Method Article

Desenvolvimento e teste de dipeptídeos nanoestruturados metilados que inibem a atividade da Src quinase in vitro para aplicações anticâncer

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentado aqui é um protocolo para projetar e testar dipeptídeos que podem inibir a atividade da enzima Src quinase usando ensaios acelulares e celulares para aplicações anticâncer. Os peptídeos formulados aqui (WRCH3, WCH3-R CH3 e WR (CH3) 2) inibiram a Src quinase com valores de IC50 de 510 nM, 916 nM e 1 μM, respectivamente.

Abstract

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Aqui, com o objetivo de desenvolver um novo tratamento anticâncer, foram projetados sete dipeptídeos que continham triptofano metilado e/ou arginina metilada e foram produzidos usando a síntese de peptídeos de fase sólida Fmoc. A superexpressão da enzima tirosina quinase Src tem sido implicada no desenvolvimento de diferentes tipos de câncer. Dipeptídeos contendo aminoácidos não naturais, como arginina metilada (RCH3), arginina dimetilada (R (CH3) 2) e / ou resíduos de triptofano metilado (WCH3), demonstraram inibir a Src quinase. Neste estudo, três desses dipeptídeos, WRCH3, WCH3-R CH3 e WR (CH3) 2, foram testados usando ensaios acelulares e apresentaram valores de IC50 (a concentração na qual ocorre 50% de inibição) de 510 nM, 916 nM e 1 μM, respectivamente. Esses valores foram comparáveis aos obtidos para peptídeos cíclicos penta a nano-W-R ([W-R]5-[W-R]9) sintetizados em estudos anteriores. No entanto, as versões não metiladas dos dipeptídeos não mostraram nenhuma atividade inibitória contra a Src quinase. Todos esses dipeptídeos (50 μM) não mostraram citotoxicidade após incubação por até 72 h com três linhagens celulares cancerígenas diferentes, incluindo leucemia (CCRF-CEM), adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231) e adenocarcinoma ovariano (SK-OV-3), indicando a permeabilidade limitada dos peptídeos através da membrana celular. Portanto, mais estudos são necessários para melhorar a permeabilidade desses peptídeos para aplicações anticancerígenas, como o uso de um transportador de peptídeos ou funcionalização adicional de peptídeos. Em resumo, este estudo fornece um protocolo para sintetizar e testar peptídeos que inibem a atividade da Src quinase e, portanto, possuem capacidade anticancerígena promissora, conforme demonstrado usando ensaios acelulares e celulares.

Introduction

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O câncer é causado pelo crescimento anormal de células normais e é uma das doenças mais letais em todo o mundo. Essas células anormais se espalham para diferentes órgãos do corpo por um processo chamado metástase. A forma mais comum de câncer é o câncer de mama, que ocorreu em 2,26 milhões de pessoas em 2020. Além disso, houve cerca de 1,80 milhão de mortes por câncer de pulmão em 20201. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, cerca de 10 milhões de pessoas morreram de câncer em 20202. As células cancerígenas diferem das células normais porque superexpressam certas enzimas, como as proteínas tirosina quinases (PTKs). O Instituto Nacional do Câncer define quinases como enzimas capazes de fosforilar outras proteínas ou açúcares3. O conhecimento da função reguladora das quinases pode facilitar o desenho de medicamentos anticancerígenos eficazes. Por exemplo, os PTKs catalisam a fosforilação de outras proteínas ou açúcares e, como consequência, o ATP é convertido em ADP pela perda de um grupo fosfato. Um total de 80% dos oncogenes e proto-oncogenes codificam PTKs4. As Src quinases são uma família de tirosina quinases não receptoras, incluindo Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes e Yrk, que são superexpressas em células cancerígenas, especialmente no câncer de mama 5,6. As tirosina quinases Src estão associadas à mitogênese, diferenciação, ativação de células T e transformação celular. Src ajuda na invasão e metástase de células cancerígenas devido à sua capacidade de reduzir a adesão de células cancerígenas. Existem cinco domínios diferentes na Src quinase, ordenados dos terminais N a C como: domínio de ácidos graxos, domínio de homologia Src 3 (SH3), domínio de homologia Src 2 (SH2), domínio tirosina quinase (SH1) e domínio regulatório C-terminal7.

figure-introduction-1
Figura 1: Os domínios-alvo na enzima Src quinase, incluindo um domínio SH3, domínio SH2, domínio quinase (SH1) e um segmento regulador C-terminal curto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O domínio quinase SH1 é mais comumente direcionado ao projetar inibidores de Src quinase, pois contém dois locais conservados para ATP e ligação ao substrato (Figura 1). Se a sequência de aminoácidos do domínio quinase for conhecida, o substrato também pode ser usado como alvo para projetar um composto que imite a ligação do substrato à Src quinase8. Além disso, outros sites, como os domínios SH3 e SH2, podem ser usados como destinos. Em comparação com outros agentes quimioterápicos, os inibidores de quinase apresentam menor toxicidade e maior eficácia9. Em setembro de 2021, havia 73 pequenas moléculas que atuam como inibidores de quinase que foram aprovadas pelo FDA10. O imatinibe é um exemplo de medicamento anticâncer que inibe seletivamente a atividade da tirosina quinase; no entanto, alguns pacientes são resistentes à droga devido ao aparecimento de uma mutação pontual no domínio quinase11. A AstraZeneca lançou o Saracatinibe, que é um medicamento que inibe a família Src de tirosina quinases com um valor de IC50 (a concentração na qual ocorre 50% de inibição) de 2,7 nM, mas foi descontado nos ensaios de fase 212. Dos 52 inibidores de PTK aprovados pelo FDA dos EUA no início de 202013, apenas 28 PTKs de receptor-alvo, 11 bloqueiam o PTK não receptor, 11 inibem proteínas quinases de serina/treonina e dois bloqueiam MEK1/213. O crescente interesse de pesquisa em oncologia continuará a alimentar a descoberta de inibidores de quinase como potenciais medicamentos anticâncer. No entanto, apenas 50 das 500 proteínas quinases foram alvo de tratamento até agora; portanto, espera-se que um número maior de quinases seja estudado para o desenvolvimento de medicamentos em um futuro próximo14. Além disso, é necessário descobrir inibidores de quinase para explorar mutações de quinase ainda não identificadas que levam ao câncer.

Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver peptídeos que pudessem ser usados como inibidores para a família Src e atingir o sítio de ligação do ATP devido à sua capacidade de servir como um sítio conservado entre diferentes quinases. Para tanto, uma série de dipeptídeos contendo triptofano metilado e/ou arginina metilada foram sintetizados e testados quanto à sua capacidade sinérgica de inibir a Src quinase. O anel indol do triptofano imita a adenina do ATP e compete com o ATP da ligação ao local de ligação do ATP. Além disso, a arginina metilada no ligante compete pelo domínio SH3 de Src. Os pesquisadores mostraram que um polipeptídeo contendo arginina desmetilada inibe o domínio SH3, possivelmente devido a uma sequência conservada específica no motivo de ligação SH3 (ou seja, PXXP), que tem uma afinidade de ligação a um ligante contendo dois a três resíduos de Arg no N-terminal ou um a dois resíduos de Arg no C-terminal dos ligantes15, 16,17. O grupo guanidino de Arg liga-se ao resíduo Asp-99 conservado do domínio SH318,19, enquanto a porção restante do Arg liga-se ao Trp-118 conservado da enzima, conforme confirmado pela análise de RMN e pelas estruturas cristalinas de vários domínios SH319. Aqui, é apresentado um protocolo para a síntese de sete dipeptídeos metilados e teste de sua capacidade de inibição contra a Src quinase. Além disso, a capacidade desses peptídeos de matar várias linhagens de células cancerígenas in vitro foi examinada.

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Protocol

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1. Síntese de peptídeos

NOTA: A síntese de W-R é descrita como um exemplo representativo (Figura 2).

  1. Pesar 566 mg (0,3 mmol) de resina H-Arg(Pbf)-2-clorotriril e adicioná-la ao vaso de síntese do peptídeo (ver Tabela de Materiais), de acordo com o procedimento utilizado por Mandal et al20. Realize a síntese de peptídeos usando a estratégia bem estabelecida de síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS)21.
    NOTA: Dipeptídeos metilados ou dimetilados contendo aminoácidos não naturais foram montados em uma resina de amida de pista (capacidade de carga de 0,3 mmol / g), enquanto dipeptídeos contendo aminoácidos naturais foram montados em uma resina que tinha o primeiro aminoácido ligado a ela, como a resina H-Arg (Pbf) -2-clorotriril (capacidade de carga de 0,3 mmol / g). É importante ressaltar que a resina amida da pista produz um peptídeo coberto com um C-terminal NH2.
  2. Inche a resina seca por 1 h em 5 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) sob pressão de gás nitrogênio conectado ao vaso peptídico.
    NOTA: Execute todo o processo de síntese em uma hotte. Óculos, luvas e jaleco precisam ser usados durante todo o experimento. Um temporizador também é essencial para acompanhar as etapas de adição de reagentes químicos.
  3. Remova o excesso de DMF usando a pressão do gás nitrogênio conectada ao vaso de síntese do peptídeo durante todo o processo de síntese.
  4. Pesar 473,9 mg de Fmoc-trp(Boc)-OH (0,9 mmol) e 341 mg de hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (HBTU) (0,9 mmol) como reagentes de acoplamento. Adicione os pós a um tubo de ensaio e dissolva-os em 5 mL de DMF seco.
  5. Adicione 313,4 μL (1,8 mmol) de N,N-Diisopropiletilamina (DIPEA) como agente ativador no tubo de ensaio (etapa 1.4) e misture agitando o tubo.
  6. Adicionar o conteúdo do tubo de ensaio à resina e deixar a reacção prosseguir durante 1 h sob gás azoto à temperatura ambiente. Em seguida, drene o excesso de DMF usando pressão de gás nitrogênio e lave a resina 3x com DMF.
  7. Desproteja o Fmoc N-terminal usando 5 mL de piperidina a 20% em DMF (v / v) por 20 min sob gás nitrogênio. Lave a resina 3x com DMF (3 x 5 mL).
  8. Seque a resina adicionando 5 mL de diclorometano (DCM) e mantenha-a sob gás nitrogênio por 5 min, depois drene o DCM usando pressão de gás nitrogênio. Adicione 5 mL de metanol sob gás nitrogênio por 5 min para aumentar a secura da resina.
  9. Adicione 10 mL de um coquetel de clivagem recém-preparado de TFA / tioanisol / ditiotreitol / anisol (90: 3: 5: 2 v / v / p / v) por 2,5 h para desproteger todas as cadeias laterais e separar o dipeptídeo da resina.
    CUIDADO: O coquetel de clivagem precisa ser adicionado em um cilindro medidor de vidro, pois o TFA é ácido e perigoso; Tome cuidado ao usá-lo.
  10. Após 2,5 h, drenar a solução de reacção do recipiente peptídico utilizando pressão de azoto para um balão de fundo redondo. Adicionar 250 ml de éter dietílico frio (Et2O) ao balão redondo de fundo que contém o peptídeo bruto para precipitar o peptídeo.
  11. Filtrar o peptídeo precipitado usando um papel de filtro em um funil cônico com um braço lateral conectado à água (de modo que a filtração ocorra devido à pressão da água) e coletar o precipitado (os peptídeos) para remover completamente o éter. O peptídeo bruto precipita em 10 min.
  12. Purificar o peptídeo bruto numa coluna de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase inversa (ver quadro de materiais) utilizando um sistema de gradiente. Use um gradiente de 0% a 100% de acetonitrila contendo 0,1% de TFA em água contendo 0,1% de TFA por 30 a 60 min a uma taxa de fluxo de 1 mL / min.

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Figura 2: Síntese de peptídeos em fase sólida de W-R. Abreviaturas: HBTU = 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato; DIPEA = N,N-Diisopropiletilamina; TFA = ácido trifluoroacético; DMF = dimetilformamida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Determinação da toxicidade celular dos peptídeos sintetizados

  1. Colocar 2.000 células/poço de células SK-OV-3, 5.000 células/poço de células MDA-MB-231 ou 5 × 106 células/poço de células CCRF-CEM (em um volume total de 100 μL/poço) em uma microplaca de 96 poços. Incubar as células em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2, 95% de ar a 37 °C até atingirem 75%-80% de confluência.
    NOTA: O meio RPMI-16 é usado para cultivar células CCRF-CEM e o meio essencial mínimo de Eagle (EMEM) para as linhagens celulares MDA-MB-231 e SK-OV-3. Ambos os meios são suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina em NaCl 0,9%). Colocar todos os meios e suplementos num banho-maria a 37 °C durante 30 minutos antes de iniciar a experiência. O experimento deve ser realizado com um capuz de biossegurança, usando luvas e jaleco.
  2. Aspire o meio usando uma pipeta e adicione 100 μL do peptídeo 50 μM ou doxorrubicina 10 μM (Dox) usado como controle positivo em triplicado em poços contendo os três tipos diferentes de células cancerígenas semeadas na placa de 96 poços. Retorne a placa à incubadora por 72 h (nas mesmas condições mencionadas na etapa 2.1).
  3. Após 72 h, adicione 20 μL de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS) na placa de 96 poços. Envolva a placa com papel alumínio e incube a placa por 1-4 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada.
    NOTA: O MTS é um corante usado para visualizar células vivas (não tratadas ou tratadas com os peptídeos), uma vez que apenas as células vivas convertem o tetrazólio MTS em corante formazan colorido que pode ser medido a 490 nm.
  4. Medir a absorvância do produto de formazano a 490 nm (A490) num leitor de microplacas (ver Tabela de Materiais). Incluir meio misturado com MTS como um branco para o experimento. Use água sozinha (já que os peptídeos são solúveis em água) e HCl 0,1 N (já que WCH3 requer HCl para se dissolver) como controles negativos.
  5. Meça a porcentagem de sobrevivência celular usando a seguinte equação (Eq 1), usando um programa de planilha (ver Tabela de Materiais). O procedimento é o mesmo utilizado por Mandal ecols.20.
    figure-protocol-2Eq (1)

3. ensaio de atividade da quinase c-Src

NOTA: O ensaio de atividade da Src quinase foi realizado utilizando-se um kit de ensaio comercial (ver Tabela de Materiais) em triplicata, de acordo com o procedimento de Chhikara et al.22. Use WCH3 e RCH3 sozinhos como controles para comparar o efeito do aminoácido metilado sozinho na quinase e com outro aminoácido metilado ou não metilado.

  1. Em uma microplaca de fundo redondo de superfície preta não vinculativa de baixo volume de 384 poços, adicione 2,5 μL do coquetel de reação contendo 0,7 nM Seu domínio de quinase 6-Src no tampão quinase, que faz parte do kit de ensaio, a 2,5 μL de peptídeos pré-diluídos dissolvidos em 10% de DMSO (4x concentração alvo). Incubar por 10 min em temperatura ambiente usando um agitador de microplacas (5 rpm) seguindo o protocolo do fabricante.
    NOTA: O coquetel de reação consiste no tampão quinase (200 mM HEPES, pH 7,5), MgCl2 (16 mM), DMSO (4%), EGTA (8 mM), 2-mercaptoetanol (43 mM) e Brij-35 (0,04%). O substrato ideal da reação da quinase deste experimento é (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. Adicione 5 μL do coquetel de ATP/substrato (40 μM/600 μM) à placa e incube por 30 min em um agitador de microplacas à temperatura ambiente.
  3. Enquanto isso, prepare a mistura de detecção de ADP 1x contendo 8 nM de traçador de ADP e 10 μg/mL de anticorpo ADP2 conjugado com corante (consulte a Tabela de Materiais) para parar e detectar o tampão B (1x) do kit. Pare a reação da quinase (etapa 3.2) adicionando 10 μL da mistura de detecção 1x ADP e incube por 1 h em temperatura ambiente.
  4. Meça a intensidade de fluorescência usando um leitor de microplacas, com excitação a 580 nm, emissão a 630 nm e largura de banda de 10 nm. Obter unidades de fluorescência relativa (RFU) do instrumento para obter a percentagem de inibição enzimática, de acordo com a Eq (2).
    figure-protocol-3Eq (2)
  5. Calcule o valor do IC50 conforme listado no site da empresa23.

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Results

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W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 e os peptídeos W-R de controle foram sintetizados usando a síntese de peptídeos de fase sólida Fmoc (Figura 3), com 95%, 98,7%, 99%, 100%, 100% e 99,5% de pureza, respectivamente. As estruturas químicas desses dipeptídeos foram confirmadas usando ESI-MS. Os valores m/z desses dipeptídeos foram 374,1624, 388,1949, 388,1794, 374,1815, 402,2022 e 361,1457, ...

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Discussion

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Os peptídeos fabricados e testados aqui para a inibição da Src quinase e consequente morte de células cancerígenas continham triptofano metilado e / ou arginina metilada, que são aminoácidos não naturais. A formação do precipitado branco após a adição de éter dietílico é uma etapa crítica na síntese desses peptídeos. No entanto, nem todos os peptídeos sintéticos podem formar um precipitado; portanto, mesmo quando um precipitado não é formado, a síntese bem-sucedida de peptídeos pode ser ...

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Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

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Gostaríamos de agradecer ao Reitor de Pesquisa Científica (DSR) da Universidade King Abdulaziz (KAU), Jeddah, Arábia Saudita, que financiou este projeto sob a concessão nº. (G: 031-130-1443).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10708984001Síntese de peptídeos
Funil de filtro fritado Aldrich para síntese em fase sólidaSigma-AldrichZ283304Vaso de síntese de peptídeos
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisoleSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 AQueous One  Solução  Reagentes para Ensaio de Proliferação Celular PromegaG3582Ensaio de proliferação celular (reagente MTS)
Diclorometano, 99,9%, Extra DryFishersciAC326850025
Fmoc-ADMA (Pbf) -OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg (Me, Pbf) -OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg (Pbf) -OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp (Boc) - Coluna OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 Shimadzu  (Sistema RP-HPLC)gradiente de água/acetonitrila
IRDye QC-1 quencherBell Brook Labs, Madison, WI3013
Leitor de microplacas SpectraMax M2eDispositivos moleculares
Microsoft ExcelSoftware deplanilha
N,N-Diisopropiletilamina (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-Dimetilformamida, anidro, 99,8%FishersciAA43997M1
Piperidina 20%Sigma-Aldrich80645
Resina de amida de pista (100-200 mesh)Sigma-Aldrich8550010025
ThioanisoleSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013kit de ensaio de atividade de quinase c-Src
Microsoft

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