Dissecando a Função Autônoma Celular da Proteína de Retardo Mental do X Frágil em um Circuito Auditivo por Eletroporação In Ovo

Summary

Usando a eletroporação do ovo , desenvolvemos um método para transfectar seletivamente o ouvido interno auditivo e o núcleo coclear em embriões de galinha para alcançar uma derrubada específica do grupo celular da proteína de retardo mental X frágil durante períodos discretos de montagem do circuito.

Abstract

A proteína de retardo mental do X frágil (FMRP) é uma proteína de ligação ao mRNA que regula a tradução de proteínas locais. A perda ou disfunção da FMRP leva a atividades neuronais e sinápticas aberrantes na síndrome do X frágil (FXS), que é caracterizada por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e problemas de comunicação social. Estudos da função da FMRP e da patogênese da FXS foram conduzidos principalmente com o knockout de Fmr1 (o gene que codifica a FMRP) em animais transgênicos. Aqui relatamos um método in vivo para determinar a função autônoma celular da FMRP durante o período de montagem do circuito e formação sináptica usando embriões de galinha. Este método emprega eletroporação específica de estágio, local e direção de um sistema vetorial induzível por droga contendo Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) e um repórter EGFP. Com este método, obteve-se o knockdown seletivo da FMRP no gânglio auditivo (GA) e em um de seus alvos do tronco encefálico, o núcleo magnocelular (NM), proporcionando assim uma manipulação componente-específica dentro do circuito AG-NM. Além disso, o padrão de mosaico da transfecção permite controles dentro de animais e comparações de neurônios / fibras vizinhas para maior confiabilidade e sensibilidade na análise de dados. O sistema vetorial induzível fornece controle temporal do início da edição gênica para minimizar os efeitos acumulados no desenvolvimento. A combinação dessas estratégias fornece uma ferramenta inovadora para dissecar a função autônoma celular da FMRP no desenvolvimento sináptico e de circuitos.

Introduction

A síndrome do X Frágil (FXS) é um transtorno do neurodesenvolvimento caracterizado por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e comportamentos autistas. Na maioria dos casos, a FXS é causada por uma perda global de proteína de retardo mental X frágil (FMRP; codificada pelo gene Fmr1) a partir dos estágios embrionários iniciais¹. A FMRP é uma proteína ligadora de RNA que normalmente é expressa na maioria dos neurônios e células gliais do cérebro, bem como nos órgãos sensoriais ^2,3,4. Em cérebros de mamíferos, a FMRP provavelmente est....

Protocol

Ovos e embriões de galinha foram manuseados com cuidado e respeito, de acordo com os protocolos de animais aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Jinan.

1. Preparação de óvulos e plasmídeos

1. Preparação de ovos
   1. Obter ovos de galinha fertilizados frescos (Gallus gallus) da Universidade Agrícola do Sul da China e armazenar a 16 °C antes da incubação. Para uma viabilidade ideal, coloque todos os ovos para incubação dentro de uma semana após a chegada.
   2. Colocar os ovos horizontalmente e incubar a 38 °C por 46-48 h até o estágio 12²⁵ de Hambu....

Results

Realizando-se em ovo-eletroporação em diferentes locais e em diferentes estágios de desenvolvimento, obteve-se knockdown seletivo da FMRP tanto na periferia auditiva quanto no tronco encefálico auditivo.

Knockdown da FMRP em NM
O pequeno RNA hairpin (shRNA) contra a galinha Fmr1 foi projetado e clonado no sistema vetorial Tet-On conforme descrito anteriormente²⁰. A configuração para eletroporação in ovo é mostrada na

Discussion

Para determinar a função autônoma celular da FMRP, é necessário manipular sua expressão em grupos celulares individuais ou tipos de células. Uma vez que uma das principais funções da FMRP é regular a formação sináptica e a plasticidade, manipular seletivamente cada componente sináptico de um determinado circuito é pré-requisito para uma compreensão completa do mecanismo FMRP na comunicação sináptica. Utilizando na ovoporação embriões de galinha, demonstramos um método para direci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
incubação de ovos
16 > Geladeira C	MAGAT		Usado para armazenamento de óvulos fertilizados.
Incubadora de ovos	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Ovos fertilizados	Fazenda da Universidade		Os ovos devem ser usados em uma semana para uma ótima viabilidade.
Preparação de plasmídeo
Centrífuga	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Faça 0,1% de solução de trabalho em água destilada e autoclave.
Kit de preparação de plasmídeo Maxi-prep	QIAGEN	12162	Dissolva o DNA do plasmídeo em tampão Tris-EDTA (TE); kit de preparação sem endotoxinas
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S2889	Faça uma solução de trabalho de 7,5M em água sem nuclásio.
Eletroporação e Administração de Doxiciclina
Eletroporador	BTX	ECM399
Seringa de 1 mL / 5 mL	GUANGZHOU KANGFULAI
Microscópio de dissecação	CNOPTEC	SZM-42
Doxciclina	Sigma-Aldrich	D9891	Use alíquotas frescas para cada dose e armazene a -20 & graus; C.
Capilar de vidro	BEIBOBOMEI	RD0910	0,9-1,1 mm*100 mm
Parafilm de laboratório	PARAFILM	PM996
extrator de pipeta de	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Condição de tração: 500 ° C por 15 s
Elctrodes de platina	Feito em		com 0,5 mm de diâmetro, intervalo de 1,5 mm.
Tubo de borracha	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tamanho da ponta: 0,05*0,01 mm
Outras ferramentas cirúrgicas	RWD
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	158127	A solução de PFA a 4% recém-feita em solução salina tamponada com fosfato pode ser armazenada em 4 ° C por até 1 semana.
Kit de elastômero de silicone SYLGARD 184	DOW	01673921	Para placas de fundo preto, é aplicado pó de carbono de qualidade alimentar.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatina	Sigma-Aldrich	G9391	De pele bovina.
Micrótomo deslizante	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 cabra anti-rato	Abcam	ab150113	diluição 1:500, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 cabra anti-coelho	Abcam	ab150078	diluição 1:500, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 diluição
Fluoromount-G meio de montagem	Sul  Biotech	Sb-0100-01
FMRP anticorpo	Y. Wang, Florida State University	#8263	diluição 1:1000, RRID: AB_2861242
Islet-1 anticorpo	DSHB	39.3F7	diluição 1:100, RRID: AB_1157901
placa Netwell	Corning	3478
Anticorpo de neurofilamento	Sigma-Aldrich	N4142	diluição 1:1000, RRID: AB_477272
Anticorpo de parvalbumina	Sigma-Aldrich	P3088	diluição 1:10000, RRID: AB_477329
anticorpo SNAP25	Abcam	ab66066	diluição 1:1000, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		software de edição de imagens
Microscópio confocal	LEICA	SP8
Estereomicroscópio fluorescente	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		pacote de software de processamento de imagem comercial