Os ensaios de captura de loop D (DLC) e extensão de loop D (DLE) utilizam o princípio da ligadura de proximidade juntamente com a PCR quantitativa para quantificar a formação de D-loop, a extensão de D-loop e a formação de produtos no local de uma ruptura induzível de fita dupla em Saccharomyces cerevisiae.
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Artigo de método
Detecção de Intermediários de Recombinação Homóloga via Ligadura de Proximidade e PCR Quantitativa em Saccharomyces cerevisiae
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os danos ao DNA, incluindo quebras de fita dupla do DNA e ligações cruzadas entre fitas, incorridos durante as fases S e G2 do ciclo celular podem ser reparados por recombinação homóloga (HR). Além disso, o RH representa um importante mecanismo de resgate de fork de replicação após estol ou colapso. A regulação dos muitos passos reversíveis e irreversíveis desta complexa via promove a sua fidelidade. A análise física dos intermediários de recombinação formados durante a FC possibilita a caracterização desses controles por diversos fatores nucleoproteicos e seus interatores. Embora existam métodos bem estabelecidos para testar eventos específicos e intermediários na via de recombinação, a detecção de formação e extensão de alça D, duas etapas críticas nessa via, provou ser desafiadora até recentemente. Aqui, métodos eficientes para detectar eventos-chave na via HR, ou seja, formação de quebra de fita dupla de DNA, formação de alça D, extensão de alça D e formação de produtos via replicação induzida por quebra (BIR) em Saccharomyces cerevisiae são descritos . Esses ensaios detectam seus intermediários de recombinação relevantes e produtos com alta sensibilidade e são independentes da viabilidade celular. A detecção de D-loops, extensão D-loop e o produto BIR é baseada na ligadura de proximidade. Juntos, esses ensaios permitem o estudo da cinética da FC no nível da população para abordar finamente as funções das proteínas e reguladores da FC em etapas significativas na via.
Introdução
A recombinação homóloga (FC) é um mecanismo de alta fidelidade de reparo de quebras de fita dupla (DSBs) de DNA, ligações cruzadas entre fitas e lacunas de ssDNA, bem como um caminho para a tolerância a danos ao DNA. A FC difere das vias propensas a erros para reparo/tolerância a danos no DNA, como a junção final não homóloga (NHEJ) e a síntese translesão, na medida em que utiliza um DNA duplex homólogo intacto como doador para modelar o evento de reparo. Além disso, muitos dos principais intermediários na via da FC são reversíveis, permitindo uma regulação requintada das etapas individuais da via. Durante as fases S, G2 e M do ciclo celular, a HR compete com a NHEJ p....
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Protocolo
1. Pré-crescimento, indução do DSB e coleta de amostras
NOTA: A suplementação de todos os meios com adenina a 0,01% é recomendada para cepas de Ade-.
- Retire as estirpes haploides apropriadas (ver Tabela 1) na levedura peptona dextrose adenina (YPDA) (extrato de levedura a 1%, peptona a 2%, glicose a 2%, ágar a 2%, adenina a 0,001%) e cresça durante 2 dias a 30 °C.
- Use uma única colônia para inocular 5 mL de YPDA em um tubo de cultura de vidro de 15 mL. Cultivar culturas até à saturação a 30 °C com agitação ou rotação para aeração.
- Ensaio de DLC: Preparar a solução-mãe de psoral....
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Resultados
Ensaio DLC
O ensaio DLC detecta loops D nascentes e estendidos formados pela invasão de um DSB site-specific em um único doador (Figura 2). A reticulação de psoraleno liga fisicamente a fita quebrada e o doador através do DNA heteroduplex dentro da alça D. A restauração do sítio enzimático de restrição com um oligo longo e hibridizante na fita ressecada da ruptura permite a clivagem enzimática de restrição, seguida de ligadura da fita quebrada ao doador proximal .......
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Discussão
Os ensaios apresentados permitem a detecção de alças D nascentes e estendidas (ensaio DLC), extensão D-loop (ensaio DLE) e formação de produtos BIR (ensaio DLE sem oligonucleotídeos hibridizantes) usando ligadura de proximidade e qPCR. O ChIP-qPCR do Rad51 para locais distantes do DSB já foi usado anteriormente como proxy para a busca de homologia mediada pelo Rad51 e a formação de D-loop. No entanto, esse sinal ChIP-qPCR é independente da homologia de sequência entre o local de ruptura e um potencial doador, bem como do.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O trabalho no laboratório Heyer é apoiado pelas subvenções GM58015 e GM137751 a W.-D.H. A investigação no laboratório Piazza é apoiada pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC-StG 3D-loop, grande acordo 851006). A D.R. é apoiada pelo T32CA108459 e pela Fundação A.P. Giannini. Agradecemos a Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) por compartilhar seus resultados de ensaio DLC / DLE e por validar adicionalmente as alterações nos ensaios que são detalhadas neste protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1. Pré-crescimento, indução de DSB e coleta de amostras< | |||
| forte>Equipamento | |||
| 15 e 50 mL tubos | |||
| de 15 mL frascos | |||
| 250 mL, 500 mL ou 1 L Placas | |||
| de 60 mm x 15 mm com fundo | Sugerido: Corning, número de catálogo 430166; ou Genesee Scientific, número de catálogo 32-150G | ||
| Centrífuga de bancada com adaptadores | |||
| Agitador orbital de bancada ou rotador/revólver | |||
| Rotador Reticulador | |||
| UV ou caixa de luz com lâmpadas UV de 365 nm colocadas sobre um agitador | orbitalSugerido: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) ou Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, número de catálogo 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% p/p xarope de DL-lactato de sódio | Sigma-Aldrich | L1375 | Para preparação de meios |
| Agar | Fisher | BP1423500 | Para preparação de meios |
| Bacto peptona | BD Difco | 211840 | Para preparação de meios |
| Extrato de levedura bacto | BD Difco | 212750 | Para preparação de meios |
| D-(+)-glicose | BD Difco | 0155-17-4 | Para preparação de meios |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | Para reticulação de psoraleno |
| 2. Restauração do local da enzima de esferoplastagem, lise e restrição< | |||
| forte>Suprimentos | |||
| tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Banho | |||
| Nitrogênio líquido ou gelo seco/etanol | |||
| Microcentrífuga ou microcentrífuga | refrigerada | ||
| Materiais | |||
| 10X tampão de enzima de restrição (CutSmart) (500 mM de acetato de potássio, 200 mM de Tris-acetato, 100 mM de acetato de magnésio, 1 mg/mL de BSA, pH 7,8-8,0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | Para esferoplastação |
| 3. Digestão enzimática de restrição e ligação intramolecular | |||
| Suprimentosbanho-maria | |||
| Materiais | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Digestão enzimática de restrição para ensaio DLC |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Digestão enzimática de restrição para |
| DLE T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligação intramolecular |
| 4. Purificação de DNA< | |||
| forte>Suprimentos | |||
| microcentrífuga de 1,5 e 2 mL | |||
| Materiais | |||
| Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (P/C/IA) a 25:24:1 | Purificação | ||
| de DNA Sigma-Aldrich P20695. Reversão de reticulação de psoraleno | |||
| Suprimentos | |||
| Termociclador/máquina | |||
| 6. qPCR< | |||
| strong>Suprimentos | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | Máquina de qPCR usada pelos autores |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | máquina de qPCR usada pelos autores |
| Materials | |||
| LightCycler 480 Placa de 96 poços, placas brancas | Roche | 4729692001 | 96 poços para qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | kit de qPCR usado pelos autores |
| SYBR Green I Master Mix | Kit | Roche 4707516001 | qPCR usado pelos autores |
Referências
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
- Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology....
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Reimpressões e permissões
