Artigo de método

Transferência mitocondrial de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de camundongo para oócitos de camundongo envelhecidos

DOI:

10.3791/64217

⸱

6 de janeiro de 2023

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos o isolamento de mitocôndrias de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo de camundongo e, em seguida, transferimos as mitocôndrias para oócitos de camundongos envelhecidos para melhorar a qualidade dos oócitos.

Resumo

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Devido ao declínio na quantidade e qualidade dos oócitos relacionados à idade, a fertilidade das mulheres com mais de 35 anos diminuiu drasticamente. Os mecanismos moleculares que mantêm a qualidade do oócito permanecem obscuros, portanto, é difícil aumentar a taxa de natalidade de mulheres com mais de 35 anos atualmente. Os oócitos contêm mais mitocôndrias do que qualquer tipo de célula do corpo, e qualquer disfunção mitocondrial pode levar à redução da qualidade do oócito. Na década de 1990, a transferência citoplasmática de oócitos resultou em grande sucesso na reprodução humana, mas foi acompanhada por controvérsias éticas. Espera-se que o transplante mitócondrio autólogo seja uma técnica útil para aumentar a qualidade dos oócitos que diminuíram devido à idade. No presente estudo, usamos células-tronco derivadas de tecido adiposo de camundongos idosos como doador de mitocôndrias para aumentar a qualidade dos oócitos de camundongos idosos. O desenvolvimento da tecnologia de transferência mitócondrial autóloga proporcionará um tratamento novo e eficaz para a infertilidade em mulheres idosas.

Introdução

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Um dos fatores importantes que afeta a fertilidade feminina é o envelhecimento do oócito; O declínio na qualidade do oócito é a principal causa de infertilidade em mulheres idosas. No entanto, a principal causa do envelhecimento oocitário e o mecanismo molecular que regula a qualidade do oócito ainda não estão claros. Estudos anteriores indicaram que tanto o número quanto a qualidade das mitocôndrias estão envolvidos no controle de qualidade dos oócitos e no desenvolvimento embrionário 1,2,3. A diminuição da quantidade e qualidade das mitocôndrias está intimamente relacionada ao envelhecimento3.

Muitas tentativas foram feitas para melhorar a função das mitocôndrias em oócitos envelhecidos, incluindo o suplemento nutricional das mitocôndrias e a transferência de mitocôndrias. Suplementos nutricionais bem conhecidos e eficazes das mitocôndrias incluem coenzima Q10 (CoQ10), ácido alfa-lipóico (α-LA) e resveratrol (RSV)4. Estudos demonstraram que a suplementação de CoQ10 pode não apenas melhorar o declínio relacionado à idade na quantidade e qualidade dos oócitos, mas também promover o desenvolvimento normal e a ovulação dos oócitos5. α-AL retarda o declínio da qualidade do oócito relacionado ao envelhecimento e ao fenótipo metabólico de pacientes com síndrome dos ovários policísticos (SOP)6,7. O resveratrol pode reduzir o número de oócitos com fusos anormais e alinhamento cromossômico inadequado aumentado em camundongos idosos, enquanto afeta o desenvolvimento embrionário de maneiradose-dependente 8. No entanto, como o efeito clínico dos suplementos nutricionais das mitocôndrias não atingiu os níveis esperados, outros tratamentos eficazes precisam ser explorados.

A primeira tentativa de transferência de mitocôndrias foi realizada em 1997. A transferência do citoplasma de oócitos de doadores jovens para oócitos receptores idosos melhorou a qualidade do oócito das pacientes idosas, que deram à luz bebês saudáveis com sucesso9, que foi a justificativa por trás do uso dessa técnica. No entanto, a transferência citoplasmática alogênica de oócitos não pode ser aplicada à prática clínica devido a duas razões principais - o problema da heterogeneidade genética e questões regulatórias causadas pelo transplante de mitocôndrias de doadores. Um estudo anterior mostrou que o transplante mitocondrial de células autólogas poderia melhorar a qualidade dos oócitos, o desenvolvimento embrionário e a fertilidade de camundongos idosos10, que não apresentava problemas éticos ou de heterogeneidade genética e resolveu alguns problemas causados pela transferência do citoplasma do oócito do doador para os oócitos receptores10,11.

Enquanto isso, a transferência mitocondrial de células autólogas foi superior ao efeito de suplementos nutricionais prévios de mitocôndrias na melhoria da qualidade dos oócitos11. Portanto, o transplante mitocondrial de células autólogas é a escolha adequada para a aplicação clínica dessa tecnologia12. As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) podem ser obtidas por tecnologia minimamente invasiva, são fáceis de isolar e cultivar e podem ser uma célula "semente" ideal para a medicina regenerativa. As mitocôndrias são ricas em ADSCs e a função das mitocôndrias não diminui com a idade, o que sugere que as ADSCs são uma excelente fonte de mitocôndrias13,14. Neste protocolo, introduzimos um método para transferir as mitocôndrias de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de camundongo para oócitos de camundongos envelhecidos para melhorar a qualidade do oócito. Este é um modelo útil para a tecnologia de transferência mitocondrial autóloga ADSC humana.

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Protocolo

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Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Terceiro Hospital Afiliado, Universidade de Soochow. Todas as operações seguem os cuidados e uso adequados dos animais e as diretrizes nacionais e de cuidados. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes de todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de camundongo envelhecido (ADSCs)

  1. Sacrifique os camundongos idosos (10 meses de idade, em média três) por luxação cervical sob anestesia com pentobarbital sódico e mergulhe-os em álcool a 75% por 5 minutos antes do isolamento do tecido adiposo.
    NOTA: A imersão em álcool a 75% por 5 min pode reduzir efetivamente a contaminação das células primárias.
  2. Faça uma incisão de 2 cm na pele no inguinal bilateral, exponha a gordura subcutânea e use uma pinça para isolar a gordura subcutânea. Colete a gordura inguinal bilateral dos camundongos usando uma tesoura oftálmica esterilizada (evite cortar o tecido subcutâneo). Coloque o tecido adiposo em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL no gelo e transporte-o imediatamente para o laboratório de cultura de células.
  3. Transfira o tecido adiposo para uma placa de 6 poços, enxágue 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 100 U/mL de penicilina e estreptomicina. Remova os vasos sanguíneos, fáscia gordurosa e tecido conjuntivo sob o tecido adiposo e corte-os em pedaços de ~ 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm.
    NOTA: Ao isolar células-tronco adiposas, muitas vezes há contaminação das células endoteliais vasculares. A remoção dos vasos sanguíneos do tecido adiposo pode reduzir a contaminação das células endoteliais vasculares.
  4. Transfira o tecido adiposo triturado para o mesmo volume de solução de colagenase tipo I (concentração final de 0,1% de colagenase tipo I) e digerir a 37 ° C por 30 min.
  5. Adicione um volume igual de meio de cultura completo (meio DMEM F-12 contendo 10% de soro bovino fetal) para neutralizar a colagenase tipo I, centrifugue a 600 × g por 10 min e descarte o sobrenadante e o tecido adiposo.
  6. Ressuspenda o sedimento celular no meio de cultura completo. Remova o tecido não digerido por filtração através de um filtro de células de 40 μm e, em seguida, centrifugue a 600 × g por 5 min.
  7. Ressuspenda a suspensão celular com 5 ml do meio de cultura completo e utilize uma pipeta de 1 ml para pipetar suavemente para cima e para baixo para formar uma suspensão unicelular. Verifique a suspensão celular ao microscópio colocando uma alíquota em um hemocitômetro para confirmar que existem apenas células chamuscadas, sem agregados. Adicionar a suspensão unicelular a um balão de cultura de2 células de 25 cm e cultivar numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C.
  8. Mudar o meio de cultura 48 h mais tarde. Continue a trocar o meio de cultura a cada 2-3 dias.
  9. Após 7 a 10 dias, desconecte as células para a passagem celular quando sua confluência atingir 80% -90%. Remova o meio de cultura completo e lave as células com 2 mL de PBS. Em seguida, adicionar 2 mL de tripsina/EDTA a 0,05% para realizar a dissociação celular15,16.
  10. Adicionar meio de indução adipogénica durante 14 dias para induzir a diferenciação das ADSCs em adicôctyes. Adicione meio de indução osteogênica por 28 dias às ADSCs semeadas em placas de 24 poços revestidas com gelatina a 2% para induzir sua diferenciação em osteoblastos. Para diferenciação neural, cultive as ADSCs com meio de indução neural e, em seguida, detecte a enolase específica do neurônio e o polipeptídeo mediador do neurofilamento usando imunofluorescência15.
    1. Fixe as células em paraformaldeído a 4% por 30 min em temperatura ambiente, seguido de permeabilização com Triton X-100 a 0,5% em PBS por 15 min.
    2. Após o bloqueio com 3% de BSA em PBS, incubar as células com anticorpos primários (ver Tabela de Materiais) diluídos em solução de bloqueio a 4 °C durante a noite.
    3. Incube as células com anticorpos secundários por 45 min e depois comode-as com DAPI por 10 min. Em seguida, examine as células com um microscópio de fluorescência.
  11. Colete a suspensão ADSC de célula única usando 0,05% de tripsina / EDTA, centrifugue a 600 × g por 5 min à temperatura ambiente e ressuspenda em PBS para ajustar a densidade da célula para 1 × 106 / mL. Alicote a suspensão celular em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (100 μL/tubo) e adicione anticorpos monoclonais CD29, CD90, CD34 e HLA-DR de coelho marcados com FITC, com uma concentração de anticorpos de 0,5 μg/mL. Trate o grupo controle com o mesmo volume de IgG FITC de coelho, incube em gelo por 30 min e enxágue com PBS para remover o anticorpo não conjugado. Detecte os marcadores de superfície ADSC por citometria de fluxo13.

2. Isolamento de mitocôndrias de células-tronco adiposas

NOTA: Todas as operações de isolamento das mitocôndrias devem ser realizadas no gelo.

  1. Quando as ADSCs atingirem 90% de densidade, digerir as células com 2 mL de tripsina a 0,05% / EDTA, centrifugar a 600 × g por 5 min, coletar e contar as células e tomar 1 × 107 células para cada extração.
  2. Ressuspenda as células em 2 mL de tampão de extração de mitocôndrias (para preparação do tampão: 10 mL de Tris-MOPS 0,1 M, 1 mL de EGTA/Tris 0,1 M e 20 mL de sacarose 1 M; traga o volume para 100 mL com água destilada e ajuste o pH para 7,4) com 1x coquetel de inibidor de protease após lavagem com 2 mL de PBS estéril, e depois incubar no gelo por 5 min.
  3. Homogeneizar as células 20x-30x com um homogeneizador de vidro (2,0 mL) e verificar o grau de homogeneização por coloração com azul de tripano.
    NOTA: A proporção das células coradas deve ser de ~ 80%. A homogeneização excessiva danificará a estrutura das mitocôndrias.
  4. Centrifugue o homogeneizado de células a 600 × g por 15 min, leve o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mL e repita a operação uma vez.
  5. Centrifugar o sobrenadante a 7.500 × g durante 15 min e rejeitar o sobrenadante. Lave o precipitado mitocondrial e ressuspenda-o adicionando ~ 100 μL de tampão de injeção mitocondrial pré-resfriado (225 mM de manitol, 75 mM de sacarose, 10 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl e 5 mM de KH2PO4, pH 7,2), a uma concentração de 1-5 mg / mL (concentração total de proteína). Transporte a suspensão mitocondrial no gelo.
  6. Analisar a função e a pureza das mitocôndrias isoladas por análise citométrica de fluxo JC-1 e Western blot (VDAC1, β-actina e Lamin B)13.
    1. Divida as mitocôndrias isoladas em três grupos: dimetilsulfóxido (DMSO), JC-1 corado e JC-1 corado com 30 min de pré-tratamento com cianeto de carbonila 3-clorofenilhidrazona (CCCP).
    2. Após centrifugação a 7.500 × g, rejeitar o sobrenadante e suspender o tampão.
    3. Capturar a intensidade de fluorescência dos monômeros JC-1 (canal FITC) e agregados (canal PE) que foram capturados por citometria de fluxo. Avalie os potenciais de membrana mitocondrial isolados medindo as proporções da intensidade média de fluorescência do canal PE para o canal FITC.
      NOTA: Execute as etapas acima no escuro.

3. Superestimulação ovariana

  1. Injete camundongos C57BL/6 fêmeas de 10 meses de idade por via intraperitoneal com 10 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) para superovulação. Após 48 h, injetar 10 UI de gonadotrofina coriónica humana (hCG) por via intraperitoneal.
  2. Às 13 h após a injeção de hCG, rasgue a trompa de Falópio inchada com uma pinça microscópica. Libere os complexos cumulus da trompa de Falópio inchada. Dissolver as células do cumulus em meio M2 com hialuronidase (0,3 mg/ml) a 37 °C.
    NOTA: O tempo de dissolução é inferior a 5 min. Minimize o tempo durante o qual o complexo cumulus é exposto à hialuronidase, pois a exposição prolongada pode prejudicar o potencial de desenvolvimento do oócito.

4. Transferência mitocondrial junto com ICSI

  1. Coloque o esperma sem cauda no líquido mitocondrial. Obtenha esperma sem cauda cortando usando ultrassom17. Coloque o espermatozóide sem cauda no líquido mitocondrial, de modo que haja 100 espermatozóides em 50 μL do líquido mitocondrial.
    NOTA: Como a suspensão mitocondrial é ligeiramente viscosa e não estável in vitro, conclua a injeção dentro de 30 minutos e troque a agulha de microinjeção imediatamente quando ela ficar entupida. O diâmetro interno ideal da agulha de microinjeção é de 5 μm.
  2. Injete ~ 2 pL de tampão respiratório mitocondrial ou suspensão mitocondrial com espermatozóides nos oócitos usando um microinjetor sob um microscópio invertido (200x; ver Tabela de Materiais) dentro de 30 min de acordo com o protocolo de Hiramoto conforme descrito por Mehlmann e Kline10,18.
    NOTA: A suspensão mitocondrial injetada é responsável por 1% -3% do volume total de oócitos. Controle o volume (1%-3%) da suspensão mitocondrial no citoplasma para garantir a consistência da injeção.
  3. Após a injeção, coloque os oócitos fertilizados em meio M2 para equilíbrio por 15 min e transfira os óvulos fertilizados sobreviventes para o meio de cultura M16.
  4. Examine os ovos férteis sobreviventes observando a morfologia suave, a formação pró-nuclear e a liberação do segundo corpo polar19. Observe, fotografe e conte os embriões às 09:00 e 18:00 todos os dias durante 4 dias. Finalmente, colete e congele os blastocistos e armazene-os em uma geladeira a -80 ° C para determinação do número de cópias de ATP e mtDNA para avaliar o número e a melhoria do transplante mitocondrial.
    1. Preparar plasmídeo-padrão (plasmídeo para quantificação absoluta, conforme descrito anteriormente13), para a determinação do número de cópias mitocondriais de acordo com o número de cópias de 1 × 107, 1 × 106, 1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102 e 1 × 101. Transfira os embriões para o tubo de esterilização e adicione 20 μL de tampão lisado para liberar o DNA mitocondrial. Em seguida, inative a protease no lisado a 55 °C por 20 min e 95 °C por 10 min.
    2. Determine o número de cópias do mtDNA por PCR quantitativo de fluorescência usando a seguinte configuração: 5 μL de mistura de PCR, 0,5 μL de primer B6 para frente, 0,5 μL de primer B6 rev, 2 μL de produto de pirólise e 2 μL de ddH2O. Siga as condições de PCR: estágio 1, 95 ° C por 3 min; estágio 2, 95 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s; Repita o ciclo 40x.

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Resultados

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Neste protocolo, isolamos e caracterizamos as ADSCs da gordura de camundongo (Figura 1). Para obter mitocôndrias isoladas, a membrana celular deve ser rompida usando um homogeneizador de vidro. (Figura 2A). É importante obter uma fração mitocondrial uniforme sem grandes aglomerados para que o tubo de microinjeção não seja bloqueado. Primeiro, 200 μL e depois 10 μL, ponteiras de pipeta devem ser usadas para ressuspender suavemente os homogeneizados; finalmente, u...

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Discussão

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Os oócitos contêm mais mitocôndrias do que qualquer tipo de célula do corpo, com ~ 1-5 × 105 números de cópias de mtDNA. As mitocôndrias são essenciais para a maturação do oócito, fertilização e desenvolvimento embrionário, portanto, qualquer disfunção mitocondrial pode levar à diminuição da qualidade do oócito. A diminuição da quantidade e qualidade mitocondrial está intimamente relacionada ao envelhecimento fisiológico. Neste protocolo, um método simples para isolar mitocônd...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores desejam agradecer o apoio da Fundação Nacional de Ciências da Natureza da China (82001629 para XQS), do Projeto de Pesquisa Básica do Departamento de Ciência e Tecnologia de Changzhou sob o número de concessão CJ20200110 (para YJY), do Programa Juvenil da Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (BK20200116 para XQS) e do Financiamento de Pesquisa de Pós-Doutorado da Província de Jiangsu (2021K277B para X, Q.S.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% de tripsina/EDTAGibco25300054Cultura de Células
  4% de paraformaldeídobeyotimeP0099imunofluorescência
40 μ filtro de células mCorning352340ADSC isolamento
indução adipogênicaCyagenHUXXC-90031Diferenciação multidirecional
Solução de coloração vermelha de alizarinaSigmaA5533Diferenciação multidirecional
Anticorpo contra CD29BD Biosciences558741análise de fluxo
Anticorpo contra CD34BD BiosciencesAnálise de fluxo560942
Anticorpo contra CD90BD BiosciencesAnálise defluxo
Anticorpo contra HLA-DRBD Biosciences555560Análise de fluxo
β-actinaAbcam ab-8226Teste de função mitocondrial
BSASigmaV900933imunofluorescência
CCCPSolarbioAnálisede fluxo de mitocôndrias C6700 JC-1
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711qPCR
colagenase tipo ISigmaSCR103Isolamento ADSC
DAPI InvitrogenD1306imunofluorescência
DMEM-F12Gibco11320033Cultura de células
DMSOSigma276855mitocôndrias JC-1 análise de fluxo
EGTASigma324626Isolamento de mitocôndrias
FBSGibco10100147Cultura de células
Citometria de fluxoBD BiosciencesFACSCanto& comércio; IICaracterísticas do microscópio de fluorescência ADSCs
leicaDM2500imunofluorescência
Sigma48722diferenciação multidirecional
SangonF519062Isolamento mitocondrial
hCGAibeiM2520Superestimulação ovariana
hialuronidaseSigmaH1115000Superestimulação ovariana
  Microscópio invertidoOlympusIMT-2
Kit de coloração de mitocôndrias isoladasSigmaCS0760análise de fluxo JC-1
JC-1SigmaT4069Teste de função mitocondrial
KClSigmaP5405Transferência de mitocôndrias
KH2PO4SigmaP5655Transferência
de mitocôndriasLaminBAbcamab-16048 Teste defunção mitocondrial
M16 MédioSigmaM7292cultura de células embrionárias
M2 MédioSigmaM7167manitol de cultura de células embrionárias
SigmaM9546Microinjetor de transferência de mitocôndrias
Olympus+ eppendorfIX73Transferência de mitocôndrias
MitoTracker vermelhoInvitrogenM22425Coloração de mitocôndrias
MOPSSigmaM1442
Polipeptídeo mediador de neurofilamentoSanta Cruz Biotechnologysc-16143diferenciação multidirecional
GibcoA1647801Diferenciação multidirecional
Enolase específica de neurônio (NSE)Santa Cruz Biotechnologysc-292097diferenciação multidirecional
Red OSangonE607319Óleo de diferenciação adipogênica
solução vermelha O SigmaO1516Diferenciação multidirecional
osteogênicaCyagenHUXXC-90021Diferenciação multidirecional
PBS (solução salina tamponada com fosfato)HycloneSH30256.LSCultura de células
penicilina e estreptomicinaHycloneSV30010Cell Culture
PMSGAibeiM2620
Coquetel inibidor de proteaseSigmaP8340Isolamento de mitocôndrias
sacaroseSigmaV900116Isolamento de mitocôndrias
TrisSigma648314Isolamento de mitocôndrias
Tris-HClSigma108319Transferência de mitocôndrias
Triton X-100beyotimeP0096imunofluorescência
VDACAbcamab-14734 Teste defunção mitocondrial
553016 gelatina de Tubo de homogeneização de vidro de por microinjeção de isolamento de mitocôndrias (NFM) Indução neurogênica de Óleo de indução de superestimulação ovariana

Referências

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