Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

As modificações enzimáticas conduzem à metilação ativa e à desmetilação da citosina em 5-metilcitosina (5-mC) e subsequente oxidação de 5-mC em 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carboxilcitosina ^1,2. O fosfato de tris(1,3-dicloro-2-propil) (TDCIPP) é um retardador de chama amplamente utilizado nos Estados Unidos que já demonstrou alterar a trajetória de metilação da citosina após exposição embrionária precoce de 0,75 horas pós-fertilização (hpf) até gastrulação precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Dentro dos vertebrados, o 5-mC e seus derivados modificados são críticos para regular o desenvolvimento embrionário precoce⁹. A fertilização de um embrião desencadeia a desmetilação do DNA parental, seguida pela degradação do mRNA materno, ativação do genoma zigótico e remetilação do genoma zigótico⁹. Processos biologicamente relevantes que utilizam metilação de citosina incluem modificação de histonas, recrutamento de maquinário transcricional, metilação de RNA, reprogramação epigenética e determinação da estrutura da cromatina^10,11. A metilação da citosina também é conservada entre as espécies de vertebrados, ressaltando a importância de compreender e investigar como a metilação aberrante da citosina pode afetar a trajetória do desenvolvimento de um organismo¹¹. Além disso, o desenvolvimento in utero é sensível à exposição materna e tem o potencial de causar desfechos adversos, como consequências fenotípicas imediatas, efeitos a longo prazo na suscetibilidade à doença do adulto e efeitos transgeracionais de marcas epigenéticas hereditárias^12,13,14.

Longos trechos de pares citosina-guanina, ou ilhas CpG, têm sido os focos primários de pesquisadores que visam caracterizar a dinâmica da metilação da citosina em todo o genoma^15,16,17. Estratégias baseadas em bissulfito, como sequenciamento de bissulfito de genoma inteiro, sequenciamento de bissulfito de representação reduzida e sequenciamento de amplificador de bissulfito representam o padrão-ouro para interrogar a metilação da citosina na resolução do par de bases. No entanto, as abordagens baseadas em sequenciamento são proibitivas em termos de custo e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a metilação da citosina em estágios de desenvolvimento, múltiplas concentrações por produto químico e replicar embriões por tratamento. Além disso, as abordagens baseadas em sequenciamento não fornecem informações sobre localização espacial, o que é crítico para a compreensão de tipos de células e áreas potencialmente afetadas dentro de um embrião em desenvolvimento. Da mesma forma, ensaios globais de metilação do DNA, como análise de restrição dependente de metilação, imunoensaios enzimáticos (ELISAs) de 5-mC e cromatografia líquida-massa (LC-MS) de 5-metil-2'-desoxicitidina (5-mC) dependem de homogeneizados celulares ou teciduais e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a localização e a magnitude da metilação da citosina no espaço e no tempo dentro de espécimes intactos^12,18.

Devido à facilidade de imagens automatizadas in vivo , manipulações genéticas, rápido tempo de desenvolvimento ex utero e criação durante a embriogênese, os embriões de peixe-zebra continuam a ser amplamente utilizados como modelos fisiologicamente intactos para descobrir vias mediadas por xenobióticos que contribuem para resultados adversos durante o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, usando anticorpos comercialmente disponíveis específicos para 5 mC, o protocolo abaixo descreve uma estratégia econômica para monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação da citosina em embriões individuais e intactos de peixe-zebra, aproveitando a imuno-histoquímica (IHC) de montagem completa, imagens automatizadas de alto conteúdo e processamento de dados eficiente usando linguagem de programação antes da análise estatística.

Para o conhecimento atual, este método é o primeiro a monitorar 5-mC dentro de embriões intactos de peixe-zebra. O método permite a detecção da metilação do DNA dentro da massa celular e também tem a capacidade de detectar a metilação da citosina de mRNAs maternos localizados na gema durante a transição materna-zigótica. No geral, este método será útil para a rápida identificação de produtos químicos que têm o potencial de interromper a metilação da citosina in situ durante a reprogramação epigenética.

Os criadores adultos foram manuseados e tratados de acordo com um protocolo de uso animal aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (#20180063) na Universidade da Califórnia, Riverside.

1. Recolha de embriões de peixe-zebra e exposição química

1. Adicione armadilhas de reprodução no tanque a tanques contendo peixes-zebra machos e fêmeas adultos sexualmente maduros e reprodutivamente viáveis. Adicionar pelo menos três armadilhas por tanque de 6 L pelo menos 12 h antes da coleta às ~9:00 da manhã, que é o tempo aproximado de fertilização e desova dos ovos dentro dos tanques.
2. Prepare uma solução de exposição fresca na manhã da coleta. A solução de exposição é preparada utilizando uma pipeta de 5 ml e adicionando 5,0 ml de água do sistema isenta de partículas a uma placa de Petri de vidro de 60 mm.
3. Em seguida, use uma pipeta microcapilar de vidro de 10 μL para transferir 10 μL de veículo (sulfóxido de dimetilo ou DMSO) ou solução de estoque químico para o sistema de água no prato de vidro.
4. Gire a placa de Petri de vidro para garantir que a solução de estoque se dissipe. Adicione mais 5,0 mL de água do sistema à placa de Petri de vidro. Gire a placa de Petri de vidro para homogeneizar a solução de exposição.
5. Repetir para cada grupo de tratamento em repetições de quatro para produzir quatro repetições por tratamento.
6. Após a preparação das soluções de exposição, tampe os pratos de vidro com tampas de vidro para minimizar a evaporação.
7. Ao remover as armadilhas de reprodução de cada tanque, permita cuidadosamente que a água dentro de cada armadilha escorra para o tanque antes de remover dos tanques. Certifique-se de que as armadilhas permaneçam do lado direito para cima.
8. Transfira as armadilhas de reprodução para a pia do laboratório e enxágue-as usando uma garrafa de esguicho cheia de água de osmose reversa (RO) em uma rede de peixe previamente embebida em 10% de água sanitária e enxaguada com água. Lave os embriões até que todos os detritos sejam limpos e apenas embriões limpos permaneçam.
9. Transfira os embriões da rede de peixe usando uma garrafa de esguicho cheia de água RO para uma placa de Petri de plástico de 100 mm. Classificar aleatoriamente 50 embriões vivos às 0,75 h pós-fertilização (hpf) e remover o excesso de água RO.
10. Usando uma microespátula, coloque embriões classificados na solução de tratamento. Todos os embriões devem estar dentro do veículo ou da solução de tratamento não antes das 9:45 da manhã. Gire os pratos de vidro para garantir que os embriões sejam uniformemente revestidos dentro da solução de tratamento.
11. Depois de quatro placas replicadas (N = 50 por replicação) terem sido configuradas para cada grupo de tratamento, coloque a tampa de vidro em cima das placas de exposição e transfira todas as placas para uma incubadora com temperatura controlada a 28 °C até 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf ou 10 hpf.
12. Preparar o paraformaldeído fresco a 4% (PFA) pelo menos 4 h antes do termo da exposição e conservar a 4 °C.
    1. Ligue a placa de aquecimento a 115 °C, faça 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x (2 mL de 10x PBS + 18 mL de água RO) em um tubo de centrífuga de 50 mL e pese 800 mg de paraformaldeído.
    2. Dentro de um exaustor químico, transfira 1x solução de PBS para um balão de Erlenmeyer de 250 mL, adicione 800 mg de paraformaldeído e, em seguida, adicione 2 μL de 10 N NaOH. Colocar um termómetro no interior do balão, colocar o balão na chapa quente e observar a temperatura enquanto agita.
    3. Quando a temperatura atingir 62-65 °Cremova o PFA a 4% da placa quente e deixe-o arrefecer até à temperatura ambiente (RT). Conservar o PFA a 4% a 4 °C.
13. Uma vez que a duração da exposição tenha terminado, remova os embriões da incubadora e transfira todos os embriões vivos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Aspirar a solução de exposição residual utilizando uma pipeta de 1 ml. Não aspirar embriões.
14. Adicione 500 μL de PFA a 4% refrigerado a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e misture os embriões em 4% de PFA invertendo várias vezes. Permita que os embriões se fixem em 4% de PFA durante a noite.
    NOTA: Não é recomendado permitir que os embriões permaneçam em PFA por mais de 12 h.

2. Dechorionação de embriões

1. No dia seguinte, aspirar o PFA a 4%, ressuspender os embriões em 1x PBS e pipetar suavemente para cima e para baixo por 30 s. Se necessário, pare o protocolo nesta etapa e armazene os embriões em 1x PBS a 4 °C por até 48 h.
2. Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira cuidadosamente embriões fixos para um prato de vidro cheio de água RO e gire suavemente por 30 s. Repita esta etapa mais uma vez.
3. Use agulhas de seringa com ampliação de 5,0x usando um estereomicroscópio padrão para decorionar manualmente todos os embriões. Faça isso usando a ponta da agulha para perfurar o córion e descascá-lo suavemente para longe da gema e da massa celular⁴.
4. Uma vez que os embriões tenham sido decorionados, use uma pipeta microcapilar de vidro para transferir até 25 embriões intactos para uma cesta de imunoquímica (IHC) e coloque a cesta IHC em uma placa de 96 poços. Use uma pipeta de 1 mL para aspirar a água RO de cada poço.

3. Imuno-histoquímica usando anticorpo específico de 5 mC

1. Ressuspender os embriões em 500 μL de tampão bloqueador (1x PBST + 2% de soro de ovino + 2 mg/mL de albumina sérica bovina) por poço e envolver a placa com parafilme e folha de alumínio para protegê-los da luz. Incubar a 4 °C durante 4 h num agitador orbital (100 rpm).
2. Remova o envoltório de parafilme e o alumínio e use uma pipeta de 1 mL para aspirar o tampão de bloqueio de cada poço. Substitua-o por 500 μL de uma diluição de 1:100 do anticorpo anti-5-mC monoclonal do rato no tampão de bloqueio. Incubar todos os embriões com anticorpos primários, exceto um subconjunto de embriões de controle de veículos que serão incubados com o tampão de bloqueio para explicar o ruído de fundo. Tenha cuidado para não perturbar a integridade dos embriões, nem para aspirar embriões durante esta etapa.
3. Reembrulhe a placa em parafilme e folha de alumínio e deixe a placa incubar a 4 °C durante a noite num agitador orbital (100 rpm).
4. No dia seguinte, remova a solução de anticorpos primários de cada poço e substitua-a por 1x PBS + Tween-20 a 0,1% (1x PBST). Lave cada poço três vezes com 1x PBST por 15 min por lavagem em um agitador orbital (100 rpm).
5. Substitua 1x PBST por uma diluição de 1:500 do anticorpo IgG anti-rato de cabra em tampão de bloqueio e incube todos os embriões com o anticorpo secundário. Deixar a placa incubar a 4 °C durante a noite num agitador orbital (100 rpm).
6. No dia seguinte, remova o anticorpo secundário e lave a solução residual três vezes com 1x PBST por 15 min por lavagem em um agitador orbital (100 rpm).
   NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui por até 48 h se as cestas IHC forem armazenadas em poços limpos preenchidos com 1x PBS.
7. Use uma pipeta de 1 mL para aspirar 1x PBST de cada poço e coloque a cesta IHC em uma placa de Petri de vidro cheia de água RO. Sob um estereomicroscópio padrão, classifique aleatoriamente embriões intactos em uma placa de 96 poços, resultando em um embrião por poço.
8. Usando uma pipeta de 1 mL, remova toda a água RO de poços individuais e substitua-a por 200 μL de 1x PBS. Centrifugar a placa durante 3 min a 1 x g.

4. Imagem automatizada de embriões dentro de placas de 96 poços

1. Fotografe os embriões com uma objetiva de 2x sob luz transmitida e FITC usando um sistema de triagem de alto conteúdo (Tabela de Materiais).
   NOTA: Uma imagem fluorescente de cada embrião foi capturada automaticamente usando a ampliação acima mencionada e um filtro FITC¹⁹.
   1. Selecione Foco automático para garantir que o foco da câmera esteja na parte inferior da placa e deslocado pela espessura inferior.
   2. Selecione um comprimento de onda FITC com uma duração de exposição de 100 ms e defina o foco automático para laser com um deslocamento Z. Observe e confirme a aquisição adequada de imagens em vários poços antes de iniciar a aquisição da placa.
      NOTA: O instrumento adquire automaticamente imagens de todos os poços selecionados que contenham embriões. Uma placa de 96 poços exigiu aproximadamente 30 minutos para aquisição de imagens e armazenamento de dados. Durante o período de aquisição, a temperatura interna dentro do sistema de imagem foi mantida no TR.
2. Após a aquisição da imagem, realize a análise de dados usando o sistema de triagem de alto conteúdo e um procedimento personalizado de análise automatizada de imagens. Selecione cada embrião na placa de 96 poços a ser analisado quanto à área total e intensidade integrada de fluorescência.
   NOTA: A análise incluiu o fornecimento de imagens que continham sobreposições de pontos de dados da análise.
3. Em seguida, tabular os pontos de dados e exportá-los do sistema de triagem de alto conteúdo indo em Medir e selecionando Abrir Log de Dados para uma planilha. As porções de aquisição de placas e análise de dados estão representadas na Figura 1.

5. Análise dos dados

1. Carregue a planilha exportada em um programa de computador em que o pacote deployer (dplyr) é usado para classificar, somar dados para cada poço e filtrar por número de poço. O pacote writexl é então usado para exportar os dados somados para uma planilha. O código do programa 5mC é mostrado no arquivo suplementar 1.

O objetivo geral deste protocolo é determinar se um tratamento afeta a abundância relativa de 5 mC, avaliando a área total e a intensidade relativa da fluorescência dentro de embriões de peixe-zebra fixos e marcados. Depois de completar o protocolo, um estereomicroscópio de fluorescência pode ser usado para primeiro determinar se a IHC de montagem completa foi bem-sucedida. Quando embriões marcados são observados sob um filtro FITC ou GFP, um resultado positivo é indicado por um sinal positivo de FITC dentro do embrião, enquanto um resultado negativo é indicado pela ausência de fluorescência dentro dos embriões controle. Usando um sistema de triagem de alto conteúdo, esses resultados também podem ser confirmados durante a aquisição de imagens usando um filtro FITC. Além disso, durante a análise dos dados, o módulo personalizado identificará e quantificará a área total e a intensidade integrada da fluorescência. Imagens representativas de resultados bem-sucedidos são mostradas na Figura 1, onde as imagens adquiridas foram medidas com sucesso pelo módulo personalizado, e pontos de dados individuais (mostrados como sobreposição azul) foram adquiridos tanto para a área total quanto para a intensidade integrada.

Durante a extração de dados, a stringência do limite dentro do módulo personalizado é uma variável adicional que precisa ser otimizada para maximizar a relação sinal-ruído e aumentar a probabilidade de detectar uma diferença significativa específica de tratamento na abundância de 5 mC. Durante a otimização, esse limiar final forneceu a separação mais significativa entre as medianas dos grupos de controle e tratamento (por exemplo, a maior relação sinal-ruído). Resultados representativos em diferentes limiares de módulos personalizados que afetam as relações sinal-ruído são apresentados na Figura 2.

Figura 1: Um diagrama de fluxo que fornece uma representação gráfica do protocolo de exposição e detecção in situ de 5-metilcitosina para embriões de peixe-zebra de 6 hpf. A direção do diagrama de fluxo é fornecida com setas pretas. As exposições ocorreram em repetições de quatro pratos replicados por tratamento e 50 embriões por prato replicado. Abreviaturas: cm = massa celular; ys = saco vitelino. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Otimização do módulo personalizado. Os painéis A-D mostram a otimização do módulo personalizado, avaliando a mediana e a distribuição da área total específica de 5 mC e da intensidade integrada dentro de embriões de peixe-zebra a 6 hpf. (A,B) Os diferentes limiares testados estão listados na legenda à direita (diferença de 100 entre cada limiar) e são ordenados por rigor, onde 1500 e 2500 representam os limiares menos e mais rigorosos testados, respetivamente. (C,D) Os diferentes limiares testados são listados na legenda à direita (diferença de 250 entre cada limiar) e ordenados por rigor, onde 1500 e 2500 representam os limiares menos e mais rigorosos testados, respectivamente. O (*) em C,D denota limiares significativamente diferentes dos embriões tratados em veículo (p < 0,05). Para A,B, todos os limiares testados foram significativos a partir do controle do veículo. O eixo x denota exposição a qualquer veículo (DMSO de 0,1%) ou TDCIPP (controle positivo) de 0,78 μM. O eixo y denota fluorescência relativa. O Painel A exibe a área total de 5 mC detectada dentro dos embriões em função do tratamento, enquanto o Painel B exibe a intensidade integrada de 5 mC dentro dessa mesma área. Um embrião é representado por um único ponto de dados para um total de N = 96 para cada grupo de tratamento. Todas as exposições foram realizadas em repetições de quatro pratos por tratamento com 50 embriões por prato de vidro. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: código de programa 5mC. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter parecido influenciar o trabalho relatado neste artigo.