Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única

Summary

Este estudo apresenta um procedimento detalhado para realizar experimentos de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando marcação site-specific via incorporação de aminoácidos não naturais (UAA). O protocolo fornece um guia passo a passo para a preparação de amostras smFET, experimentos e análise de dados.

Abstract

A capacidade das células de responder a sinais externos é essencial para o desenvolvimento, crescimento e sobrevivência celular. Para responder a um sinal do ambiente, uma célula deve ser capaz de reconhecê-lo e processá-lo. Esta tarefa baseia-se principalmente na função dos receptores de membrana, cujo papel é converter sinais na linguagem bioquímica da célula. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) constituem a maior família de proteínas receptoras de membrana em humanos. Entre os GPCRs, os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) são uma subclasse única que funcionam como dímeros obrigatórios e possuem um grande domínio extracelular que contém o sítio de ligação do ligante. Avanços recentes em estudos estruturais de mGluRs melhoraram a compreensão de seu processo de ativação. No entanto, a propagação de alterações conformacionais em larga escala através de mGluRs durante a ativação e modulação é pouco compreendida. A transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) é uma técnica poderosa para visualizar e quantificar a dinâmica estrutural de biomoléculas no nível de proteína única. Para visualizar o processo dinâmico de ativação do mGluR2, foram desenvolvidos sensores conformacionais fluorescentes baseados na incorporação de aminoácidos não naturais (UAA) que permitiram a marcação de proteínas site-specific sem perturbação da estrutura nativa dos receptores. O protocolo descrito aqui explica como realizar esses experimentos, incluindo a nova abordagem de rotulagem de UAA, preparação de amostras e aquisição e análise de dados smFET. Essas estratégias são generalizáveis e podem ser estendidas para investigar a dinâmica conformacional de uma variedade de proteínas de membrana.

Introduction

A transferência de informações através da membrana plasmática é fortemente dependente da função dos receptores de membrana¹. A ligação do ligante a um receptor leva a uma alteração conformacional e à ativação do receptor. Este processo é muitas vezes alostérico na natureza². Com mais de 800 membros, os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior família de receptores de membrana em humanos³. Devido ao seu papel em quase todos os processos celulares, os GPCRs tornaram-se alvos importantes para o desenvolvimento terapêutico. No modelo canônico de sinalização GPCR, a ativação do agonista resulta em alterações conformacionais do receptor que subsequentemente ativam o complexo proteico G heterotrimérico via troca de PIB por GTP na bolsa de ligação de nucleotídeos de G_α. As subunidades G α-GTP e G_βγ ativadas controlam a atividade das proteínas efetoras a jusante e propagam a cascata de sinalização ^4,5. Este processo de sinalização depende essencialmente da capacidade dos ligantes de alterar a forma tridimensional do receptor. Uma compreensão mecanicista de como os ligantes conseguem isso é fundamental para o desenvolvimento de novas terapêuticas e o design de receptores e sensores sintéticos.

Os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) são membros da família GPCR classe C e são importantes para os efeitos neuromoduladores lentos do glutamato e para a excitabilidade neuronal de sintonia ^6,7. Entre todos os GPCRs, os GPCRs de classe C são estruturalmente únicos, pois funcionam como dímeros obrigatórios. Os mGluRs contêm três domínios estruturais: o domínio da armadilha de Vênus (VFT), o domínio rico em cisteína (CRD) e o domínio transmembrana (TMD)⁸. As mudanças conformacionais durante o processo de ativação são complexas e envolvem acoplamento conformacional local e global que se propagam a uma distância de 12 nm, bem como a cooperatividade do dímero. As conformações intermediárias, a ordenação temporal dos estados e a taxa de transição entre os estados são desconhecidas. Seguindo a conformação de receptores individuais em tempo real, é possível identificar os estados intermediários transitórios e a sequência de alterações conformacionais durante a ativação. Isso pode ser conseguido por meio da aplicação de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única ^9,10 (smFRET), como foi recentemente aplicado para visualizar a propagação de alterações conformacionais durante a ativação do mGluR2 ¹¹. Um passo fundamental nos experimentos FRET é a geração de sensores FRET pela inserção site-specific dos fluoróforos doador e aceitador na proteína de interesse. Uma estratégia de incorporação de aminoácidos não naturais (AIA) foi adotada ^12,13,14,15 para superar as limitações das tecnologias típicas de marcação fluorescente site-specific que exigem a criação de mutantes sem cisteína ou a inserção de uma grande etiqueta geneticamente codificada. Isso permitiu observar o rearranjo conformacional do essencial ligador alostérico compacto, que uniu os domínios de ligação e sinalização do ligante do mGluR2. Neste protocolo, um guia passo-a-passo para a realização de experimentos smFRET em mGluR2 é apresentado, incluindo a abordagem para marcação site-specific de mGluR2 com UAA para anexar fluoróforos usando a reação de ciclização azida catalisada por cobre. Além disso, este protocolo descreve a metodologia para a captura direta de proteínas de membrana e análise de dados. O protocolo descrito aqui também é aplicável ao estudo da dinâmica conformacional de outras proteínas de membrana.

Protocol

O fluxo de trabalho geral do protocolo é descrito na Figura 1.

1. Preparação da câmara de amostra

1. Limpeza de deslizamento e tampa
   NOTA: Estas etapas visam limpar as superfícies das lâminas, bem como as coberturas e prepará-las para a aminossilanização. Um requisito crítico para a realização de experimentos de fluorescência de molécula única em moléculas ligadas à superfície é uma superfície passivada. A técnica de passivação mais confiável e reprodutível envolve a ligação covalente de cadeias poliméricas inertes à superfície do vidro como uma camada densa. O polietilenoglicol (PEG) é o polímero mais eficiente utilizado para passivação superficial¹⁶. Os detalhes do procedimento de passivação usando PEG (PEGylation) são descritos abaixo:
   1. Marque os furos a serem perfurados nas lâminas com um marcador (~ 6 mm de distância e longe da borda). Use um Dremel para fazer pequenos furos (1 mm de diâmetro) na lâmina de vidro. Mergulhe as lâminas em água durante o processo de perfuração.
   2. Lave as lâminas com acetona para remover a tinta residual do marcador.
   3. Retire da acetona e lave as lâminas com água, em seguida, coloque-as no micro-ondas por 5 minutos em água em alta potência (700 W).
   4. Limpe as lâminas com água antes de colocá-las em um vitral de vidro para serem sonicadas. Coloque as tampas em um frasco de coloração diferente.
   5. Sonicate as lâminas e tampas em acetona durante 30 min num sonicator de banho a 23 °C.
   6. Entretanto, limpar um balão de vidro para preparar a solução de aminossilanização utilizada durante o passo seguinte. Encher o balão com 1 M KOH, sonicar o balão durante 30 min, enxaguar cuidadosamente o KOH com água e, em seguida, sonicate durante mais 30 min em metanol. Deixar o balão em metanol até ao momento da etapa de aminossilanização.
   7. Enquanto isso, remova o aminosilano, o mPEG e a biotina-PEG do freezer (-20 °C) e permita que eles cheguem à temperatura ambiente (RT) no escuro.
   8. Descarte a acetona dos frascos deslizantes e de tampa no recipiente apropriado de resíduos químicos, enxágue bem com água e, em seguida, sonice as lâminas em 5 M KOH por 30 min.
   9. Lave as lâminas e as tampas com água e, em seguida, sonicate em metanol por 2 min (repita duas vezes). Deixe os frascos cheios de metanol até a etapa de aminossilanização.
      NOTA: Neste estudo, a água deionizada é usada, a menos que mencionado de outra forma. Um sonicator de banho trabalhando a 23 °C é usado.
2. Aminossilanização
   NOTA: Esta etapa visa ligar covalentemente o aminossilano à superfície limpa do slide e do deslizamento da tampa. O mPEG funcionalizado e o biotina-PEG se ligarão covalentemente a essa superfície na próxima etapa.
   1. Preparar uma mistura de aminossilanização num balão limpo (passo 1.6). Prepare a solução misturando metanol (150 mL), ácido acético (7,5 mL, use pipeta de vidro) e aminosilano (2,5 mL).
   2. Misture a solução suavemente no exaustor químico e, em seguida, despeje-a nos frascos deslizantes e de tampa. Use 50 mL para as folhas de cobertura e 100 mL para as lâminas. Certifique-se de que as corrediças e as tampas estejam totalmente imersas na solução.
   3. Incubar por 10 min, em seguida, sonicate os frascos por 1 min (sonication remove as impurezas da superfície), e incubar por mais 10 min.
   4. Descarte a solução de aminossilanização no recipiente de coleta de resíduos. Adicione metanol aos frascos, feche os frascos com tampas e agite suavemente à mão. Descarte o metanol e encha os frascos com água.
   5. Devolver o frasco de aminosilano ao congelador (-20 °C).
3. PEGilação
   Observação : estas etapas descrevem o procedimento PEGylation.
   1. Durante a aminossilanização, prepare o tampão de peguilação. Pesar 84 mg de bicarbonato de sódio (NaHCO₃) e adicioná-lo a 10 mL de água (10 mM). Além disso, pese mPEG e biotina-PEG e reserve-os. Para seis lâminas e coberturas, use 96 mg de mPEG e 1,2-2,4 mg de biotina-PEG.
      NOTA: É importante não adicionar muito biotina-PEG, uma vez que pode aumentar o número de manchas de fundo. Não dissolva a mistura de PEG até logo antes da aplicação em lâminas.
   2. Lave as lâminas com água, seque-as com um suave sopro de ar e, em seguida, coloque-as nas caixas de montagem umidificadas.
      NOTA: É essencial usar uma companhia aérea limpa. Evite usar ar enlatado comprimido, que pode deixar resíduos no vidro.
   3. Adicione tampão de peguilação à mistura de pó PEG e pipeta para cima e para baixo suavemente várias vezes para dissolver. Adicionar 55 μL de tampão de peguilação por lâmina (para seis lâminas, adicionar 330 μL de tampão de peguilação).
   4. Centrifugar a 9,600 x g durante 1 min a 23 °C para precipitar partículas não dissolvidas. Colete o sobrenadante para usar na próxima etapa.
      NOTA: A biotina-PEG hidrolisa rapidamente devido à presença do grupo NHS. É importante fazer as etapas de mistura e centrifugação rapidamente.
   5. Aplicar 60 μL de solução de PEGilação em cada lâmina e, em seguida, colocar a folha de cobertura por cima, de modo a que a solução de PEGilação fique imprensada entre a lâmina e a folha de cobertura.
      NOTA: Evite a introdução de bolhas entre o slide e o deslizamento da tampa, pois isso reduzirá a eficiência da passivação. Remova todas as bolhas ajustando a tampa e o deslizamento com uma ponta de pipeta.
   6. Coloque os slides em uma gaveta plana e escura. As lâminas podem ser armazenadas durante a noite; no entanto, a incubação por 4-6 h resulta em passivação ótima.
      NOTA: É essencial lembrar qual lado é pegilado.
   7. Marque o lado não peguilado antes do armazenamento. Após a incubação, desmonte e lave suavemente as lâminas e cubra completamente com água
   8. Seque as corrediças e as tampas soprando ar. Manter as lâminas e as tampas num tubo estéril (50 ml), com a superfície PEGylated virada para longe uma da outra. Conservar a -20 °C até ao dia da experiência.
      NOTA: É melhor usar lâminas e folhas de cobertura dentro de 4 semanas após a preparação. As superfícies PEGylated devem ficar de frente uma para a outra. Armazenar as lâminas PEGylated e as folhas de cobertura em sacos selados a vácuo pode aumentar sua vida útil.

2. Expressão de mGluR2 com aminoácidos não naturais incorporados, marcação fluorescente e extração

NOTA: Este protocolo descreve a preparação, reagentes e tratamento de células para expressar mGluR2 contendo a UAA 4-azido-L-fenilalanina (AZP). O procedimento é para células HEK293T cultivadas em coberturas de vidro de 18 mm. O procedimento pode ser ampliado conforme necessário.

1. Semeadura
   NOTA: Manter as células HEK293T em DMEM suplementadas com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 100 unidades·mL⁻¹ de penicilina-estreptomicina e tampão HEPES de 15 mM (Arquivo Suplementar 1) (pH 7,4) a 37 °C sob 5% de CO₂.
   1. Passagem das células com tripsina-EDTA a 0,05%. Sementes de células HEK293T em tampas de vidro poli-L/D-lisina (PLL/PDL) para que atinjam ≥80% de confluência durante o tempo de transfecção.
2. Transfecção
   1. Preparar uma solução-mãe de 40 mM de AZP em NaOH 0,1 M.
   2. Prepare meios suplementados com AZP para células em crescimento e expressão de mGluR2. Suplemento de mídia padrão (+ FBS, caneta/estreptococo, 15 mM HEPES) usando solução de estoque de AZP de 40 mM. Elevar a concentração final de AZP para 0,6 mM. Adicionar 1 M de solução de HEPES (metade do volume de solução de reserva de AZP de 40 mM adicionado). Por exemplo, para preparar 10 mL de meio suplementado com AZP, combine 9,775 mL de meio padrão, 150 μL de solução estoque de AZP de 40 mM e 75 μL de solução de HEPES 1 M.
   3. Filtrar (esterilizar) o meio utilizando um filtro de seringa (0,2 μm, PES).
   4. Substitua a mídia padrão por uma mídia que contenha mídia suplementada com AZP antes da transfecção.
      NOTA: Tenha cuidado para não secar as células durante a substituição do meio.
   5. Transfecte as células com reagente de transfecção (Tabela de Materiais) seguindo o manual do fabricante. Transfecte células HEK293T em uma folha de cobertura de 18 mm usando um total de 2 μg de DNA (1000 ng de tRNA/sintetase + 1000 ng de plasmídeo proteico contendo códon âmbar). Consulte o quadro 1 para a concentração e o volume dos componentes utilizados.
   6. Mude o meio 24 h após a transfecção para um meio fresco suplementado com AZP e permita que as células cresçam por mais 24 horas.
3. Rotulagem com corantes alquinos cianina
   1. 20 min antes da rotulagem, lave as tampas com buffer de gravação (RB) quente (37 °C) (Arquivo Suplementar 1) duas vezes e mova-as para o meio padrão quente (37 °C) sem AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
   2. Preparar a solução de marcação contendo Cy3-alquino, Cy5-alquino, BTTES, sulfato de cobre (II) (CuSO4), (+) L-ascorbato de sódio e aminoguanidina.
   3. Siga a ordem de fabrico e adição das soluções (Quadro 2):
      1. Prepare 50 mM BTTES.
      2. Prepare 100 mM de aminoguanidina.
      3. Prepare 100 mM Na-ascorbate.
      4. Prepare 655,5 μL de RB.
      5. Adicione o corante alcino Cy3/Cy5 (10 mM em estoque de DMSO) ao RB.
         NOTA: Adicione aminoguanidina ao RB.
      6. Prepare 20 mM CuSO_4.
      7. Misture CuSO4 e BTTES em um novo tubo (a solução ficará azul).
      8. Adicionar a mistura de CuSO4 e BTTES ao RB (2.3.3.6.)
      9. Adicione o Na-Ascorbate.
      10. Siga o volume indicado no quadro 2 infra para uma folha de cobertura de 18 mm.
   4. Misture bem a solução e incube no gelo e no escuro por 10 minutos antes de rotular as células.
   5. Antes de adicionar a solução de rotulagem às folhas de cobertura, retire o meio e lave-o com RB. Adicionar a solução de marcação e incubar durante 15 minutos a 37 °C em condições escuras.
   6. NOTA: Para melhorar a rotulagem, adicione glutamato (concentração final ~0,5 mM) após 10 minutos e incube por mais 5 minutos. O cobre é muito tóxico para as células, e a reação de marcação não deve continuar por mais de 15 minutos in vivo. Prepare todos os componentes frescos. Adicione Na-Ascorbate por último. Mantenha a reação a 4°C durante a preparação. No entanto, após a adição da solução de marcação, as células devem ser armazenadas a 37 °C no interior da incubadora.
4. Colheita das células e extração das proteínas (lise celular)
   1. Retire a solução de rotulagem e lave a folha de cobertura (18 mm) que contém as células transfectadas mGluR2 duas vezes com o RB.
   2. Usando uma pipeta, lave as células da tampa e ressuspeite em RB (1 mL).
      NOTA: Minimize a exposição da amostra à luz, tanto quanto possível após este ponto.
   3. Pellet as células girando a 1.000 x g a 4 °C durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspeite o pellet celular em 80-130 μL da solução de lise.
      NOTA: A pastilha celular deve ser visível a olho nu. O volume de lise depende da quantidade de amostra perdida durante o processo de rotulagem e lavagem.
   4. Misture suavemente pipetando para quebrar o pellet. Enrolar em papel alumínio e colocar sobre o balancim a 4 °C durante 0,5-1 h para lisar as células.
   5. Pellet a fracção insolúvel por centrifugação a 20.000 x g e 4 °C durante 20 min. Transfira o sobrenadante para um tubo frio fresco (a proteína lisada que contém a proteína fluorescente de interesse) e armazene-a no gelo para experimentos.

3. Montagem e funcionalização da câmara de fluxo de molécula única

1. Remova o slide e o coverslip do congelador e deixe-os aquecer no RT na escuridão (~ 30 min).
2. Monte a câmara usando fita dupla face colocando tiras de fita dupla face entre a lâmina e a tampa. Certifique-se de que as superfícies PEGylated formam o interior da câmara de fluxo.
3. Usando uma ponta de pipeta, pressione a tampa para garantir que a fita esteja fazendo contato completo com a tampa e a corrediça; tome cuidado para não quebrar a tampa. Aplique epóxi nas bordas das lâminas.
   NOTA: Não adicione tanto que o epóxi preencha os furos perfurados.
4. Coloque a câmara de fluxo com o lado da tampa voltado para baixo em uma caixa escura umidificada para permitir que o epóxi seque (~ 30 min).
   NOTA: Adicione o tampão T50 (Arquivo Suplementar 1) através dos furos perfurados para evitar que o epóxi cubra os orifícios (10-15 μL) durante o período de secagem.
5. Incubar cada via de câmara com 500 nM de Neutravidina (diluída em T50) aplicando lentamente ~40 μL em cada faixa.
6. Incubar em RT por 2 min dentro de uma caixa escura umidificada. Lave com ~100 μL de tampão T50 por faixa.
7. Incubar cada via de câmara com o anticorpo biotinilado 20 nM¹¹. A escolha do anticorpo depende da etiqueta na proteína.
   NOTA: Se o anticorpo primário não for biotinilado, primeiro incubar com o anticorpo secundário biotinilado por 30 minutos e, em seguida, incubar com o anticorpo primário.
8. Incubar no RT por 30 min dentro de uma caixa escura umidificada. Lave com ~200 μL de T50 por pista.
   NOTA: Certifique-se de que as faixas nunca sequem durante o processo de preparação.

4. Tampões de molécula única

1. Buffer Trolox
   NOTA: O buffer Trolox é o buffer inicial para criar o buffer de imagem. Os componentes do tampão dependem do experimento e podem variar dependendo da proteína de interesse. O tampão utilizado no protocolo aqui descrito inclui sais (NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl₂), agente tamponante (HEPES) e Trolox (pH ~7,35).
   1. Dissolver 9-10 mg de Trolox em 10 ml de tampão de registo de molécula única (SRB, Ficheiro Suplementar 1)
      NOTA: Trolox torna o tampão ligeiramente ácido. Ajustar o pH nesta fase utilizando solução de hidróxido de sódio (NaOH), 10 M (pH 7,35). O ajuste fino do pH será feito após o Trolox estar totalmente dissolvido; no entanto, o aumento do pH neste ponto aumenta a solubilidade do Trolox.
   2. Misture a solução no RT usando um balancim de bancada por 4-8 h (envolto em folha de alumínio) para dissolver completamente o Trolox.
   3. Verifique o pH e ajuste, se necessário.
   4. Certifique-se de que o Trolox esteja totalmente dissolvido. Esterilizar a solução com um filtro de seringa e conservar a 4 °C.
      NOTA: O tampão deve ser usado após 2-10 dias de envelhecimento. O Trolox ajuda a suprimir o piscar e é comumente usado em estudos de molécula única¹⁷. As propriedades anti-piscar provêm de um derivado oxidado de Trolox¹⁸; portanto, recomenda-se mantê-lo em RT por pelo menos algumas horas para amadurecer. Além disso, a radiação UV da solução fresca de Trolox acelera o processo de oxidação e pode ser usada para acelerar o "envelhecimento" do tampão Trolox¹⁸.
2. Receita de tampão de imagem: Misture o tampão Trolox + detergente (~2 vezes o valor CMC do detergente) + 4 mM de ácido protocatecúico (PCA).
   NOTA: A concentração de detergente é mantida perto da CMC, uma vez que as elevadas concentrações de detergente podem resultar num aumento da desnaturação das proteínas. Por exemplo, a seguinte mistura pode ser usada 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + colesterol (W%, 10:1) + 40 μL de solução de estoque de PCA de 100 mM. Aqui, a ACP atua como agente antioxidante e foi utilizada anteriormente em estudos de smFRET¹⁹. O DDM não é iônico, é comumente usado para solubilizar proteínas de membrana^20,21 e tem sido usado em estudos de molécula única. DDM é um bom detergente de primeira escolha; no entanto, recomendamos testar vários detergentes e garantir que os resultados sejam consistentes.

5. Configuração do microscópio e aquisição de dados smFRET

1. Ligue o computador e o microscópio. Ligue os lasers para aquecer (532 nm para excitação Cy3 e 640 nm para excitação Cy5).
   NOTA: Aqui, um microscópio invertido equipado com uma objetiva TIRF 100x (N.A. 1.49), divisor de imagem e câmera EMCCD foi usado. A configuração é equipada com um combinador a laser de quatro linhas, um espelho dicroico, um filtro de emissão passa-longa, um filtro dicroico de emissão e um filtro de entalhe.
2. Ligue a câmera EMCCD e abra o software da câmera. Aguarde 20 minutos para que a câmera atinja -69 °C e estabilize.
3. Monte a câmara de amostra no estágio do microscópio. Adicionar a amostra de proteína gradualmente para atingir ~400 moléculas por campo de visão (passo 2.4.5). Lave a câmara com 100 μL do tampão de imagem.
4. Ajuste o ganho, a taxa de aquisição e as potências do laser de modo que os sinais de fluorescência de molécula única sejam detectados nos canais doador e aceptor. Ajustar a concentração das proteínas no interior da câmara de amostragem, se necessário.
   NOTA: Com mais de 400 moléculas no campo de visão, distinguir moléculas individuais torna-se mais difícil e o ruído de fundo será maior.
5. Excite o doador e adquira vestígios de tempo até que pelo menos 80% das moléculas doadoras no campo de visão sejam fotobranqueadas.
6. No final do filme, ligue o laser de 640 nm para excitar diretamente o aceptor até que algumas das moléculas aceitadoras se desintegrem, facilitando a discriminação de uma única molécula contra o multímero.
7. Passe para um campo de visão diferente e repita as etapas acima para coletar pelo menos três filmes (replicações técnicas) por condição.
   NOTA: Use a menor potência de laser possível ao selecionar uma nova região de interesse (ROI) e focar para minimizar o fotobranqueamento. Preste atenção à deriva do palco durante a aquisição. Se for observada uma deriva perceptível depois de passar para um novo ROI, aguarde 3 minutos antes de iniciar a aquisição.

6. Análise dos dados

1. Alinhamento do canal doador e aceitador (mapeamento de filmes)
   1. Grave as imagens fluorescentes do grânulo nos canais doador e receptor.
   2. Gerar o arquivo de mapeamento utilizando os dados do grânulo para correlacionar a fluorescência do doador e do aceitador de cada molécula^22,23.
      NOTA: O sinal de emissão de uma única molécula é dividido em sinais de doador e aceitador pelo filtro dicroico de emissão dentro do divisor de imagem. As imagens do doador e do aceitador são projetadas na câmera lado a lado. Para associar com precisão as intensidades do doador e do aceitador de uma única molécula entre as duas áreas, um arquivo de mapeamento é frequentemente gerado usando amostras de contas fluorescentes. Usando esse arquivo de mapeamento, todas as moléculas que são detectadas nos canais doador e aceitador são mapeadas umas nas outras. A análise então gera os traços de tempo, que são as intensidades do doador e do aceitador ao longo do tempo, para cada molécula.
2. Seleção de traços FRET de molécula única (coleta de partículas)
   NOTA: Vestígios de partículas individuais são examinados e selecionados para análise a jusante usando o MATLAB. Os critérios exatos de seleção dependem do sistema. Diretrizes gerais sobre o que constitui uma partícula de qualidade são descritas aqui. Todos os códigos personalizados modificados estão disponíveis no GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
   1. Selecione os vestígios onde a intensidade total dos vestígios (doador + aceitador) é estável ao longo do tempo. Selecione os traços com alterações anti-correlacionadas nas intensidades do doador e do aceitador.
   2. Selecione as moléculas doadoras e aceitadoras que mostram o fotobranqueamento em uma única etapa. Selecione os rastreamentos com >5 s de comprimento.
      NOTA: O plano de fundo em cada canal após o branqueamento deve ir a zero. Os vestígios não devem ter muitos eventos piscantes; isso aumentará a dificuldade de análise.
   3. Calcule a eficiência do FRET usando a equação E = (I A− 0,088 × I D)/(I D + [I A− 0,088 × I D])^24,25,26, onde I _D e I _A são intensidades brutas de doador e aceitador^, respectivamente.
      NOTA: O vazamento da emissão do doador para o canal aceitador é determinado usando amostra marcada apenas pelo doador excitada usando um laser de 532 nm²⁶. O fator de correção de vazamento, 0,088, pode diferir para diferentes configurações, dependendo dos conjuntos de filtros usados. É importante notar que a conversão quantitativa e robusta de eficiências de FRET em distâncias absolutas requer a correção das intensidades do doador e do aceitador para múltiplos fatores e tem sido amplamente discutida antes²⁷.
3. Identificar o estado conformacional por Modelagem de Markov Oculta (HMM)
   1. Execute o programa vbFRET²⁸ no MATLAB e importe os rastreamentos selecionados para uma determinada condição. Defina as restrições para o número de estados potenciais e iterações a serem executados.
      NOTA: Com base nos dados brutos dos resultados representativos, foi levantada a hipótese de que havia até quatro estados FRET discretos ocupados pelo sensor conformacional; assim, foi designado um intervalo de um a quatro estados. Melhorias no ajuste foram previamente determinadas para aumentar insignificantemente com iterações >25; assim, foram utilizadas 25 iterações para o ajuste dos dados representativos.
   2. Analise os traços smFRET e exporte os traços idealizados e a sessão de análise. Salve os rastreamentos idealizados em uma pasta separada para análise a jusante.
      NOTA: Os programas utilizados para extrair dados de transição de estado e de tempo de permanência de traços idealizados foram disponibilizados em trabalhos publicados anteriormente²⁹.
   3. Usando programas MATLAB, extraia transições de estado e plote-as como um mapa de calor com a coordenada X indicando a conformação inicial e a coordenada Y indicando a conformação final.
      NOTA: Transições são definidas como alterações no valor de FRET >0,1 nos resultados representativos discutidos aqui. O limiar para transições depende dos estados conformacionais hipotéticos que uma proteína de interesse ocupa (limite de transição definido para ser menor do que a diferença entre os estados FRET mais próximos), bem como da resolução permitida pela configuração experimental. O exame de mapas de calor para múltiplas condições permite a identificação dos estados conformacionais mais comuns pelos quais um sensor transita e, assim, ocupa. Quatro estados FRET foram identificados para os resultados representativos (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 e 0,89).
   4. Usando os programas MATLAB, extraia os tempos de permanência para cada estado conformacional identificado. Designe um intervalo de valores FRET delineando cada estado e resolução de tempo durante a aquisição de dados. Os intervalos FRET são divididos uniformemente por estados FRET adjacentes. Exporte os tempos de permanência para determinadas condições de tratamento.
      NOTA: Na maioria dos casos, os dados de tempo de permanência podem ser bem estimados por uma única função de decaimento exponencial. Essa análise pode ser realizada em um software de análise de dados e gráficos.
4. Ajuste gaussiano de histogramas populacionais smFRET para quantificar a ocupação do estado
   1. Importar histogramas FRET populacionais para condições de interesse para o software de análise de dados e gráficos para análise de múltiplos picos de ajuste.
   2. Indique o número de picos presentes (quatro picos ou estados com base na análise HMM). O ajuste foi realizado utilizando-se múltiplas distribuições gaussianas³⁰ definidas como , onde A é a área do pico, xc é o centro do pico e w é a largura do pico para cada pico.
   3. Restrinja os parâmetros de ajuste como A > 0, xc = FRET ± 0,02 e 0,1 ≤w≤ 0,24. Quatro picos de FRET para histogramas de FRET de população individual foram ajustados simultaneamente. Aplique as restrições definidas para os ajustes de todas as condições.
   4. Calcule o estado de ocupação (porcentagem) como a área de pico de interesse dividida pela área total, definida como a soma de todos os picos.

Results

Expressão e marcação fluorescente do sensor FRET baseado em EAU
Aqui, são discutidos resultados exemplares da inserção e marcação fluorescente de uma AIU (AZP) dentro da DRC de mGluR2 (548UAA)¹¹. Como mencionado anteriormente, para inserir o AZP no mGluR2, é necessária a co-expressão do maquinário translacional projetado, que inclui uma tRNA sintetase modificada e um tRNA complementar (pIRE4-Azi) e mGluR2 contendo um códon âmbar na posição 548, criado usando mutagênese, (

Discussion

GPCRs são proteínas que operam na membrana celular para iniciar a transdução de sinal. Muitos GPCRs consistem em vários domínios, com a sinalização sendo dependente da interação cooperativa entre os domínios. Para modular as propriedades desses receptores de membrana, é essencial entender o comportamento dinâmico dos múltiplos domínios. A transferência de energia por ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) é uma técnica de fluorescência que permite a medição da conformação e dinâmica de proteínas em tempo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(+) -L-Ascorbato de Sódio	Sigma Aldrich	Cat # 11140-250G
4-azido-L-fenilalanina	Chem-Impex International	Cat # 06162
548UAA	Liauw et al. 2021		Construção transfectada
Ácido Acético	Fisher Chemical	64-19-7
Acetona	Fisher Chemical	67-64-1
Adobe Illustrator (2022)	https://www.adobe.com/	RRID:SCR_010279	Software, algoritmo
Aminoguanidina (cloridrato)	Cayman Chemical	81530
Aminosilano	Aldrich	919-30-2
Banho Sonicador 2,8 L	Banho Ultrassônico Fisher Scientific
Biotina-PEG	Laysan Bio	Inc Item# Biotina-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES	Click Chemistry Tools	1237-500
Sulfato de cobre (II)	Sigma Aldrich	Cat # 451657-10G
Lamínula	VWR	16004-306	Câmara de amostra
Cy3 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA117-5
Cy5 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA116-5
DDM	Anatrace	Part# D310 1 GM	Detergente
DDM-CHS (10:1)	Anatrace	Part# D310-CH210 1 ML	Detergente com colecterol
Soro Fetal Bovino Definido	Thermo Fisher Scientific	SH30070.03
Di01-R405/488/561/635	Semrock		Filtro de entalhe
DMEM	Corning	10-013-CV
EMCCD	Andor	DU-897U	Câmera
ET542lp	Chroma		Filtro de emissão de passagem longa
FF640-FDi01	Semrock		Filtro dicróico de emissão
FLAG-tag anticorpo	Genscript	A01429
Conta fluorescente	Invitrogen T7279	Microesferas TetraSpeck	Conta esférica
Lâminas de vidro	Fisherfinest	12-544-4	câmara de amostra
Glutamato	Sigma Aldrich	Cat # 6106-04-3
HEK 293T	Sigma Aldrich	Cat # 12022001	Linha celular
HEPES	FisherBioReagents	7365-45-9
Divisor de imagem	OptoSplit II
KOH	Fluka	1310-58-3
Laser	Oxxius		Combinador a laser de 4 linhas
Lipofectamine 3000 Reagente de Transfecção	Thermo Fisher Scientific	L3000015	Reagente de Transfecção
Metanol	Fisher Chemical	67-56-1
Microscópio	Olympus	Olympus IX83
Milli-Q água	Barnstead		Water Deionizer
m-PEG	Laysan Bio Inc	Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635	Semrock		Espelho dicróico
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	51985091	Meio de soro reduzido
OptiMEM/Meio de soro reduzido	Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)	https://www.originlab.com/	RRID:SCR_014212	Software de análise de dados e gráficos
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122
pIRE4-Azi	Addgene	Plasmídeo # 105829	Construção transfectada
Bromidrato de poli-L-lisina	Sigma Aldrich	Cat # P2636
Ácido protocatecuico (PCA)	Grupo HWI	99-50-3
smCamera (Versão 1.0)	http://ha.med.jhmi.edu/resources/		Câmera software
Bicarbonato de sódio	FisherBioReagents	144-55-8
Hidróxido de sódio (NaOH)	Sigma	1310-73-2
Filtro de seringa	Whatman UNIFLO	Cat#9914-2502	Filtragem líquida
Trolox	Sigma	53188-07