C. elegans Dissecção de Gônadas e Congelamento de Fissuras para Imunofluorescência e Coloração DAPI

A meiose é a divisão celular especializada utilizada para a criação de gametas (óvulos e espermatozoides/pólen) em todos os organismos sexualmente reprodutores ^1,2. A recombinação cruzada é a troca recíproca de DNA entre cromossomos homólogos; é essencial para a meiose, fornecendo uma importante fonte de diversidade genética e promovendo a estabilidade do genoma através das gerações. Os cromossomos que não conseguem formar pelo menos um cruzamento durante a meiose se segregam aleatoriamente, o que pode resultar em não-disjunção cromossômica, criando gametas com o número incorreto de cromossomos – uma condição que geralmente é fatal para a progênie^{resultante 3}. Durante a meiose, os cruzamentos são induzidos por quebras programadas de DNA de fita dupla⁴. Um subconjunto dessas quebras será reparado como cruzamentos que fornecem ligações físicas de DNA, chamadas quiasmatas, que ajudam a orientar cromossomos homólogos em preparação para a divisão celular⁵. Os estágios meióticos são altamente conservados em todos os eucariotos, e sua conformação cromossômica permite que eles sejam facilmente identificados.

Como um conceito fundamental em biologia, a meiose é um tópico que os alunos encontram várias vezes em diferentes cursos de biologia. Eles são frequentemente introduzidos à mecânica da segregação cromossômica meiótica no ensino médio, enquanto os cursos de nível universitário se concentram na biologia celular da segregação e no impacto genético da recombinação cruzada. No entanto, a meiose é um conceito notoriamente complicado para muitos estudantes¹. A não compreensão da relação entre genes, DNA, cromossomos e meiose pode gerar equívocos e lacunas na compreensão dos alunos que impedem uma compreensão completa da herança genética ^6,7. Uma maneira de melhorar a compreensão dos alunos sobre tópicos abstratos é fornecer atividades concretas e práticas. Por exemplo, ao ensinar meiose, os instrutores podem escolher entre atividades que emulam a análise molecular⁸, modelos 3D que permitem aos alunos manipular moléculas⁹ ou dramatização em que os próprios alunos encenam a coreografia molecular¹. Incorporar pesquisas com resultados desconhecidos é uma maneira particularmente eficaz de melhorar a compreensão dos alunos. Essa prática é conhecida como experiência de iniciação científica baseada em cursos (CURE) e tem o benefício adicional de fortalecer as atitudes e a agência dos alunos, especialmente para aqueles pertencentes a grupos que permanecem sub-representados no STEM^10,11. O verme nematoide Caenorhabditis elegans é particularmente passível de estudos em sala de aula de comportamento, fertilidade e cruzamentos genéticos, e é um modelo eficaz para introduzir os alunos à pesquisa biológica¹².

C. elegans faz um poderoso organismo modelo para a biologia celular, combinando genética molecular com análise citológica simples. Também é particularmente adequado para uso em sala de aula de biologia ^13,14,15. Eles são fáceis e econômicos de manter em laboratório, produzindo centenas de descendentes a cada 3 dias, tanto à temperatura ambiente padrão quanto a 20 °C, a temperatura de incubação mais comum. É importante ressaltar que eles podem ser congelados como estoques de glicerol e mantidos em um freezer de -80 °C, o que significa que quaisquer erros de criação cometidos por pesquisadores novatos podem ser facilmente corrigidos¹⁶. Além disso, seu genoma bem anotado permite técnicas genéticas avançadas e reversas^17,18, permitindo que C. elegans seja utilizado para abordar questões biológicas que vão desde as moleculares até as evolutivas. Finalmente, os pesquisadores de C. elegans criaram uma comunidade de apoio que muitas vezes está disposta a fornecer ajuda e conselhos para cientistas iniciantes¹⁹. Essas vantagens levaram à incorporação de C. elegans em vários CUREs em vários tipos de instituições 12,19,20,21,22,23.

Além de seus benefícios para a pesquisa e o ensino, C. elegans tornou-se um modelo popular para estudos de meiose e desenvolvimento germinativo^24,25,26. A clareza óptica desses animais simplifica as abordagens citológicas²⁷ e, em adultos, as gônadas representam quase metade do animal, fornecendo centenas de células meióticas para estudo. Nas gônadas, os núcleos da linha germinativa meiótica são dispostos como uma linha de montagem (Figura 1); A replicação mitótica ocorre na ponta distal da gônada, com os núcleos progredindo através de estágios meióticos à medida que migram em direção à extremidade proximal da gônada, onde embriões fertilizados emergem da vulva. Como a organização espacial estereotipada também representa uma progressão temporal através da meiose, diferentes estágios podem ser facilmente identificados com base em sua organização cromossômica e localização na gônada. Finalmente, processos que interrompem a meiose e causam aneuploidia criam fenótipos que são simples de caracterizar, mesmo para novatos: esterilidade, letalidade embrionária ou alta incidência de machos (fenótipo de Him)²⁸.

Este é um protocolo simples para visualizar cromossomos meióticos em C. elegans. Montagem, dissecção, fixação e coloração de anticorpos são todos realizados na mesma lâmina do microscópio, o que simplifica o protocolo e permite a recuperação quase perfeita da amostra. Este método funciona para coloração DAPI simples para visualizar cromossomos e pode ser usado para imunofluorescência para visualizar a localização de proteínas na gônada. Os alunos dissecam gônadas usando microscópios básicos de dissecação, geram preparações de montagem completa para visualização de DNA ou imunofluorescência e as fotografam em um microscópio fluorescente composto. Este protocolo foi ensinado a estudantes do ensino médio e estudantes de graduação que trabalham em um laboratório de pesquisa de C. elegans e incorporado a um CURE em uma faculdade de artes liberais¹². Embora o CURE tivesse uma classe relativamente pequena, este protocolo seria passível de aulas em uma variedade de instituições devido ao custo relativamente baixo de cepas de vermes e reagentes. Os instrutores seriam limitados apenas pelo número de microscópios de dissecação disponíveis para uso. A implementação anterior tinha alunos trabalhando em grupos de três para compartilhar um único microscópio e ocorreu ao longo de três sessões de 90 minutos: a primeira para praticar dissecção, a segunda para implementar dissecção e coloração DAPI e a terceira para lâminas de imagem em um microscópio de fluorescência de campo amplo. A participação em pesquisas de graduação proporciona muitos benefícios para os estudantes^11,29, tanto acadêmicos quanto pessoais. A incorporação de pesquisas em cursos via CUREs permite que os alunos participem de pesquisas durante o tempo normal de aula^11,30,31, o que torna a exposição a esses benefícios mais acessível e equitativa.

1. Criação de C. elegans

NOTA: Consulte o protocolo de manutenção¹⁶ de C. elegans e Elgin et ^al.32 para obter mais detalhes. As cepas de C. elegans podem ser facilmente adquiridas no Caenorhabditis Genetics Center (https://cgc.umn.edu) e são enviadas por correio normal para qualquer local nos EUA. Cada cepa custa US $ 10, e cada laboratório / usuário paga uma taxa anual de US $ 30.

1. Usando a técnica estéril, prepare placas de ágar de meio de crescimento de nematoides de 6 cm (placas de ágar NGM).
   NOTA: As placas derramadas podem ser armazenadas de cabeça para baixo em suas mangas de plástico originais ou recipientes herméticos a 4 °C por vários meses.
   1. Para fazer placas de ágar NGM, adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona de Bacto, 20 g de ágar NGM e ddH₂O a 1 L (~ 975 mL). Autoclave o meio usando um ciclo líquido que se mantenha a 121 °C por 20 min. Deixe esfriar a 55 °C, e pela técnica estéril, adicione 1 mL de colesterol, 0,5 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄ e 25 mL de 1 M tampão fosfato de potássio (pH 6).
      NOTA: Para fazer 1 M tampão fosfato de potássio, misture 108,3 g de KH 2 PO4 (monobásico) e 35,6 g de K₂HPO₄ (dibásico); se necessário, ajuste o pH para 6 usando KOH. Adicione ddH₂O até 1 L (geralmente ~900 mL) e autoclave por 40 min a 121 °C. 1 L de NGM faz cerca de 100 placas contendo 10 mL cada.
2. Usando uma pipeta sorológica ou de transferência, identifique as placas com três gotas de culturas bacterianas de E.coli OP50 (~150 μL). Tente detectar no centro da placa e evite colocar pontos muito próximos das bordas da placa; isso desencorajará os animais de rastejar pelas laterais das placas e dessecar.
3. Uma vez que o gramado bacteriano secar, armazene as placas manchadas de cabeça para baixo à temperatura ambiente (RT) por até 2 semanas. Detectar placas pelo menos 1-2 dias antes do uso permitirá que os gramados bacterianos cresçam mais espessos e suportem uma maior densidade de animais.
   NOTA: Para preparar as culturas bacterianas OP50, o OP50 pode ser encomendado ao Caenorhabditis Genetics Center. A bactéria OP50 é riscada de um estoque de glicerol para uma placa LB para garantir colônias únicas e mantida a 4 °C por 4-6 semanas. As culturas bacterianas OP50 são cultivadas em NV durante a noite a 37 °C de uma única colônia – nenhuma agitação é necessária. Para preparar o meio LB, adicionar 10 g de triptona, 10 g de NaCl, 5 g de extrato de levedura, 950 mL de ddH 2 O, ajustar o pHpara 7 com 10 N NaOH e ajustar o volume final para 1 L com ddH₂O. Aliquot em quantidades de 100 mL e autoclave por 20 min a 121 °C.
4. Para criar um estoque de trabalho para cada cepa, escolha três hermafroditas de estágio L4 em uma placa NGM manchada. Conservar as placas a 15-25 °C. A condição padrão de cultivo é de 20 °C. Se o acesso a incubadoras com temperatura controlada não estiver disponível, mantenha as culturas na bancada no RT.
   NOTA: Os hermafroditas de estágio L4 podem ser facilmente estadiados tanto pelo tamanho (menor que os adultos) quanto pela presença de um semicírculo distinto no meio de seus corpos (a vulva em desenvolvimento). A 20 °C, os animais atingirão o estágio L4 34-46 h após a eclosão (que é de cerca de 40-52 h após a colocação dos embriões). Ver Corsi et ^al.14 para mais detalhes sobre o momento dos estágios de desenvolvimento.
   1. Mude as culturas para várias temperaturas para controlar a taxa de desenvolvimento. Os animais crescerão mais rápido em temperaturas mais altas e mais lentos em temperaturas mais baixas. Eles começarão a se tornar estéreis a temperaturas superiores a 25 °C.
      NOTA: Alguns genótipos mutantes são sensíveis à temperatura e exibirão fenótipos diferentes, dependendo da temperatura de cultivo.
5. Mantenha os estoques de trabalho colhendo três hermafroditas de estágio L4 para uma nova placa de NGM manchada a cada 4 dias. Isso garantirá uma população constante e bem alimentada, com uma ampla gama de estágios de desenvolvimento.

2. Dissecção de gônadas

1. Coletando adultos com idade compatível: 12-24 horas antes da dissecção, escolha hermafroditas em estágio L4 para uma nova placa NGM manchada – estes crescem em adultos jovens no dia seguinte, o que é ideal para a dissecção. O número de hermafroditas em estádio L4 dependerá da análise citológica que está sendo realizada; geralmente, 10-20 hermafroditas são dissecados por lâmina, com duas a quatro lâminas geradas por condição.
   NOTA: As gônadas são mais eficientemente extrudadas em animais bem alimentados. Certifique-se de escolher hermafroditas L4 de estoques de trabalho que não estão famintos (ou seja, ainda têm um gramado bacteriano visível presente na placa). Animais famintos tendem a sofrer extrusões de gônadas incompletas, tornando-os difíceis de visualizar.
   1. Se avaliar estágios posteriores da meiose, como a diacinese, dissecar idosos (48 h pós-L4) porque eles acumulam mais núcleos em estágio de diacinese, simplificando a análise. No entanto, os pesquisadores devem observar a possibilidade de que alguns efeitos possam ser causados pela idade materna avançada.
2. Prepare-se para a dissecação.
   1. Prepare M9: Adicione 3 g de KH 2 PO 4 (monobásico), 6 g de Na 2 HPO₄ (dibásico), 5 g de NaCl e adicione ddH₂O a 100 mL. Autoclave a solução por 20 min a 121 °C, deixe esfriar e, em seguida, adicione 1 mL de 1 M MgSO₄ usando a técnica estéril.
   2. Preparar tampão dissecante: Misture 1 μL de 10% Tween 20, 12 μL de levamisole de 100 mM, 10 μL de 10x M9 e 77 μL de ddH₂O.
      NOTA: Tween 20 é incluído no tampão de dissecação para reduzir a tensão superficial e permeabilizar ainda mais as membranas teciduais.
   3. Preparar solução fixa (PFA a 2% [100 μL]): Misture 12,5 μL de paraformaldeído a 16% (PFA), 10 μL de 10x M9 e 77,5 μL de ddH₂O; Certifique-se de usar uma ampola fresca de PFA (aberta por não mais de 2 semanas).
      CUIDADO: O PFA é um produto químico perigoso e a solução fixa deve ser preparada no exaustor.
   4. Configurar o método de congelamento - nitrogênio líquido é mais fácil de gerenciar, mas, se necessário, um bloco de alumínio pode ser usado em cima de gelo seco.
      1. Método de nitrogênio líquido: Coloque um copo de plástico ou um frasco de plástico Coplin em uma caixa de poliestireno. Encha o copo com nitrogênio líquido (o transbordamento para o recipiente de poliestireno é bom). Coloque a pinça nas proximidades. Idealmente, o copo deve ser estreito o suficiente para evitar que as lâminas do microscópio caiam completamente na horizontal - as lâminas devem ficar inclinadas e ser fáceis de agarrar com pinças.
         NOTA: É importante usar recipientes de plástico ao trabalhar com nitrogênio líquido em vez de vidro para evitar a quebra devido ao resfriamento rápido.
      2. Método do gelo seco:
         1. Coloque um bloco de alumínio plano no gelo seco em um recipiente de poliestireno ou balde de gelo retangular. É mais fácil congelar os slides se a parte superior do bloco ficar acima da parte superior do recipiente.
         2. Usando luvas, pressione suavemente o bloco de alumínio para garantir um bom contato com o gelo seco e acelerar o processo de resfriamento (pode liberar um guincho à medida que o metal esfria rapidamente). Coloque uma lâmina de barbear nas proximidades.
         3. Deixe o bloco de alumínio em gelo seco por pelo menos 30 minutos antes da parada de congelamento para permitir o resfriamento total, o que é necessário para um congelamento rápido.
            NOTA: Idealmente, blocos sólidos de gelo seco devem ser usados, o que ajuda a superfície a permanecer nivelada. Se necessário, o bloco de alumínio pode ser colocado em pellets de gelo seco, mas deve-se tomar cuidado para garantir que a superfície permaneça nivelada.
         4. A superfície do bloco de alumínio coletará geada, o que pode impedir o contato próximo entre as lâminas e o bloco. Use a lâmina de barbear para raspar a geada da superfície, limpando uma área para cada lâmina. Cobrir o recipiente de poliestireno com uma tampa ajudará a evitar o acúmulo excessivo de geada.
   5. Encha um frasco Coplin com ~40 mL de etanol a 95%.
   6. Encha três frascos Coplin com ~40 mL de PBS-T.
      NOTA: Para fazer PBS-T, misture 100 mL de PBS 10x, 5 mL de Triton X-100 e 2 mL de EDTA 0,5 M (pH 8). Adicione 873 mL de ddH2O. Agite vigorosamente para dissolver Triton X-100. Para fazer 10x PBS, misture 25,6 g de Na 2HPO 4·7H 2 O, 80 g de NaCl, 2 g de KCl e 2 g de KH₂PO₄. Adicione ddH₂O para elevar o volume até 1 L. Autoclave por 40 min a 121°C. O detergente Triton X-100 está incluído no tampão de lavagem PBS-T para reduzir a tensão superficial e aumentar a retenção de animais montados inteiros na lâmina.
3. Dissecar os animais numa tampa de vidro de 18 mm x 18 mm. Esta etapa é sensível ao tempo devido à evaporação do tampão de dissecação. Deve levar menos de 5 minutos para terminar as dissecações.
   NOTA: O levamisol é usado para imobilizar animais para torná-los mais fáceis de dissecar, mas deixá-los em levamisol por muito tempo resultará em extrusão de gônadas deficiente. É mais fácil reduzir o número de animais dissecados por lâmina, a fim de caber dentro do período de tempo de 5 minutos.
   1. Coloque uma lâmina de retenção no palco de um microscópio de dissecação - a lâmina de retenção é usada para mover a lâmina de cobertura com mais facilidade e pode ser reutilizada indefinidamente (Figura 2A, foto à esquerda).
   2. Colocar a tampa sobre a corrediça de retenção e canalizar 4 μL da solução de dissecação no centro da lâmina de cobertura. Mova o slide de retenção para um lado do palco para liberar o modo de exibição.
   3. Escolha 10-20 hermafroditas na gota de solução dissecante. Escolha animais suficientes para criar uma imagem de ~10 por slide, mas não tantos que não possam ser dissecados dentro de 5 minutos.
   4. Dissecar os animais com duas agulhas de seringa, uma para cada mão (Figura 2A).
      1. Atravesse os pontos das agulhas para fazer uma forma de X e use a parte inferior do X para prender um adulto até a superfície da tampa.
         NOTA: Pode ser preciso prática para descobrir a melhor maneira de segurar cada agulha em termos de ângulo e rotação. Comece segurando as agulhas com seus biséis (borda inclinada) voltados para baixo. Veja a discussão para sugestões sobre o primeiro aprendizado a dissecar em um volume maior (Figura 2D).
      2. Posicione a forma de X imediatamente atrás da faringe, cerca de 1/5 do comprimento do corpo de um adulto jovem, ou logo abaixo da parte clara da cabeça (Figura 2A, diagrama à direita).
      3. Decapite o animal com um movimento de tesoura (como cortar comida com uma faca e um garfo). Uma boa extrusão resultará em um braço da gônada (ou às vezes ambos os braços) liberando totalmente da cavidade corporal, juntamente com uma ou ambas as metades do intestino (Figura 2B, imagem à esquerda). O intestino parecerá mais escuro e de largura uniforme, enquanto a gônada aparecerá clara com uma ponta cônica distal.
         1. Cada animal só deve ser cortado uma vez; se a gônada não se extrudar depois de fazer o corte, basta passar para o próximo animal. O primeiro corte reduz significativamente a pressão hidrostática no corpo, o que torna improvável que quaisquer cortes adicionais resultem em uma melhor extrusão. Extrusões incompletas ou pobres são facilmente visíveis durante a imagem e podem ser ignoradas (Figura 2B, imagem à direita).
            NOTA: Não tente separar a gônada da carcaça - isso geralmente rasgará o tecido e limitará o número de estágios meióticos que podem ser analisados.
      4. Repetir a dissecação para os restantes animais no boletim de cobertura.
4. Fixar a amostra com formaldeído.
   1. Trabalhando suavemente, pipetar 4 μL da solução de fixação na tampa deslizar muito perto da gota com animais. Idealmente, as gotas estão próximas o suficiente para se fundir; evitar pipetar diretamente na gota de dissecação e deslocar as carcaças dissecadas.
   2. Prenda a folha de cobertura à corrediça de retenção usando um dedo. Com a outra mão, mexa suavemente a tampa algumas vezes para misturar as gotas. A concentração de fixação final é de 0,8% de PFA.
   3. Segurando um slide carregado positivamente na parte frontal para baixo, use-o para pegar o deslizamento de cobertura no centro do slide. Toque suavemente na gota da amostra e a tensão superficial da gota pegará a tampa.
      NOTA: As lâminas carregadas positivamente têm um revestimento eletrostático que ajuda os tecidos a aderir à superfície para evitar a perda de amostras.
      1. Se desejar, posicione a tampa diagonalmente, de modo que um canto fique pendurado na borda superior ou inferior do slide em 1 mm. Deixar uma saliência facilitará a quebra da tampa após o congelamento (Figura 2C).
   4. Defina o slide no banco e fixe por exatamente 5 minutos no RT. Durante esse tempo, rotule o slide com um lápis.
      NOTA: É comum a fixação excessiva das amostras, que podem ser detectadas por uma exclusão de anticorpos dos núcleos ou mesmo de todos os tecidos. Além disso, alguns anticorpos são particularmente sensíveis ao formaldeído. Nestes casos, reduzir o tempo de fixação, ou diminuir a concentração final de formaldeído utilizado.
5. Freeze-crack
   1. Imediatamente após a correção, congele os slides.
      1. Se estiver usando nitrogênio líquido: Segure a borda rotulada da lâmina com uma pinça e baixe-a suavemente em nitrogênio líquido. Solte o escorregador de tal forma que ele se incline contra o lado do béquer, do lado da tampa para cima. As lâminas são congeladas dentro de 10 s (uma vez que o líquido pára de ferver).
      2. Se estiver usando gelo seco: raspe a geada da superfície do bloco de alumínio com uma navalha. Segure firmemente a borda rotulada do slide e coloque-a na superfície limpa, aplicando alguma pressão para baixo para garantir o contato total com o bloco. A tampa deve estar completamente na superfície do bloco. O congelamento ocorre dentro de 10 s e pode ser confirmado visualmente à medida que a amostra sob a cobertura se transforma em gelo.
      3. Para ambos os métodos, deixe os slides por pelo menos 5 minutos para congelar completamente.
         NOTA: Uma vez congeladas, as lâminas podem ser deixadas em nitrogênio líquido ou no bloco por 15-20 min, desde que permaneçam congeladas. Isso permite que vários slides sejam coletados neste estágio antes de prosseguir para a etapa de rachadura.
   2. Trabalhando rapidamente, quebre a tampa da amostra. Esta etapa é sensível ao tempo. Retire a tampa e mergulhe a lâmina em etanol antes que a amostra comece a descongelar.
      1. Remova a lâmina congelada (usando uma pinça para nitrogênio líquido).
      2. Segure firmemente a borda curta rotulada do slide e prenda uma borda longa contra o banco.
      3. Com a outra mão, segure firmemente uma navalha e deslize a borda da navalha pelo slide para afastar a tampa da amostra. Essa etapa é um pouco mais fácil se a tampa estiver posicionada com uma saliência de canto (Figura 2C).
6. Coloque imediatamente a lâmina em um frasco Coplin contendo 95% de etanol em RT. Deixe as lâminas em etanol por pelo menos 5 min.
   NOTA: As lâminas podem ser deixadas em etanol por um tempo - isso permite que várias lâminas sejam coletadas nesta etapa antes de prosseguir para as lavagens. Os slides também podem ser armazenados nesta etapa por vários dias. Se estiver armazenando, mova o frasco Coplin de lâminas em etanol para -20 °C.
7. Lave as lâminas em PBS-T três vezes por 5 min cada em RT. Use PBS-T fresco para cada lavagem.
8. Se a coloração com anticorpos, prossiga para a etapa 3 (coloração de anticorpos). Se apenas a coloração com DAPI para visualizar cromossomos, prossiga para a etapa 4 (montagem e imagem).

3. Coloração de anticorpos

1. Incubação de anticorpos primários
   NOTA: Ao elaborar condições apropriadas para novos anticorpos, é importante incluir os seguintes controles negativos para verificar a especificidade do sinal fluorescente: 1) Uma lâmina que não possui um anticorpo primário e tem apenas um anticorpo secundário; 2) uma lâmina com apenas um anticorpo primário que não possui um anticorpo secundário. Cada um desses controles negativos deve produzir uma completa falta de sinal. Se a fluorescência for identificada na lâmina secundária apenas de anticorpos, a diluição secundária de anticorpos deve ser aumentada ou uma secundária diferente deve ser usada. Se a fluorescência for identificada na lâmina primária somente de anticorpos, é provável que seja devido à autofluorescência ou a outros contaminantes potenciais.
   1. Diluir o anticorpo primário em tampão de diluição de anticorpos (50 mg de BSA + 50 μL de azida de sódio a 10% + 10 mL de PBS-T) - prepare diluição de anticorpos suficiente para usar 20-30 μL por lâmina.
   2. Prepare uma câmara úmida: Forre o fundo de um recipiente de plástico com uma tampa hermética com toalhas de papel úmidas. Coloque uma única camada de pipetas Pasteur de vidro em cima das toalhas de papel. Esses pipetos criam uma superfície que permite que os slides permaneçam nivelados e os mantém elevados fora das toalhas de papel.
      NOTA: Para câmaras úmidas, é melhor usar recipientes plásticos de armazenamento de alimentos com tampas de encaixe, o que facilita a abertura e o fechamento do recipiente sem interromper as lâminas internas. Procure um que seja longo o suficiente para os pipets Pasteur, mas também tenha um fundo relativamente plano sem recuos para permitir que os slides descansem totalmente horizontais.
   3. Remova o slide da lavagem final do PBS-T. Trabalhe rapidamente a partir deste passo em frente para manter a amostra molhada em todos os momentos e evitar a evaporação. Se a amostra secar, a coloração de anticorpos será afetada negativamente.
   4. Seque toda a superfície da lâmina usando um tecido de limpeza dobrado em um retângulo compacto. Limpe a frente e o verso do slide, mas deixe bastante espaço ao redor da amostra. Tome cuidado especial ao secar a superfície perto da amostra - evite se aproximar demais da amostra, o que deixa uma área do tamanho da tampa sem fundo. No entanto, certifique-se de que o perímetro da amostra está seco para a próxima etapa.
   5. Desenhe um círculo ao redor da amostra usando uma caneta PAP hidrofóbica. Tenha cuidado para envolver toda a área da amostra, mas evite interromper as carcaças de animais visíveis na superfície da lâmina. Aguarde ~5 s para permitir que a barreira seque completamente.
      NOTA: Uma barreira hidrofóbica é necessária para conter a solução primária de anticorpos porque a superfície da lâmina foi revestida em PBS-T, que contém um detergente. A caneta PAP funciona melhor em uma superfície de deslizamento seca, por isso é importante criar um perímetro seco ao redor da amostra. Deixar a área mais próxima da amostra não seca protege a amostra durante esta etapa
   6. Trabalhando rapidamente, use o canto ou a borda do tecido de limpeza dobrado para afastar o líquido da amostra dentro da barreira hidrofóbica. Tome cuidado para evitar interromper as carcaças dos animais.
   7. Canalize imediatamente 20 μL da solução de anticorpos primários para o anel criado pela barreira hidrofóbica. Tome cuidado para pipetar suavemente e em um ângulo para evitar a interrupção das carcaças. Evite pipetar diretamente sobre qualquer carcaça.
   8. Incline a lâmina suavemente para garantir que toda a superfície dentro da barreira hidrofóbica esteja coberta pela solução.
      NOTA: É melhor que as barreiras hidrofóbicas tenham uma circunferência interior de 1-1,5 cm, que é totalmente coberta por 20 μL da solução de anticorpos. A largura da circunferência dependerá de como as carcaças são distribuídas durante a etapa de congelamento-rachadura. Barreiras mais amplas podem exigir um volume maior de solução de anticorpos. Se desejado, pequenos quadrados de parafilme (cortados para o tamanho da tampa de 18 mm x 18 mm) podem ser suavemente colocados em cima da amostra. Os quadrados de parafilme garantirão que a solução de anticorpos cubra toda a amostra e também ajudará a evitar a evaporação.
   9. Repita as etapas 3.1.3-3.1.8 para o restante dos slides.
   10. Transfira cuidadosamente as lâminas para a câmara úmida, garantindo que a solução permaneça contida dentro da barreira hidrofóbica e que as lâminas estejam completamente niveladas.
   11. Incubar as lâminas durante a noite no RT. Dependendo do anticorpo, esta etapa pode ser encurtada para 6 h ou realizada durante a noite a 4 °C, mantendo a câmara úmida em uma câmara fria ou geladeira.
       NOTA: O uso de uma câmara úmida e barreiras hidrofóbicas geralmente é suficiente para evitar a evaporação da solução de anticorpos, mesmo para incubações longas durante a noite. No entanto, se a evaporação provar ser um problema, pequenos quadrados de parafilme podem ser colocados suavemente sobre cada amostra, o que ajudará a evitar a evaporação. Estes podem ser removidos na primeira etapa de lavagem: mergulhe cada lâmina em um frasco Coplin cheio de PBS-T (não contendo outras lâminas) e permita que o parafilme flutue para longe da amostra. Remova o parafilme do frasco Coplin antes de usar o mesmo frasco para remover o parafilme do próximo slide.
2. Lave as lâminas em frascos Coplin contendo ~40 mL de PBS-T três vezes por 5 min cada em RT. Use PBS-T fresco para cada lavagem.
   1. Durante estas lavagens, diluir o anticorpo secundário em tampão de diluição de anticorpos. Prepare diluição de anticorpos suficiente para usar 20-30 μL por lâmina. É comum o uso de anticorpos secundários conjugados Alexa Fluor diluídos em 1:200.
3. Incubação secundária de anticorpos
   1. Remova o slide da lavagem final do PBS-T. Trabalhe rapidamente a partir deste passo em frente para manter a amostra molhada em todos os momentos e evitar a evaporação.
   2. Seque a lâmina usando um lenço de papel de limpeza dobrado. Evite secar a área contida pela barreira hidrofóbica.
   3. Trabalhando rapidamente, use o canto ou a borda do tecido de limpeza dobrado para afastar o líquido da amostra dentro da barreira hidrofóbica. Tome cuidado para evitar atrapalhar as carcaças dos animais.
   4. Pipetar imediatamente 20 μL da solução de anticorpos secundários para o anel criado pela barreira hidrofóbica. Tome cuidado para pipetar suavemente e em um ângulo para evitar a interrupção das carcaças.
   5. Evite pipetar diretamente sobre qualquer carcaça. Certifique-se de que toda a superfície dentro da barreira hidrofóbica esteja coberta pela solução. Circunferências de barreira mais amplas podem exigir um volume maior de solução de anticorpos. Se desejar, cubra a amostra com um pequeno quadrado de parafilme (ver a nota abaixo passo 3.1.8).
   6. Transfira cuidadosamente a lâmina para a câmara úmida, garantindo que a solução permaneça contida dentro da barreira hidrofóbica e que a lâmina esteja completamente nivelada. Substitua a tampa da câmara úmida para manter a corrediça no escuro.
   7. Repita as etapas 3.3.1-3.3.6 para o restante dos slides.
   8. Incubar no escuro por 4 h no RT.
      NOTA: Dependendo do anticorpo, este passo pode ser encurtado para 2 h ou estendido para 6 h. Se a câmara úmida não estiver escura, coloque-a em uma gaveta ou cubra-a com uma caixa de papelão. Alternativamente, a câmara úmida pode ser envolta em papel alumínio para manter as lâminas no escuro.
4. Lave as lâminas em frascos Coplin contendo ~40 mL de PBS-T três vezes por 5 min cada em RT. Use PBS-T fresco para cada lavagem.

4. Montagem e geração de imagens

1. Prepare-se para a montagem da amostra tendo meio de montagem + DAPI (2 μg/mL), tampas de vidro de 18 mm x 18 mm e esmalte de unhas ao alcance.
2. Retire a lâmina da lavagem final e seque usando um lenço de limpeza dobrado. Evite secar a área contida pela barreira hidrofóbica.
3. Usando o canto do tecido de limpeza dobrado, retire cuidadosamente o líquido da amostra dentro da barreira. Retire a maior parte do líquido nesta etapa, mas sem deixar as carcaças secarem completamente.
4. Trabalhando rapidamente, adicione 8 μL do meio de montagem à amostra. Pipetar suavemente e em ângulo para evitar a ruptura das carcaças. Evite pipetar diretamente sobre as carcaças.
5. Ainda trabalhando rapidamente, abaixe cuidadosamente uma tampa de vidro sobre a amostra.
   1. As bolhas de ar podem interromper a imagem e levar à degradação da amostra. Para minimizar as bolhas de ar, apoie uma borda da tampa na lâmina ao lado da amostra, de modo que ela seja mantida na diagonal sobre a amostra. Pode ajudar a descansar a borda mais alta da folha de cobertura em um lápis ou pinça. Em seguida, abaixe lentamente a borda mais alta da tampa deslize para baixo - esse movimento permite que o meio de montagem crie uma vedação líquida progredindo de uma borda para a borda oposta.
6. Repita as etapas 4.2-4.5 para o restante dos slides.
7. Sele as tampas com esmalte. Tome cuidado para evitar pressionar a tampa (que esmagará a amostra) ou desalojar a lâmina de cobertura horizontalmente (o que manchará a amostra).
   1. Adicione um pequeno ponto de esmalte a cada canto de uma tampa (~1 mm de largura). Estes ajudarão a manter a tampa no lugar. Deixe os pontos secarem completamente.
   2. Quando os cantos estiverem completamente secos, sele as bordas com esmaltes. Certifique-se de que o polimento preencha completamente a lacuna entre o deslizamento da tampa e o deslizamento, mas evite cobrir demais a tampa. É melhor manter uma sobreposição de 1 mm na tampa. Use apenas o quanto for necessário esmalte. Evite usar demais ou ter excesso de polimento, que pode levar muito tempo para secar e corre o risco de danificar a objetiva do microscópio.
      NOTA: É preferível usar esmalte colorido em vez de claro, o que facilita a visualização do limite do selo e ajuda a evitar a imagem de animais que se encontram sob o limite do esmalte.
   3. Deixe o esmalte secar completamente antes da imagem. Este passo é importante, pois o esmalte molhado pode danificar severamente os objetivos do microscópio.
      NOTA: Os slides devem ser mantidos no escuro, tanto quanto possível, a partir de agora. Use uma caixa de papelão plana para cobri-los enquanto secam no banco.
8. Armazene as lâminas no escuro a 4 °C por 1-2 semanas antes da imagem. Se necessário, armazene as lâminas a -20 °C por um período mais longo.
9. Imagem usando microscopia de luz composta de fluorescência padrão.
   1. Para cada slide, primeiro, examine toda a amostra a 10x no canal DAPI para identificar gônadas bem extrudadas e anotar seu posicionamento. Para a maioria das aplicações, evite criar imagens de quaisquer gônadas que estejam cortadas, incompletas ou parcialmente cobertas por outra parte do animal. Para a maioria dos animais, apenas um braço de gônada será totalmente extrudado e visível.
      NOTA: Pode ser útil obter uma imagem de ampliação mais baixa em 10x de toda a gônada no canal DAPI para usar para orientação posterior ou identificar a localização de núcleos específicos.
   2. Dependendo da aplicação, as imagens podem ser tiradas em 40x, 63x ou 100x. Se toda a gônada for capturada, crie uma montagem com limites sobrepostos. Durante a imagem, lembre-se de que a gônada é um tubo oco, com núcleos mais densos na parte superior e inferior.

O DAPI liga-se fortemente ao DNA, e sua coloração é robusta mesmo sob uma ampla variedade de condições (Figura 3A,B). Deve estar presente em todos os núcleos e, portanto, faz um controle positivo eficaz para a presença de qualquer tecido verme na lâmina e a capacidade de detectar fluorescência no microscópio. A coloração é eficaz quando o anticorpo está presente nos núcleos meióticos (Figura 3A,B). Por exemplo, a Figura 3A,B mostra núcleos de paquiteno médio corados com DAPI e um anticorpo direcionado ao RAD-51, um marcador para quebras de fita dupla. O KLE-2 é um componente da condensina, um complexo proteico altamente conservado que estrutura cromossomos em preparação para mitose e meiose. Os mutantes kle-2/+ apresentam pequenos defeitos na estrutura cromossômica, como demonstrado pela coloração DAPI levemente desordenada e um aumento no número de quebra de fita dupla refletido no maior número de focos RAD-51 (Figura 3B). Um erro comum para a imunofluorescência é deixar a amostra na solução fixa por muito tempo. A fixação excessiva pode levar a uma coloração malsucedida porque geralmente impede que os anticorpos se difundam nos núcleos. Este erro pode ser identificado quando o anticorpo é difundido nas regiões citoplasmáticas da gônada, mas parece ser excluído dos núcleos.

Na linha germinativa (Figura 1), os núcleos proliferam mitoticamente na ponta distal, entram em meiose durante a zona de transição e progridem através do paquiteno (que muitas vezes é dividido em três estágios iguais por várias fileiras de núcleos) antes de entrar no diploteno e, finalmente, na diacinese. Os ovócitos na diacinese são numerados com base em sua proximidade com a espermateca, com o ovócito -1 sendo mais proximal à espermateca, o ovócito -2 sendo o próximo distal, e assim por diante. C. elegans tem seis cromossomos, que se manifestam como ovais compactos em núcleos de diacinese. Cada uma delas representa um par homólogo de duas cromátides irmãs mantidas juntas por um quiasma, também chamado de bivalente (Figura 3C). Mutantes, como o spo-11, que interrompem a formação de cruzamentos não conseguirão formar quiasmas; portanto, os núcleos de diacinese terão 12 corpos DAPI separados (também chamados de univalentes), um para cada cromátide irmã (Figura 3D).

Figura 1: Os núcleos germinativos são dispostos de maneira espaço-temporal que representa sua progressão através da meiose . (A) Hermafrodita adulto jovem de montagem inteira corada com DAPI. Os estágios gônadas e meióticos são delineados, desde a ponta distal (asterisco) até a região proximal (o ovócito -1, indicado com uma seta), que contém a espermateca (triângulo). A barra de escala representa 100 μm. (B) Imagem de fluorescência projetada de uma gônada hermafrodita dissecada corada com DAPI. Estágios meióticos são denotados, com núcleos representativos mostrados em inserções (todas as inserções são mostradas em escala umas com as outras). Os núcleos podem ser facilmente estadiados com base em sua localização na linha germinativa e morfologia cromossômica característica, progredindo da zona mitótica na ponta distal (asterisco), para a zona de transição, através de paquiteno, diploteno e diacinese. A espermateca é marcada por um triângulo. Este número foi adaptado de Hillers et al. sob a licença CC BY 3.028. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Demonstração da configuração da dissecção . (A) Estágio do microscópio durante a dissecção. Os animais são dissecados em 4 μL de solução de dissecção numa folha de cobertura colocada na lâmina de retenção, que é utilizada para mover a lâmina de cobertura para a vista. O diagrama mostra o posicionamento ideal da agulha. As agulhas são seguradas com uma borda chanfrada voltada para baixo, atravessada sobre a região faríngea. As setas cor-de-rosa demonstram um movimento de tesoura para agulhas. A linha tracejada rosa mostra o local de corte ideal. (B) Imagens de animais dissecados, com um exemplo de uma extrusão completa e uma extrusão incompleta. Seções de gônadas e tripas extrudadas são rotuladas. (C) Imagem demonstrando a etapa de congelamento-rachadura. O slide deve ser segurado firmemente em uma mão, com o lado da tampa voltado para longe do corpo. A borda oposta é apoiada contra o banco. A navalha deve ser segurada na outra mão. A seta rosa indica a direção do movimento para a navalha para sacudir a tampa do slide, com um leve giro de tal forma que a tampa se afaste do corpo. Observe que a tampa foi colocada de tal forma que um canto fica pendurado sobre a borda longa do slide. (D) Imagem da configuração para a prática de dissecação em uma placa de coloração embrionária de vidro. Os animais são colocados em 50-200 μL de solução de dissecção, o que nega o problema da evaporação e prolonga o tempo de dissecção. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados representativos de fluorescência de núcleos germinativos. (A,B) Projeções de pilha Z de núcleos de paquiteno tardio corados com anticorpos RAD-51 (verde) e DAPI (vermelho) em heterozigotos (A) selvagens e (B) kle-2/+. (C,D) Projeções de pilha Z de um único núcleo de diacinese corado com DAPI em (C) tipo selvagem (com seis corpos de coloração DAPI) e (D) mutantes spo-11 (com 12 corpos de coloração DAPI). As barras de escala representam 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar. O conteúdo deste manuscrito é de exclusiva responsabilidade dos autores. Não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde ou da National Science Foundation.