Artigo de método

Dissecando a Função Autônoma Celular da Proteína de Retardo Mental do X Frágil em um Circuito Auditivo por Eletroporação In Ovo

DOI:

10.3791/64187

⸱

6 de julho de 2022

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando a eletroporação do ovo , desenvolvemos um método para transfectar seletivamente o ouvido interno auditivo e o núcleo coclear em embriões de galinha para alcançar uma derrubada específica do grupo celular da proteína de retardo mental X frágil durante períodos discretos de montagem do circuito.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A proteína de retardo mental do X frágil (FMRP) é uma proteína de ligação ao mRNA que regula a tradução de proteínas locais. A perda ou disfunção da FMRP leva a atividades neuronais e sinápticas aberrantes na síndrome do X frágil (FXS), que é caracterizada por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e problemas de comunicação social. Estudos da função da FMRP e da patogênese da FXS foram conduzidos principalmente com o knockout de Fmr1 (o gene que codifica a FMRP) em animais transgênicos. Aqui relatamos um método in vivo para determinar a função autônoma celular da FMRP durante o período de montagem do circuito e formação sináptica usando embriões de galinha. Este método emprega eletroporação específica de estágio, local e direção de um sistema vetorial induzível por droga contendo Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) e um repórter EGFP. Com este método, obteve-se o knockdown seletivo da FMRP no gânglio auditivo (GA) e em um de seus alvos do tronco encefálico, o núcleo magnocelular (NM), proporcionando assim uma manipulação componente-específica dentro do circuito AG-NM. Além disso, o padrão de mosaico da transfecção permite controles dentro de animais e comparações de neurônios / fibras vizinhas para maior confiabilidade e sensibilidade na análise de dados. O sistema vetorial induzível fornece controle temporal do início da edição gênica para minimizar os efeitos acumulados no desenvolvimento. A combinação dessas estratégias fornece uma ferramenta inovadora para dissecar a função autônoma celular da FMRP no desenvolvimento sináptico e de circuitos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A síndrome do X Frágil (FXS) é um transtorno do neurodesenvolvimento caracterizado por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e comportamentos autistas. Na maioria dos casos, a FXS é causada por uma perda global de proteína de retardo mental X frágil (FMRP; codificada pelo gene Fmr1) a partir dos estágios embrionários iniciais1. A FMRP é uma proteína ligadora de RNA que normalmente é expressa na maioria dos neurônios e células gliais do cérebro, bem como nos órgãos sensoriais 2,3,4. Em cérebros de mamíferos, a FMRP provavelmente está associada a centenas de mRNAs que codificam proteínas importantes para várias atividades neurais5. Estudos de animais knockout Fmr1 convencionais demonstraram que a expressão de FMRP é particularmente importante para a montagem e plasticidade da neurotransmissão sináptica6. Vários modelos de knockout condicional e mosaico demonstraram ainda que as ações e sinais da FMRP variam entre regiões cerebrais, tipos de células e sítios sinápticos durante vários eventos de desenvolvimento, incluindo projeção axonal, padronização dendrítica e plasticidade sináptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . A função aguda da PRFM na regulação da transmissão sináptica foi estudada pela liberação intracelular de anticorpos inibitórios da PRFM ou da própria PRFM em cortes cerebrais ou neurônios cultivados15,16,17,18. Esses métodos, no entanto, não oferecem a capacidade de rastrear as consequências induzidas por erros de expressão da FMRP durante o desenvolvimento. Assim, o desenvolvimento de métodos in vivo para investigar as funções autônomas celulares da FMRP é de grande necessidade e espera-se que ajude a determinar se as anomalias relatadas em pacientes com FXS são consequências diretas da perda de FMRP nos neurônios e circuitos associados, ou consequências secundárias derivadas de mudanças em toda a rede durante o desenvolvimento19.

O tronco encefálico auditivo de embriões de galinha oferece um modelo excepcionalmente vantajoso para análises funcionais aprofundadas da regulação da FMRP no desenvolvimento de circuitos e sinapses. O fácil acesso a cérebros de galinhas embrionárias e a técnica bem estabelecida de eletroporação de ovoterapia para manipulação genética contribuíram grandemente para a nossa compreensão do desenvolvimento cerebral em estágios embrionários iniciais. Em estudo recentemente publicado, essa técnica foi combinada com ferramentas moleculares avançadas que permitem o controle temporal da expressão incorreta daPRFM 20,21. Aqui, a metodologia é avançada para induzir manipulações seletivas de neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos separadamente. Este método foi desenvolvido no circuito auditivo de tronco encefálico. O sinal acústico é detectado pelas células ciliadas no ouvido interno auditivo e, em seguida, transportado para o gânglio auditivo (AG; também chamado de gânglio espiral em mamíferos). Os neurônios bipolares no GA inervam as células ciliadas com seus processos periféricos e, por sua vez, enviam uma projeção central (o nervo auditivo) para o tronco encefálico, onde terminam em dois núcleos cocleares primários, o núcleo magnocelular (NM) e o núcleo angularis (NA). Os neurônios no NM são estrutural e funcionalmente comparáveis às células espessas esféricas do núcleo coclear anteroventral de mamíferos. Dentro do NM, as fibras nervosas auditivas (FANs) fazem sinapse na somata dos neurônios NM através do grande bulbo final dos terminais de Held22. Durante o desenvolvimento, os neurônios NM surgem dos rombomeres 5 e 6 (r5/6) no rombencéfalo23, enquanto os neurônios AG são derivados de neuroblastos residentes no otocisto24. Aqui, descrevemos o procedimento para derrubar seletivamente a expressão de FMRP nos neurônios AG pré-sinápticos e nos neurônios NM pós-sinápticos separadamente.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ovos e embriões de galinha foram manuseados com cuidado e respeito, de acordo com os protocolos de animais aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Jinan.

1. Preparação de óvulos e plasmídeos

  1. Preparação de ovos
    1. Obter ovos de galinha fertilizados frescos (Gallus gallus) da Universidade Agrícola do Sul da China e armazenar a 16 °C antes da incubação. Para uma viabilidade ideal, coloque todos os ovos para incubação dentro de uma semana após a chegada.
    2. Colocar os ovos horizontalmente e incubar a 38 °C por 46-48 h até o estágio 1225 de Hamburger e Hamilton (HH) para transfecção do tubo neural, ou por 54-56 h até HH13 para transfecção de otocisto. Como o polo animal do ovo é mais leve que o polo vegetal, a colocação horizontal posiciona o embrião no topo do ovo para facilitar a manipulação. Tenha cuidado para manter o ovo horizontal nesta e em todas as etapas a seguir.
    3. A localização do embrião aparece como uma área escura na casca do ovo ao lançar luz do fundo do ovo usando uma lanterna. Nos estágios desejados de HH, use este método de lanterna para marcar a localização do embrião na casca do ovo com lápis.
    4. Limpe os ovos com gaze contendo 75% de etanol. Faça um furo na extremidade pontiaguda dos ovos usando a ponta da tesoura e remova 2 mL de albumina com uma seringa de agulha de 18 G. Certifique-se de que o orifício seja grande o suficiente para permitir a inserção da agulha. Limpe qualquer vazamento de albumina com gaze e sele o orifício com fita adesiva.
    5. Para minimizar rachaduras e evitar a queda de detritos de casca durante a janela, cubra a parte superior dos ovos com fita adesiva, centrando-se na área escura marcada com lápis.
  2. Extração de DNA plasmídico
    1. Clone chicken Fmr1 shRNA usando um sistema Tet-on baseado em transposon, conforme descrito anteriormente20. Este sistema contém três plasmídeos: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 e pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, fornecendo um sistema vetorial induzível por drogas pelo qual a expressão de Fmr1 shRNA e EGFP é silenciada após a transfecção e pode ser ativada por indução de doxiciclina (Dox).
      Observação : esses plasmídeos não estão atualmente disponíveis em um repositório. Os autores concordam em fornecer os plasmídeos mediante solicitação razoável.
    2. Extraia os DNAs plasmídicos usando um kit de preparação livre de endotoxinas de acordo com as instruções do fabricante e precipite adicionando 1/15 volume de acetato de sódio 7,5 M e 1 volume de isopropanol a 100%.
    3. Plasmídeos precipitados a -20 °C durante a noite e centrifugação a 13.000 x g durante 10 min. Dissolva o pellet com o tampão Tris-EDTA fornecido no kit até uma concentração final de 4-5 μg/μL. Os plasmídeos podem ser armazenados a -20 °C por 12 meses sem redução da eficiência da transfecção.
    4. No dia da eletroporação, misture bem 2 μL de cada plasmídeo em um tubo de centrífuga estéril usando uma ponta de pipeta. O volume resultante de 6 μL da mistura plasmídica é suficiente para eletroporar três dúzias de ovos. Para ajudar a visualizar o plasmídeo durante a eletroporação, adicione 1 μL de 0,1% de verde rápido (preparado em ddHestéril 2O) para cada 6 μL de mistura de DNA26, o que torna a mistura plasmídica azul.

2. Na eletroporação do ovo

  1. Janela de ovos e identificação de embriões
    1. No dia da eletroporação, retire os ovos da incubadora, uma dúzia de ovos de cada vez. Manter os ovos fora de sua incubadora por mais de 1 h introduz variações de desenvolvimento e reduz a viabilidade.
    2. Limpe todas as ferramentas de cirurgia com gaze contendo etanol a 75%.
    3. Coloque cada ovo em um suporte de espuma personalizado. Limpe a área coberta de fita com etanol a 75% e corte uma janela (1-2 cm 2) ao redor da circunferência da marca de lápis usando um pequeno par de tesouras (Figura 1A). Ao cortar, segure a tesoura plana para evitar danificar o embrião por baixo.
    4. Coloque o ovo em janela sob um estereomicroscópio com uma ocular de 10x e zoom de 2x e identifique o embrião. Ajuste o ângulo e o brilho da fonte de luz para uma melhor visualização.
      NOTA: É preciso prática e experiência para visualizar o embrião e identificar o tubo neural nesta fase.
      1. Para iniciantes, use a seguinte injeção de tinta opcional para facilitar a identificação do embrião. Prepare 10% de solução de tinta indiana em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,01 M e autoclave com antecedência. Encha uma seringa de 1 ml com a solução de tinta e, em seguida, coloque uma agulha 27G. Dobre a agulha para um ângulo de 45° com fórceps.
      2. Sob o microscópio, cutuque cuidadosamente a borda da área opaca e insira a agulha sob o embrião. Injete ~50 μL de tinta, que se difundirá abaixo da área da pellúcida para visualização embrionária. A tinta formará um fundo escuro para uma visualização clara do embrião.
        NOTA: Expulse o ar da seringa antes da inserção e injeção. Quando habilidoso em visualizar, evite a etapa de injeção de tinta, pois reduz a taxa de sobrevivência.
  2. Injeção e eletroporação do tubo neural
    NOTA: Este procedimento é realizado em HH12 para transfecção de neurônios NM no tronco encefálico.
    1. Puxe capilares de vidro (~1 mm de diâmetro e 100 mm de comprimento) para pipetas usando um puxador de pipetas. Sob um microscópio de dissecação, abra cuidadosamente a ponta da agulha capilar a 10-20 μm de diâmetro com fórceps. Armazene as pipetas (geralmente 5-10 de uma só vez) em uma caixa de armazenamento até o uso.
    2. Encha uma pipeta capilar com 0,5-1 μL da mistura plasmídica aplicando pressão negativa através de um tubo de borracha no final da pipeta. Isto pode ser conseguido através de uma seringa ou bomba de ar.
    3. Coloque o ovo sob o microscópio de modo que o embrião seja orientado verticalmente com a cauda perto de você (ou horizontalmente para injetar pipetas capilares usando um manipulador de três eixos). Segure a pipeta capilar com uma mão ou com o manipulador de três eixos e conduza a ponta da pipeta para o r5/6 no sentido cauda-cabeça.
      NOTA: A área mais anterior do rombencéfalo é r1 e cada protuberância subsequente ao longo do tubo neural é um rombomere individual. R5/6 está no mesmo nível anteroposterior que o otocisto, que é uma estrutura em forma de copo facilmente reconhecível (Figura 1B-C).
    4. Gentilmente cutuque a ponta através da membrana vitelina e no tubo neural dorsal e, em seguida, retire a pipeta um pouco para que a ponta esteja no lúmen do tubo neural. Injete a mistura de plasmídeos aplicando pressão de ar até que o plasmídeo colorido se difunda totalmente em r5/6 e se estenda para r3 e r4.
      NOTA: Não é necessário fazer um slot na membrana vitelina para injeção.
    5. Verifique se há uma injeção bem-sucedida, que é alcançada quando a solução de plasmídeo azul se difunde rapidamente pelo tubo neural sem vazar (Figura 1B-C). Quando ocorre vazamento, o azul desaparece rapidamente.
    6. Imediatamente após a injeção, coloque um eletrodo bipolar de platina em ambos os lados do tubo neural (Figura 1D). Forneça dois pulsos de 12 V e 50 ms de duração com um eletroporador. Observe bolhas de ar nas extremidades do eletrodo bipolar, com mais no lado negativo.
    7. Verifique se há eletroporação bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeos coloridos entra no tecido do tubo neural perto do lado positivo do eletrodo. Após a eletroporação, remova cuidadosamente o eletrodo bipolar.
    8. Cubra a janela na casca do ovo com um pedaço de filme transparente que é pré-cortado em 2 em quadrados e pulverizado com etanol a 75%. Coloque o ovo de volta em sua incubadora.
    9. Limpe o eletrodo bipolar fornecendo 10-20 pulsos de 12 V e 50 ms de duração em solução salina antes de prosseguir para o próximo ovo.
  3. Injeção e eletroporação de otocistos
    NOTA: Este procedimento é realizado no HH13 para transfecção de células ciliadas e neurônios AG no ouvido interno.
    1. No HH13 (que é ~dia embrionário 2.5), o embrião virou de modo que o lado direito da cabeça está voltado para cima. Sob o microscópio, coloque o ovo de modo que o embrião fique vertical, com a cauda perto de você. Segure a pipeta capilar e cutuque suavemente o otocisto direito na direção dorsolateral (Figura 2A).
      NOTA: Nesta fase, o otocisto aparece como uma pequena estrutura circular no topo do corpo no mesmo nível anteroposterior que r5/6.
    2. Injetar a mistura plasmídica com pressão de ar até que o otocisto seja preenchido com solução azul27. Verifique se há uma injeção bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeo azul está confinada dentro do otocisto e não vaza.
    3. Imediatamente após a injeção, coloque o eletrodo bipolar no otocisto, conforme descrito na Figura 2B. Posicione os lados positivo e negativo anterior e posterior ao otocisto, respectivamente. Forneça dois pulsos de 12 V e 50 ms de duração com o eletroporador.
    4. Verifique se há eletroporação bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeo azul entra no tecido do otocisto perto do lado positivo do eletrodo. Após a eletroporação, remova cuidadosamente o eletrodo bipolar. Cubra a janela na casca do ovo com uma película transparente e devolva o ovo à incubadora.

3. Administração de Dox para iniciar e manter a transcrição plasmídica

  1. Preparação da solução Dox
    1. Meça 100 mg de Dox pó sob um exaustor químico e dissolvê-lo em 100 mL de PBS estéril para fazer um 1 mg / mL de solução de trabalho. Filtrar a solução com um filtro de 0,22 μm e conservar 1 ml de alíquotas a -20 °C. Proteger da luz20,28.
  2. Administração de Dox
    1. Para edição de genes de força total, às 24 h antes da idade desejada, descongele uma alíquota Dox no gelo. Solte 50 μL de Dox diretamente na membrana corioalantóica do ovo usando uma seringa penetrando no filme transparente. Sele o orifício da agulha com filme transparente ou fita adesiva após a injeção.
    2. Para manter o efeito knockdown, administre Dox a cada dois dias até a colheita de tecido no estágio de desenvolvimento desejado.

4. Dissecção e secção de tecidos

  1. Tronco cerebral
    1. Para embriões em estágio embrionário 3 (E3) e E6, abra a casca do ovo e corte a membrana associada com uma tesoura. Coloque o embrião na colher e mergulhe-o em paraformaldeído a 4% (PFA) em tampão fosfato 0,1 M.
    2. Para embriões E9, abra a casca do ovo, decapite o embrião com uma tesoura e transfira a cabeça para uma placa com fundo de silício cheia de PBS. Prenda a cabeça para baixo através das órbitas e corte o topo do crânio. Coloque cuidadosamente o fórceps abaixo do cérebro de ambos os lados e eleve todo o cérebro do crânio com os ombros do fórceps. Mergulhe o cérebro em 4% de PFA.
    3. Para embriões E15 e E19, abra a casca do ovo, decapite o embrião com uma tesoura e coloque a cabeça em uma placa com fundo de silício cheia de PBS. Abra a pele no topo da cabeça para expor o crânio.
    4. Incise através do crânio verticalmente com uma navalha para separar o prosencéfalo e o cérebro caudal. Mergulhe o bloco caudal no PBS, remova o topo do crânio e, em seguida, tire o cérebro do crânio.
    5. Prenda o cérebro através do lobo óptico e separe o cerebelo e o tronco encefálico. Tome cuidado para não danificar o tronco encefálico auditivo, que está localizado logo abaixo do cerebelo. Remova o máximo de dura-máter possível do tronco encefálico e, em seguida, mergulhe-o em 4% de PFA.
    6. Manter embriões e tecidos cerebrais em PFA a 4% a 4 °C durante a noite, com exceção dos caules cerebrais E19, que devem ser mantidos sob a mesma condição durante 24 h.
    7. Após a fixação, desidrate o tecido em PBS contendo 30% de sacarose até que ele se instale, o que geralmente leva de 1 a 3 dias, dependendo da idade.
    8. Seção do tronco encefálico (E15 e E19) a 30 μm no plano coronal usando um micrótomo deslizante. Recolher secções em PBS e conservar a 4 °C antes da imunocoloração.
    9. Para embriões E3 e E6 e espetros encefálicos E9, secção a 50 μm transversalmente. Recolher secções em PBS e armazenar a 4 °C. Monte as seções em lâminas de microscópio revestidas de gelatina antes da imunocoloração. A coleta de seções mais espessas para essas idades facilita o manuseio do tecido.
  2. Ducto auditivo
    1. Depois de remover os caules cerebrais dos embriões E9, E15 e E19, o ducto auditivo, que está embutido no osso temporal, é facilmente identificável sob o crânio, e o osso temporal é facilmente separável do crânio circundante. Para embriões E9, fixe todo o osso temporal em 4% de PFA. Para embriões mais velhos, remova a estrutura óssea do osso temporal para isolar o ducto auditivo e fixar o ducto auditivo em 4% de PFA.
    2. Manter todos os ossos temporais e ductos auditivos em PFA a 4% a 4 °C durante a noite antes da incorporação do tecido.
    3. Realize a incorporação de tecido conforme descrito. Prepare a solução de incorporação da seguinte forma: Mergulhe 10% de gelatina (de pele bovina) em água fria até que os grânulos de gelatina inchem e assentem (cerca de 30 min). Aqueça a mistura a ~50 °C para dissolver a gelatina e adicione 20% de sacarose à solução de gelatina e mexa para dissolver. Conservar a solução de gelatina-sacarose a 4 °C durante um mês.
    4. Para utilização, aquecer a solução de gelatina-sacarose a 37 °C. Mergulhe os ossos temporais/ductos auditivos na solução quente de gelatina-sacarose em uma placa de 96 poços a 37 °C até que eles se assentem, geralmente 30-60 min.
    5. Forre o fundo dos poços de uma placa de 12 poços com uma tira de filme transparente. Adicione uma camada de solução quente de gelatina-sacarose e espere até solidificar. Transfira um osso temporal/ducto auditivo para cada poço.
    6. Implante o tecido com uma segunda camada de solução quente de gelatina-sacarose. Ajuste a posição do tecido para que ele fique no centro do gel e o ducto auditivo seja orientado horizontalmente. Mova cuidadosamente a placa para um frigorífico a 4 °C e aguarde até que o gel esteja firme.
    7. Puxe a tira de filme transparente para mover o bloco de tecido de gel para fora do poço. Apare o gel extra em um bloco quadrado e corte um canto do bloco para identificar a orientação. Envolva o bloco de gelatina com um pedaço de papel alumínio, congele no gelo seco e, em seguida, guarde a -80 °C até à secção.
    8. Seção do bloco a 20 μm ao longo da longitude do ducto auditivo com um criostato. Monte as seções diretamente em lâminas de microscópio revestidas de gelatina. Conservar as lâminas a -80 °C antes da imunocoloração.
    9. Antes da imunocoloração, mergulhe as lâminas em PBS pré-aquecido (45 °C) por 5 minutos para dissolver a gelatina e, em seguida, lave as lâminas 3x com PBS à temperatura ambiente para remover a gelatina residual.

5. Imunocoloração e microscópio

NOTA: Dois tipos de imunocoloração são realizados dependendo se as seções são montadas em lâminas ou flutuam livremente na PBS.

  1. Imunocoloração em lâminas
    1. Lave as lâminas 3x por 10 min cada com PBS. Circule a região que contém as seções com uma caneta de óleo para evitar o vazamento de líquido durante a coloração. Cobrir as secções com uma solução de bloqueio contendo 5% de soro de cabra normal em PBS e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
    2. Diluir os anticorpos primários (para a concentração final utilizada consulte Tabela de Materiais) em PBS contendo 0,3% de TritonX-100 e 5% de soro de cabra normal. Remova a solução de bloqueio e, em seguida, cubra as secções com a solução de anticorpos primários. Incubar as lâminas a 4 °C durante a noite numa caixa contendo uma camada de água destilada no fundo.
    3. Lave as lâminas 3x por 10 min com PBS. Aplicar anticorpos secundários fluorescentes diluídos a 1:500 em PBS contendo TritonX-100 a 0,3% em lâminas. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 4 h, protegidas da luz.
    4. Lave as lâminas 3x com PBS. Solte suavemente duas gotas de meio de montagem sobre as lâminas e cubra as seções com deslizamentos de cobertura. Tome cuidado para não gerar bolhas de ar entre o deslizamento da tampa e o deslizamento.
  2. Imunocoloração para embriões inteiros e seções flutuantes
    1. Lave os embriões/seções com PBS 3x por 10 min cada um em uma placa de poço. Diluir os anticorpos primários em PBS contendo 0,3% de TritonX-100 e 5% de soro de cabra normal em tubos centrífugos. Transferir cada embrião/secção para um tubo com um gancho de vidro e incubar num agitador a 60 rpm durante a noite a 4 °C.
    2. Lave os embriões/seções 3x com PBS por 10 min cada em uma placa de poço. Transferir cada embrião/secção para um tubo centrífugo escuro preenchido com solução de anticorpos secundários fluorescentes e incubar à temperatura ambiente durante 4 h no agitador.
    3. Lave os embriões/seções 3x com PBS em uma placa de poço. Use uma escova para montar as seções em lâminas de microscópio revestidas de gelatina em um prato de 15 cm contendo PBS. Depois que as lâminas estiverem levemente secas (~ 5 min), aplique duas gotas de meio de montagem e coloque uma tampa. Tome cuidado para não gerar bolhas de ar entre o deslizamento da tampa e o deslizamento. Mantenha todos os tecidos de montagem em PBS para geração de imagens.
  3. Imagiologia
    1. Imagine todos os tecidos de montagem em PBS em um prato com um fundo de silício contendo pó de carbono, que fornece um fundo preto. Capturar e processar imagens usando um pacote de software comercial de processamento de imagens da Olympus, conforme descrito anteriormente29.
    2. Fotografe as seções nas lâminas com um microscópio confocal conforme descrito anteriormente20. Imagine as seções em um único plano focal com objetivos de 10x, 20x e 63x. Capture todas as imagens do mesmo animal usando os mesmos parâmetros. Tome cuidado para ajustar o nível do laser e as configurações de aquisição de imagens para evitar a saturação do sinal.
    3. Execute o processamento de imagens usando o software Fiji. Para ilustração, ajuste o brilho, o contraste e a gama da imagem usando um software profissional de edição de imagens.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Realizando-se em ovo-eletroporação em diferentes locais e em diferentes estágios de desenvolvimento, obteve-se knockdown seletivo da FMRP tanto na periferia auditiva quanto no tronco encefálico auditivo.

Knockdown da FMRP em NM
O pequeno RNA hairpin (shRNA) contra a galinha Fmr1 foi projetado e clonado no sistema vetorial Tet-On conforme descrito anteriormente20. A configuração para eletroporação in ovo é mostrada na

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para determinar a função autônoma celular da FMRP, é necessário manipular sua expressão em grupos celulares individuais ou tipos de células. Uma vez que uma das principais funções da FMRP é regular a formação sináptica e a plasticidade, manipular seletivamente cada componente sináptico de um determinado circuito é pré-requisito para uma compreensão completa do mecanismo FMRP na comunicação sináptica. Utilizando na ovoporação embriões de galinha, demonstramos um método para direci...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado por: uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 32000697); o Programa de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (202102080139); a Fundação de Ciências Naturais de Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); os Fundos de Investigação Fundamental para as Universidades Centrais (11620324); uma Bolsa de Pesquisa do Laboratório Chave de Medicina Regenerativa, Ministério da Educação, Universidade de Jinan (No. ZSYXM202107); os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais da China (21621054); e a Fundação de Pesquisa Científica Médica da Província de Guangdong, na China (20191118142729581). Agradecemos ao centro médico experimental da Universidade de Jinan. Agradecemos ao Dr. Terra Bradley pela cuidadosa edição do manuscrito.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
incubação de ovos
16 > Geladeira CMAGATUsado para armazenamento de óvulos fertilizados.
Incubadora de ovosSHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
Ovos fertilizadosFazenda da UniversidadeOs ovos devem ser usados em uma semana para uma ótima viabilidade.
Preparação de plasmídeo
CentrífugaSigma10016
Fast greenSolarbioG1661Faça 0,1% de solução de trabalho em água destilada e autoclave.
Kit de preparação de plasmídeo Maxi-prepQIAGEN12162Dissolva o DNA do plasmídeo em tampão Tris-EDTA (TE); kit de preparação sem endotoxinas
Acetato de sódioSigma-AldrichS2889Faça uma solução de trabalho de 7,5M em água sem nuclásio.
Eletroporação e Administração de Doxiciclina
EletroporadorBTXECM399
Seringa de 1 mL / 5 mLGUANGZHOU KANGFULAI
Microscópio de dissecaçãoCNOPTECSZM-42
DoxciclinaSigma-AldrichD9891Use alíquotas frescas para cada dose e armazene a -20 & graus; C.
Capilar de vidroBEIBOBOMEIRD09100,9-1,1 mm*100 mm
Parafilm de laboratórioPARAFILMPM996
extrator de pipeta deCHENGDU INSTRUMENT FACTORYWD-2Condição de tração: 500 ° C por 15 s
Elctrodes de platinaFeito emcom 0,5 mm de diâmetro, intervalo de 1,5 mm.
Tubo de borrachaSigma-AldrichA5177
Tissue Dissection and Fixation
ForcepsRWDF11020-11Tamanho da ponta: 0,05*0,01 mm
Outras ferramentas cirúrgicasRWD
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127A solução de PFA a 4% recém-feita em solução salina tamponada com fosfato pode ser armazenada em 4 ° C por até 1 semana.
Kit de elastômero de silicone SYLGARD 184DOW01673921Para placas de fundo preto, é aplicado pó de carbono de qualidade alimentar.
Sectioning
CryostatLEICACM1850
GelatinaSigma-AldrichG9391De pele bovina.
Micrótomo deslizanteLEICASM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratoAbcamab150113diluição 1:500, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 cabra anti-coelhoAbcamab150078diluição 1:500, RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901: 1000 diluição
Fluoromount-G meio de montagemSul  BiotechSb-0100-01
FMRP anticorpoY. Wang, Florida State University#8263diluição 1:1000, RRID: AB_2861242
Islet-1 anticorpoDSHB39.3F7diluição 1:100, RRID: AB_1157901
placa NetwellCorning3478
Anticorpo de neurofilamentoSigma-AldrichN4142diluição 1:1000, RRID: AB_477272
Anticorpo de parvalbuminaSigma-AldrichP3088diluição 1:10000, RRID: AB_477329
anticorpo SNAP25Abcamab66066diluição 1:1000, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshopADOBEsoftware de edição de imagens
Microscópio confocalLEICASP8
Estereomicroscópio fluorescenteOLYMPUSMVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0OlYMPUSpacote de software de processamento de imagem comercial
Agrícola do Sul da China filme transparente casa

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253(2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13(2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628(2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864(2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321(2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628(2022).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

S ndrome do X Fr gilKnockdown de FMRPEmbri o de GalinhaRNA de grampo pequenoRep rter EGFPG nglio AuditivoN cleo MagnocelularTransfec o do Tubo Neural

Artigos relacionados