos foram selecionados para cultivo in vitro de explantes da retina, que incluíram o complexo retina-EPR-coróide. Os explantes foram então tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM) para induzir a via de sinalização GMP-PKG. A morte de células fotorreceptoras foi quantificada e analisada pelo ensaio TUNEL e o acúmulo de GMPc nos explantes foi verificado por imunofluorescência. Dado o alto grau de similaridade com relação à distribuição e morfologia celular, espessura da camada retiniana e outras características fisiológicas da retina entre macacos e humanos, o estabelecimento da via de sinalização GMPc-PKG no modelo retiniano in vitro pode facilitar futuras pesquisas sobre a patogênese da DR, bem como estudos sobre o desenvolvimento e toxicofarmacologia de novas drogas para o tratamento da DR.

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Protocolo

O estudo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Instituto de Zoologia da Academia Chinesa de Ciências (IACUC-PE-2022-06-002), e revisão de ética animal e protocolo animal da Universidade de Yunnan (YNU20220149).

1. Preparação de explantes de retina

  1. Obter globos oculares de primatas de macacos selvagens, com idades entre 1 e 3 anos de idade, armazenar em solução de armazenamento de tecidos e transportá-los no gelo dentro de 3 h após a enucleação após o sacrifício dos macacos ou após a morte natural.
  2. Para a preparação da solução de proteinase K, dissolver 25 mg de proteinase K em 250 μL de água destilada e, em seguida, adicionar 225 μL da solução a 18,5 ml de meio basal (R16).
  3. Lavar os globos oculares em 10 mL de iodopovidona a 5% (iodopovidona: água = 1:19) por 30 s e mergulhá-los em penicilina/estreptomicina a 5% (PEN/STREP):p solução salina tamponada com hosfato = 1:19 por 1 min para evitar contaminação bacteriana. Em seguida, incubar os globos oculares em 10 mL de meio R16 por 5 min.
  4. Pré-aqueça a solução de proteinase K em incubadora a 37 °C. Em seguida, imergir os globos oculares em 10 mL de solução de proteinase K e incubar por 2 min. Imergir os globos oculares em 10 mL de solução de R16 + soro fetal bovino (1:1), incubar por 5 min e, em seguida, transferir os globos oculares para 10 mL de R16 fresco para uma lavagem final.
  5. Separe a esclera, córnea, íris, cristalino e corpo vítreo e corte a retina de 4 lados com pinça e tesoura (Figura 1A-L).
  6. Cortar explantes de retina com lâminas de trefina em cinco seções - uma lâmina de trefina de 4 mm para o lado nasal/temporal/superior/inferior e uma lâmina de trefina de 6 mm para o lado central (contendo disco óptico e mácula; Figura 1M-O). Corte à seguinte distância da cabeça do nervo óptico: 1,5 mm para o lado nasal, 4 mm para o temporal e 2 mm para o lado superior e inferior.
  7. Transferir os explantes de retina (contendo retina e coroide) com depressor palpebral e colocá-los no meio da inserção, fotorreceptor de lado para cima (Figura 1P). Coloque aproximadamente 1 mL de meio completo (R16 suplementado com BSA, transferrina, progesterona, insulina, T3, corticosterona, vitamina B1, vitamina B12, retinol, acetato de retinila, DL-tocoferol, acetato de tocoferol, ácido linoleico, L-cisteína HCl, glutationa, glutamina, vitamina C) abaixo da membrana na placa para cobrir totalmente a retina.

2. Cultura de explantes retinianos de primatas

  1. Cultivar explantes de retina em meio completo e colocar em estufa a 37 °C aerada com 5% de CO2 umedificada.
  2. Aplicar o tratamento medicamentoso em concentração apropriada no meio de cultura da retina (por exemplo, zaprinast em concentrações de 100 μM, 200 μM ou 400 μM). Utilizar pelo menos três explantes por condição de tratamento e utilizar explantes sem fármaco como controle. Tratar com droga por 4 dias.

3. Fixação e criosseccionamento

  1. Incubar explantes da retina com 1 mL de paraformaldeído (PFA) por 45 min, lavá-los brevemente com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, incubar com sacarose a 10% por 10 min, sacarose a 20% por 20 min e sacarose a 30% por 30 min (1 mL para cada explante de retina).
  2. Cortar explantes de retina utilizando lâminas de trefina para garantir consistência no tamanho dos explantes obtidos de diferentes locais com as seguintes características: quatro quadrantes na periferia, 6 mm no centro. Em seguida, transfira os explantes da retina para uma caixa de flandres (cerca de 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) com meio de incorporação O.C.T. para cobrir o tecido. Congele imediatamente as secções de tecido em azoto líquido e coloque num frigorífico a -20 °C para armazenamento.
  3. Use uma lâmina afiada para aparar o ágar em um pequeno bloco contendo a amostra de tecido, corte os blocos de amostra em seções de 10 μm e coloque-os em lâminas de microscópio de adesão usando uma escova macia. Em seguida, secar por 45 min a 40 °C e armazenar a -20 °C até o uso.

4. Imuno-histoquímica (Figura 2)

  1. Coloração GMPc
    1. Seque as lâminas e desenhe um anel hidrofóbico ao redor das seções da retina com uma caneta bloqueadora de líquido para cobrir as amostras.
    2. Imergir as lâminas em 200 μL de solução salina tampão fosfato a 0,3% e Triton X-100 por lâmina (PBST) por 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, em solução de bloqueio (5% de soro de burro normal, 0,3% PBST, 1% BSA, 200 μL por lâmina) por 1 h à temperatura ambiente.
    3. Incubar as amostras durante a noite com o anticorpo primário (1:250, anti-GMPc de ovelha, 200 μL por lâmina) preparado na solução de bloqueio a 4 °C e, em seguida, enxaguar com PBS por 10 min (200 μL por lâmina) 3x.
    4. Incubar as amostras com anticorpo secundário (1:300, Burro anti ovino Alxea Fluor 488, 200 μL por lâmina) por 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, enxaguar com PBS por 10 min, 3x. Cobrir as amostras com um meio de montagem antifade contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e conservar a 4 °C durante, pelo menos, 30 minutos antes da obtenção de imagens.
  2. Coloração TUNEL
    1. Secar as lâminas à temperatura ambiente por 15 min e desenhar um anel de barreira hidrorrepelente ao redor de amostras de tecido da retina com a caneta bloqueadora de líquido e, em seguida, incubá-las em 40 mL de PBS por 15 min.
    2. Incubar as lâminas em 42 mL (por cinco lâminas) de TBS (0,05 M Tris-buffer) a 37 °C. Aspirar a TBS e incubar as amostras com 6 μL de proteinase K por 5 min. Em seguida, lave as lâminas 3x com TBS por 5 min de cada vez.
    3. Expor as lâminas a 40 mL de solução de etanol-ácido acético na choplin, cobrir com uma folha transparente e incubar a -20 °C por 5 min. Lave as lâminas 3x com TBS por 5 min de cada vez.
    4. Expor as lâminas à solução de bloqueio (BSA a 1%; 200-300 μL por lâmina conforme a necessidade) e incubar em uma câmara de umidade por 1 h.
    5. Preparar a solução do kit TUNEL, vermelho TMR, na seguinte proporção: 62,50 μL de solução de bloqueio (BSA a 1%), 56,25 μL de solução de marcação (TMR-dUTP) e 6,25 μL de enzima (proporção para cada lâmina). Adicionar cerca de 130 μL desta solução por lâmina e incubar a 37 °C durante 1 h. Em seguida, lave as lâminas com PBS por 5 min (200 μL por lâmina), 2x.
    6. Coloque as lâminas de cobertura contendo 1-2 gotas de meio de montagem antifade com DAPI sobre as amostras e, em seguida, incube as lâminas a 4 °C por pelo menos 30 minutos antes da obtenção de imagens.
  3. Coloração cGMP combinada com coloração TUNEL
    1. A coloração GMPc foi seguida pela coloração TUNEL. Siga os passos da coloração TUNEL do passo 4.2.1 ao passo 4.2.5 e, em seguida, continue os passos da coloração cGMP do passo 4.1.2 ao passo 4.1.4.
  4. Realizar microscopia de luz e fluorescência com os parâmetros da câmera da seguinte forma: tempo de exposição = 125 ms, tamanho da ROI = 2752 x 2208, Cor = B/M. Capture imagens usando o software. Fotografar quatro campos diferentes com uma câmera digital com aumento de 20x de cada corte e obter fotos representativas das áreas centrais da retina usando DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), com varredura Z-Stack com intervalo = 1 μm e opcional = 1,251 μm.

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Resultados

Neste estudo, a cultura de explantes de retina de macacos macacos foi realizada utilizando explantes contendo o complexo retina-EPR-coróide (Figura 1, Figura Suplementar S1). Em comparação com a cultura in vitro de células da retina usando a retina sem o EPR e a coroide anexados, nossa cultura de explantes facilita uma melhor sobrevivência celular e, consequentemente, prolonga a sobrevivência das células fotorreceptoras.

Foram utilizadas ...

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Discussão

A fototransdução visual refere-se ao processo biológico pelo qual os sinais luminosos são convertidos em sinais elétricos por células fotorreceptoras dentro da retina do olho. As células fotorreceptoras são neurônios polarizados capazes de fototransdução, e existem dois tipos diferentes de fotorreceptores denominados bastonetes e cones após as formas de seus segmentos externos. Os bastões são responsáveis pela visão escotópica e os cones são responsáveis pela visão fotópica e de alta acuidade. A DR hereditária relaciona-...

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Divulgações

Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81960180), da fundação de herança Zinke e da Fundação Charlotte e Tistou Kerstan, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Agradecemos ao Prof. Longbao Lv (Instituto de Zoologia, Academia Chinesa de Ciências, Kunming, China) por compartilhar os globos oculares de macaco usados neste estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaB2064Solução de bloqueio
CorticosteronaSigmaC2505Suplementos de
DL-tocoferolSigmaT1539Suplementos de
burro médio completo anti ovelhas, Alxea Fluor 488Life technologies corporationA11015Anticorpo secundário de cGMP
Solução de ácido etanol-acéticoShyuanyeR20492Fixação de
soro bovino fetallíquido Gemini900-108Solução de bloqueio
Microscópio de fluorescênciaCarl ZeissAxio Imager.M2Imagem de imunofluorescência
Glutamina SigmaG8540Suplementos de Glutationa Média
Completa SigmaG6013Suplementos de Meio Completo
Detecção de Morte Celular In Situ, TMR redRoche12156792910ensaio TUNEL
InsulinaSigma16634Suplementos de Meio Completo
L-cisteína HClSigmaC7477Suplementos de
Ácido LinoleicoSigmaL1012Suplementos de
Meio Completo MACS Armazenamento de Tecido SoluçãoMiltenyi130-100-008Armazenamento otimizado de amostras frescas de órgãos e tecidos
Soro de burro normalSolarbioSL050Solução de bloqueio
Paraformaldeído (PFA)BiosharpBL539AAgente de fixação
PEN. / STREP. 100&vezes;MilliporeTMS-AB2-CAntibióticos penicilina / estreptomicina
Tampão fosfato salino (PBS)SolarbioP1010Solução tampão
Povidona-iodoShanghailikang 310411Agente desinfetante
ProgesteronaSigmaP8783Suplementos de proteinase média completa
KMillpore539480Quebra de proteína
R16 mediumLife technologies corporation074-90743ARetinol médio básico
SigmaR7632Suplementos de
acetato de retinilSigmaR7882Suplementos de ovelhas médias completas
anti-cGMP Jande Vente, Universidade de Maastricht, HolandaAnticorpo primário de sacarose
cGMPGHTECH57-50-1Agente desidratante
T3SigmaT6397Suplementos de meio completo
Tissue-Tek (O.C.T. Composto)SAKURA4583Meio de incorporação
Acetato de tocoferolSigmaT1157Suplementos de meio completo
TransferrinaSigmaT1283Suplementos de meio completo
TranswellCorning Incorporated3412Cultura de células / tecidos
Tris-buffer (TBS)SolarbioT1080Buffer de bloqueio
Triton X-100Solarbio9002-93-1Agente tensativo
VECTASHIELD Meio com DAPIVectorH-1200Meio de montagem
Vitamina B1SigmaT1270Suplementos de meio completo
Vitamina B12SigmaV6629Suplementos de Vitamina C Completa
MédiaSigmaA4034Suplementos de Meio Completo
ZaprinastSigmaZ0878Inibidor de PDE6
Microscópio Zeiss Imager M2  Zeiss, Oberkochen, Alemanhamicroscópio vertical
LSM 900 Airyscanmicroscópio de varredura a laser de alta resolução
Zeiss Axiocam  Zeiss, Oberkochen, Alemanhacâmera digital
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Globos oculares de primatas de macaco selvagemKUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGYSYXK (figure-materials-1) K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japão
TUNEL kit solução (REF12156792910, Roche, Alemanha),
médio completo Kit de Médio Completo médio completo

Referências

  1. O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
  2. Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).
  3. Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
  4. Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453(2019).
  5. Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142(2014).
  6. Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
  7. Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
  8. Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24(2010).
  9. Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
  10. Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
  11. Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
  12. Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
  13. McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
  14. Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464(2021).
  15. Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
  16. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  17. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880(2021).
  18. Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
  19. Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440(2021).
  20. Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752(2021).

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