Artigo de método

Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2

DOI:

10.3791/64213

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25 de julho de 2022

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1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina "Plug-and-Display", incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Resumo

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Nanopartículas biomiméticas obtidas de bactérias ou vírus têm atraído um interesse substancial na pesquisa e desenvolvimento de vacinas. As vesículas da membrana externa (OMVs) são secretadas principalmente por bactérias gram-negativas durante o crescimento médio, com um diâmetro nanométrico e atividade auto-adjuvante, o que pode ser ideal para a administração da vacina. Os OMVs têm funcionado como um sistema de entrega multifacetado para proteínas, ácidos nucleicos e pequenas moléculas. Para aproveitar ao máximo as características biológicas das OMVs, as OMVs derivadas de Escherichia coli de bioengenharia foram utilizadas como transportadoras e o domínio de ligação ao receptor (RBD) do SARS-CoV-2 como antígeno para construir uma plataforma de vacina "Plug-and-Display". Os domínios SpyCatcher (SC) e SpyTag (ST) em Streptococcus pyogenes foram aplicados para conjugar OMVs e RBD. O gene da citolisina A (ClyA) foi traduzido com o gene SC como uma proteína de fusão após a transfecção do plasmídeo, deixando um sítio reativo na superfície das OMVs. Após a mistura do RBD-ST em um sistema tampão convencional durante a noite, formou-se ligação covalente entre as OMVs e o RBD. Assim, uma vacina OMV multivalente exibindo foi alcançada. Ao substituir por diversos antígenos, a plataforma de vacina OMVs pode exibir eficientemente uma variedade de antígenos heterogêneos, prevenindo assim potencialmente rapidamente epidemias de doenças infecciosas. Este protocolo descreve um método preciso para a construção da plataforma de vacina OMV, incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Introdução

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Como potencial plataforma vacinal, as vesículas de membrana externa (OMVs) têm atraído cada vez mais atenção nos últimos anos 1,2. As OMVs, principalmente secretadas naturalmente por bactérias gram-negativas3, são partículas esféricas em nanoescala compostas por uma bicamada lipídica, geralmente no tamanho de 20-300 nm4. As OMVs contêm vários componentes bacterianos parentais, incluindo antígenos bacterianos e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), que servem como potencializadores imunológicos sólidos5. Beneficiando-se de seus componentes únicos, estrutura natural da vesícula e ótimos locais de modificação de engenharia genética, os OMVs foram desenvolvidos para uso em muitos campos biomédicos, incluindo vacinas bacterianas6, adjuvantes7, medicamentos de imunoterapia contra o câncer8, vetores de entrega de medicamentos9 e adesivos antibacterianos10.

A pandemia de SARS-CoV-2, que se espalhou por todo o mundo desde 2020, teve um pesado impacto na sociedade global. O domínio de ligação ao receptor (RBD) na proteína spike (proteína S) pode se ligar à enzima conversora de angiotensina humana 2 (ACE2), que então medeia a entrada do vírus na célula11,12,13. Assim, o RBD parece ser um alvo principal para a descoberta da vacina14,15,16. No entanto, o RBD monomérico é pouco imunogênico, e seu pequeno peso molecular dificulta o reconhecimento do sistema imunológico, de modo que os adjuvantes são frequentemente necessários17.

A fim de aumentar a imunogenicidade dos RBD, foram construídas OMVs exibindo RBDs polivalentes. Estudos existentes que utilizam a VMO para exibir a RBD geralmente fundem a RBD com a OMV para serem expressas em bactérias18. No entanto, o RBD é uma proteína derivada do vírus, e a expressão procariótica provavelmente afetará sua atividade. Para resolver esse problema, o sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivado de Streptococcus pyogenes, foi utilizado para formar um isopeptídeo covalente com OMV e RBD em um sistema tampão convencional19. O domínio SC foi expresso com Citolisina A (ClyA) como proteína de fusão por bioengenharia de Escherichia coli, e ST foi expresso com RBD através do sistema de expressão celular HEK293F. OMV-SC e RBD-ST foram misturadas e incubadas durante a noite. Após purificação por ultracentrifugação ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), OBTEVE-SE OMV-RBD.

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Protocolo

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1. Construção do plasmídeo

  1. Inserir a sequência SpyCatcher codificadora de DNA (Arquivo Suplementar 1) em um plasmídeo pThioHisA-ClyA resistente à ampicilina (ver Tabela de Materiais) entre os sítios BamH I e Sal I para construir o plasmídeo pThioHisA ClyA-SC seguindo um relatóriopublicado anteriormente 20.
  2. Ligue o gene de fusão sintetizado SpyTag-RBD-Histag (Arquivo Suplementar 1) em um plasmídeo pcDNA3.1 (ver Tabela de Materiais) entre os sítios BamH I e EcoR I para construir o plasmídeo pcDNA3.1 RBD-ST seguindo um relatório publicado anteriormente19.

2. Preparação OMV-SC

  1. Execute a transformação ClyA-SC seguindo as etapas abaixo.
    1. Adicionar 5 μL de solução plasmídica pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) a 50 μL de cepa competente BL21, soprar suavemente e deixar esfriar no gelo por 30 min.
    2. Colocar a solução durante 90 s em banho-maria a 42 °C e, em seguida, colocar imediatamente a solução misturada no gelo durante 3 minutos.
    3. Adicionar 500 μL de meio LB à suspensão bacteriana e, após mistura, cultura a 220 rpm a 37 °C durante 1 h.
    4. Placa toda a transformação numa placa de ágar LB contendo ampicilina (100 μg/ml, ver Tabela de Materiais) e cultura durante a noite a 37 °C.
      NOTA: Em experimentos subsequentes, a ampicilina foi mantida na mesma concentração no meio. Se não, isso pode causar perda de plasmídeos nas bactérias.
  2. Para a produção do OMV-SC, execute as etapas abaixo.
    1. Isolar uma única colónia da placa (passo 2.1.4.) a 20 ml de meio LB (resistente à ampicilina) e cultivar durante a noite a 220 rpm a 37 °C.
    2. Inocular a solução bacteriana (a partir do passo 2.2.1.) em meio de 2 L, cultura a 220 rpm, 37 °C durante 5 h até à fase de crescimento logarítmico (a DOde 600 nm situa-se entre 0,6 e 0,8).
    3. Quando a DO a 600 nm da solução bacteriana atingir 0,6-0,8, adicionar isopropilbeta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, ver Tabela de Materiais) para que a concentração final da solução bacteriana seja de 0,5 mM e, em seguida, cultura durante a noite a 220 rpm a 25 °C.
  3. Realizar a purificação do OMV-SC.
    1. Centrifugar a solução bacteriana a 7 000 x g a 4 °C durante 30 minutos.
    2. Filtre o sobrenadante com um filtro de membrana de 0,22 μm e, em seguida, concentre-o usando uma membrana de ultrafiltração de 100 kD ou uma coluna de fibra oca (ver Tabela de Materiais).
    3. Filtrar o concentrado através de um filtro de membrana de 0,22 μm, centrifugar-o a 150.000 x g a 4 °C durante 2 h utilizando uma ultracentrífuga (ver Tabela de Materiais) e eliminar o sobrenadante com uma pipeta.
    4. Ressuspenda a precipitação com PBS e guarde-a a -80 °C. A solução pode manter a estabilidade a longo prazo a -80 °C.

3. Preparação do RBD-ST

  1. Realize a transfecção RBD-ST seguindo os passos abaixo.
    1. Selecione um sistema de expressão eucariótica apropriado (por exemplo, HEK293F) e cultive as células durante a noite a 130 rpm a 37 °C após a recuperação.
    2. Adicionar 20 μL de solução de células HEK293F ao contador de células automatizado (ver Tabela de Materiais), registar o número de células, ajustar a concentração para 1 x 106 células/ml e, em seguida, cultivar as células a 130 rpm a 37 °C durante 4 h.
    3. Filtrar o plasmídeo RBD-ST através de um filtro de membrana de 0,22 μm e adicionar 300 μg de plasmídeos no meio de cultura celular (ver Tabela de Materiais) até que o volume final seja de 10 ml; agitar por 10 s.
    4. Aqueça o PEI (1 mg/mL, ver Tabela de Materiais) a 65 °C no banho-maria, misture 0,7 mL de PEI com 9,3 mL de meio de cultura celular e agite intermitentemente por 10 s.
      NOTA: Não agite a solução vigorosamente. Caso contrário, as bolhas resultantes podem afetar a eficiência da transfecção.
    5. Adicionar a solução plasmídica à solução de PEI, agitar a mistura intermitentemente durante 10 s e incubá-la a 37 °C durante 15 minutos.
    6. Adicionar a mistura a 280 mL de meio de cultura celular e a cultura a 130 rpm a 37 °C por 5 dias.
  2. Realizar a purificação do RBD-ST.
    1. Centrifugar as células a 6.000 x g a 25 °C durante 20 minutos e utilizar uma pipeta para recolher o sobrenadante.
    2. Encha a coluna com 2 mL de agarose Ni-NTA (ver Tabela de Materiais) e lave-a 3x com 3x PBS.
    3. Adicione imidazol (ver Tabela de Materiais) ao sobrenadante celular para fazer a concentração final de 20 mM e carregue o sobrenadante celular 2x.
    4. Adicionar 3 volumes de coluna (CV) de PBS contendo 20 mM de imidazol para lavagem e recolher a fracção de lavagem.
    5. Eluição gradiente com 3 CV de PBS contendo concentrações baixas a altas (por exemplo, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) de imidazol; eluir 2x para cada concentração.
    6. Use SDS-PAGE21 para identificar o RBD-ST em diferentes gradientes de concentração.

4. Bioconjugação e purificação OMV-RBD

  1. Determinar a concentração de proteínas pelo método BCA (ver Tabela de Materiais).
    1. Diluir serialmente a solução proteica padrão de BSA de 2 mg/mL a 0,0625 mg/mL, diluir o OMV-SC purificado e o RBD-ST 10x e, em seguida, misturar as soluções de trabalho de BCA A e B (fornecidas no kit de ensaio) na proporção de 50:1 (v/v).
    2. Adicionar solução proteica diluída (25 μL/poço) e misturar com solução de trabalho de BCA (200 μL/poço); incubar a 37 °C durante 30 min.
    3. Medir a absorbância (OD) a 562 nm de cada poço e calcular a concentração de proteína a partir da curva padrão22.
  2. Realizar a bioconjugação de OMV-SC e RBD-ST seguindo os passos abaixo.
    1. Misture OMV-SC e RBD-ST em PBS na proporção 40:1 (p/p).
    2. Girar verticalmente para misturar a mistura durante a noite a 15 rpm a 4 °C.
      NOTA: Antígenos diferentes podem reagir em proporções diferentes. Pode-se tentar diferentes proporções de reação com base nas características do antígeno.
  3. Verifique a eficiência da reação.
    1. Preparar 10 μL de OMV-SC, RBD-ST e o produto da reacção (passo 4.2.). Adicionar 2,5 μL de tampão de carga de 5x (ver Tabela de Materiais) e aquecer as amostras a 100 °C durante 5 min. Carregar as amostras no gel (10 μL/poço). Realize eletroforese a 60 V por 20 min e mude a condição para 120 V por 1 h.
    2. Transfira a proteína do gel para as membranas de Western Blotting PVDF (ver Tabela de Materiais) a 100 V durante 70 min.
    3. Coloque a membrana em 5% de leite em pó desnatado / TBST e agite por 1 h. Em seguida, lave 3x com TBST por 5 min por lavagem com agitação.
    4. Coloque a membrana em 0,1% de anticorpo/TBST His-Tag (ver Tabela de Materiais) e agite por 1 h, depois lave 3x com TBST por 5 min por lavagem com agitação.
    5. Coloque a membrana em 0,02% anticorpo IgG1 (HRP)/TBST anti-rato (ver Tabela de Materiais) e agite durante 40 min, depois lave 3x com TBST durante 5 min por lavagem com agitação.
    6. Adicionar solução de quimioluminescência melhorada (ver Tabela de Materiais) e expor a membrana.
  4. Realizar purificação de OMV-RBD.
    1. Diluir 1 mL de solução de OMV-RBD reagida a 10 mL e centrifugar a diluição a 150.000 x g a 4 °C por 2 h.
    2. Use uma pipeta para descartar o sobrenadante e suspender o resíduo com 10 mL de PBS. Centrifugar a suspensão a 150.000 x g a 4 °C durante 2 h.
    3. Descarte o sobrenadante e suspenda o resíduo com 1 mL de PBS.
      NOTA: Se a solubilidade do antígeno for muito menor, o mesmo efeito de separação pode ser obtido por cromatografia de exclusão de tamanho19.

5. Caracterização

  1. Execute o espalhamento dinâmico de luz (DLS).
    1. Diluir as amostras até uma concentração de 100 μg/ml e adicionar 1 ml de amostra à célula da amostra.
    2. Escolha "Tamanho" para "Tipo de medição", "Proteína" para "Material da amostra", "Água" para "Dispersante", "25 °C" para "Temperatura" e, em seguida, carregue as amostras e meça automaticamente23.
  2. Capture imagens usando microscopia eletrônica de transmissão (MET).
    1. Diluir as amostras a 100 μg/ml. Pegue uma grade de cobre de 200 malhas, adicione 20 μL de amostra a ela e deixe que ela seja absorvida por 10 min.
    2. Use papel de filtro para retirar a solução, adicione 20 μL de acetato de uranilo a 3% ao filme de suporte e core por 30 s.
    3. Retirar o acetato de uranilo e secar a película naturalmente à temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Carregue as amostras no sistema TEM (consulte Tabela de Materiais) e capture imagens a 80 kV.

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Resultados

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O fluxograma desse protocolo é mostrado na Figura 1. Este protocolo poderia ser uma abordagem geral para a utilização de OMVs como uma plataforma de vacinas; basta escolher os sistemas de expressão apropriados com base no tipo de antígenos.

A Figura 2 fornece um esquema de projeto de plasmídeos viável. O gene SC está conectado com o gene ClyA através de um ligador flexível, enquanto ST se conecta ao terminal 5' do gene RBD com um gene...

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Discussão

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Para criar uma plataforma de vacina de nanopartículas "Plug-and-Display", a ClyA fundida por SC foi expressa em cepas BL21(DE3), que é um dos modelos mais utilizados para a produção de proteínas recombinantes devido às suas vantagens na expressão proteica24, de modo que haveria fragmento de SC suficiente exibido na superfície das OMVs durante o processo de proliferação de bactérias. Ao mesmo tempo, um antígeno-alvo fundido ST foi preparado para o acoplamento químico entre os antígenos e OMVs. As v...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e o Projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 31670936, 82041045).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ampicilina sódicaSangon BiotechA610028
Contador de células automatizadoKitBioTech
cwbiocw0014s
Sistema de Imagem de Toque ChemiDocBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Aparelho de eletroforeseCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
pAb de cabra para camundongo IgG1Abcamab97240
Centrífuga de congelamento de alta velocidadeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbTecnologia de sinalização celular2366s
ImidazoleSangon Biotech
Isopropil beta-D-tiogalactopiranosídeoSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Leite em pó desnatadoSangon BiotechA600669
OPM-293 meio de cultura de célulasOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmídeoWuhan genecreat tecnologia
Tampão fosfato salinaZSGB-bioZLI-9061
Polietilenonimina Policiências Lineares23966-1
Escada de proteína PrestainedThermo26616
plasmídeo pThioHisA ClyA-SCWuhan genecreat tecnologia
PVDF Western Blotting MembranesRoche
sistemas de bancada Quixstand (coluna de fibra oca de 100 kD)Buffer de carregamento GE healthcare
SDS-PAGE (5x)BeyotimeP0015
Cloreto de sódioSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (solução de quimioluminescência aprimorada)Thermo34577
Instrumento de suspensãomisturadorHula da Life Technology
HitachiHT7800
de LP0042Boxóide triptona
Beckman coulterXPN-100
Espectrofotômetro ultravioletaHitachiU-3900
Extrato de leveduraSangon BiotechA610961
de quantificação de proteína BCA Countstar A600277biológicabiológica03010040001 Microscópio eletrônico de transmissão do Ultracentrífuga de

Referências

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