Reconstituição da Motilidade à Base de Actina com Proteínas Comercialmente Disponíveis

Resumo

Este protocolo descreve como produzir cometas de actina nas superfícies de contas usando ingredientes proteicos comercialmente disponíveis. Tais sistemas imitam as estruturas protuberantes encontradas nas células e podem ser usados para examinar mecanismos fisiológicos de produção de força de forma simplificada.

Resumo

Muitos movimentos celulares e mudanças de forma e certos tipos de motilidade bacteriana e organela intracelular são impulsionados pela actina do biopolímero que forma uma rede dinâmica na superfície da célula, organela ou bactéria. A base bioquímica e mecânica da produção de força durante este processo pode ser estudada reproduzindo o movimento à base de actina de forma acelular em superfícies inertes, como contas que são funcionalizadas e incubadas com um conjunto controlado de componentes. Sob as condições apropriadas, uma rede elástica de actina se reúne na superfície do grânulo e se abre devido à tensão gerada pelo crescimento da rede, formando um "cometa de actina" que impulsiona o grânulo para a frente. No entanto, tais experimentos requerem a purificação de uma série de diferentes proteínas de ligação à actina, muitas vezes colocando-as fora do alcance de não-especialistas. Este artigo detalha um protocolo para a obtenção reprodutível de cometas de actina e motilidade de contas usando reagentes comercialmente disponíveis. O revestimento do talão, o tamanho do talão e a mistura de motilidade podem ser alterados para observar o efeito na velocidade do talão, trajetórias e outros parâmetros. Este ensaio pode ser usado para testar as atividades bioquímicas de diferentes proteínas ligadoras de actina e para realizar medições físicas quantitativas que lançam luz sobre as propriedades da matéria ativa das redes de actina. Esta será uma ferramenta útil para a comunidade, permitindo o estudo da motilidade in vitro à base de actina sem conhecimento especializado em purificação de proteínas de ligação à actina.

Introdução

A polimerização da actina nas células é controlada espacial e temporalmente pela regulação apertada da nucleação do filamento de actina a jusante da sinalização celular¹. A nucleação ocorre através da formação de um trímero de actina e, em seguida, ambas as extremidades do filamento nascente polimerizam espontaneamente, embora uma extremidade seja mais dinâmica (a extremidade farpada) do que a outra (a extremidade pontiaguda)². Quando a nucleação e a polimerização da extremidade farpada são direcionadas para uma superfície, elas produzem força suficiente (na faixa de Newton pico-a-nano) para empurrar a membrana celular para o movimento e mover objetos do tamanho de mícrons dentro da célula com hidrólise de ATP como fonte de energia³. Alguns exemplos incluem bactérias Listeria monocytogenes que usam cometas de actina para se espalhar de célula para célula, e mitocôndrias, onde o movimento baseado em cometa de actina é importante para a herança aleatória durante a mitose ^4,5. Cometas de actina em endossomos e outras vesículas intracelulares estão implicados no descolamento das membranas doadoras ^6,7,8.

Com o método aqui apresentado, os aspectos sinalizadores da polimerização da actina celular são contornados, e a polimerização da actina é produzida em esferas micrométricas de poliestireno, revestindo-as com ativadores de nucleação de actina ramificada, especificamente o domínio ativo da proteína WASP humana, VCA (também chamada de WA ou WCA)¹. As esferas revestidas são então incubadas em uma mistura contendo os ingredientes necessários para a polimerização da actina, incluindo o principal nucleador de polimerização da actina nas células, o complexo Arp2/3, que é ativado pela VCA na superfície do grânulo para formar novos filamentos como ramificações dos lados dos filamentos filhos¹. A actina inicialmente polimeriza uniformemente em torno do talão, mas depois quebra espontaneamente a simetria para criar um cometa de actina que empurra o grânulo para a frente, recriando assim redes protrusivas semelhantes a células e cometas de maneira controlada. Abordagens semelhantes com contas e outras superfícies revestidas foram usadas no passado por nós e outros para estudar a bioquímica e a biofísica da polimerização da actina ^9,10,11,12, mas uma extensa experiência em proteínas ligadoras de actina foi necessária para esses experimentos. O protocolo apresentado aqui descreve como criar de forma robusta cometas de actina e motilidade inteiramente com reagentes comercialmente disponíveis (ou que em breve estarão disponíveis), tornando essa abordagem acessível a qualquer pessoa, inclusive em um ambiente educacional para o ensino de conceitos biofísicos. As principais características incluem a importância da pipetagem suave e confiável, o uso de monômero complexo com perfilina como fonte de actina e a essencialidade de usar um ativador complexo Apr2/3 altamente ativo como reagente de revestimento de contas.

Protocolo

1. Preparação de buffers

NOTA: Use H₂O ultrapuro para todos os buffers. Não precisa ser estéril. Filtrar todas as soluções descritas nos passos 1.1-1.4 com um filtro de seringa de 0,2 μm, alíquota em porções de 500 μL-2 ml por tubo, dependendo da utilização, e conservar a -20 °C.

1. Prepare 10% de BSA pesando 2 g de BSA em um tubo cônico de 50 mL e enchendo até a marca de 20 mL com H₂O. Misture até que a BSA esteja dissolvida (cerca de 30 min) e, em seguida, compense o volume para 20 mL.
   NOTA: Use BSA de alta qualidade (consulte Tabela de Materiais). A solução de BSA a 10% é usada tanto na preparação de contas quanto na mistura de motilidade.
2. Para a preparação do talão, preparar o tampão Xb (10 mM HEPES, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl 2 e 0,1 mM CaCl 2, pH 7,5) como uma solução 10x, e diluir antes do uso (100 μL de solução de reserva 10x Xb + 900 μL de H₂ O). Preparar Xb/1% BSA misturando 100 μL de solução de estoque 10x Xb + 100 μL de 10% BSA + 800 μL de H₂O.
3. Prepare o G-buffer (2 mM Tris, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM DTT,₂ mM ATP), que é o tampão usado para diluir a actina monomérica (G-actina). Ajuste para pH 7, não pH 8 como tradicionalmente usado (ver discussão).
4. Preparar o tampão de motilidade MB13 (10 mM HEPES, 1,5 mM ATP, 3 mM DTT, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1% BSA, pH 7,5). Para algumas aplicações, 10x MB13 é útil. No entanto, prepare 10x MB13 sem BSA, pois leva a problemas durante o ajuste do pH. Adicione BSA a partir de 10% de solução de estoque (preparada na etapa 1.1) ao reconstituir 1x MB13 de 10x MB13.

2. Preparação de soluções proteicas

NOTA: Use H₂O ultrapuro para todas as ressuspensões. Não precisa ser estéril. Manuseie todas as proteínas no gelo e alíquota em tubos pré-refrigerados. Manipule suavemente para não produzir bolhas, e nunca vortex soluções proteicas. Para que as existências sejam armazenadas a -80 °C, não é necessário congelar rapidamente em azoto líquido. Adapte o tamanho da alíquota para evitar mais de cinco ciclos de congelamento-descongelamento, pois isso não parece afetar a atividade de nenhuma das proteínas. As alíquotas de trabalho podem ser armazenadas a -20 °C durante algumas semanas.

1. Prepare a solução de G-actina (músculo esquelético do coelho) conforme descrito abaixo.
   1. Pó de actina de centrifugação de pulso (ver Tabela de Materiais) a 4 °C para recolher o sólido no fundo do tubo.
   2. Adicionar H 2 O de acordo com as instruções do fabricante (1 mg de proteína em 100 μL de H 2 O friopara actina não rotulada, 100 μg de proteína em 100 μL de H₂O fria paraactina marcada com ATTO).
   3. Deixe descansar no gelo por pelo menos 15 minutos. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo, deixe descansar no gelo pelo menos mais 15 minutos e misture novamente. Centrífuga de pulso a 4 °C para recolher a solução no fundo do tubo e remisturar.
   4. Prepare alíquotas de 10-50 μL de actina não rotulada, dependendo do uso, e alíquotas de 20 μL de actina marcada com ATTO. Conservar as alíquotas a -80 °C.
   5. Para despolimerizar os oligômeros de actina que se formam durante a liofilização e congelamento, diluir uma alíquota de actina ressuspensa ~8 vezes em tampão G cravado com ATP e TDT adicionais (por exemplo, a 20μL de solução de actina ressuspensa da etapa 2.1.4, adicionar 134 μL de G-buffer, 0,32 μL de 0,2 mM de ATP e 0,16 μL de 1 M TDT). Para marcação fluorescente, adicione aproximadamente 10% de actina marcada; por exemplo, adicionar 5 μL de actina marcada com ATTO a 40 μL de actina diluída não rotulada. Deixe despolimerizar no gelo com mistura ocasional (pipetagem) pelo menos alguns dias a uma semana antes de medir a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford, conforme descrito na etapa 3.
      NOTA: Manter a actina diluída não rotulada e fluorescente no gelo numa câmara fria ou frigorífico; nunca congele ou deixe aquecer. A preparação continuará a despolimerizar ao longo do tempo e, quando manuseada adequadamente, pode ser usada por pelo menos 6 meses.
2. Ressuspender o complexo Arp2/3 (cérebro suíno) (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante (20 μg de proteína em 20 μL de frio H 2 O), com a sequência de centrifugação de pulso, mistura, etc. no gelo, conforme descrito para a actina no passo_2.1. Combine as soluções proteicas da ressuspensão de dois tubos de pó para ter um estoque maior para experimentos reprodutíveis. Preparar alíquotas de 2 μL e conservar a -80 °C.
3. Resuspender a profilina (recombinante humano) (ver Tabela de Materiais) a uma concentração 4x superior à estipulada nas instruções do fabricante (100 μg de proteína em 25 μL frios H 2 O), com a sequência de centrifugação de pulso, mistura, etc. no gelo como para a actina na etapa_2.1. Combine as soluções proteicas da ressuspensão de dois tubos de pó antes de determinar a concentração de proteína para ter um estoque maior para experimentos reprodutíveis.
   NOTA: Manter no gelo em uma câmara fria ou geladeira; nunca congele ou deixe aquecer. Quando manuseada corretamente, a profilina ressuspensa é boa por pelo menos 6 meses a 1 ano.
4. Resuspender a proteína de cobertura (α1β2, recombinante humano) (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante (50 μg de proteína em 50 μL frios H 2 O), com a sequência de centrifugação de pulso, mistura, etc., no gelo, conforme descrito para a actina na etapa_2.1. Arrefecer 50 μL de glicerol sobre gelo e adicionar os 50 μL de proteína de cobertura ressuspensa ao mesmo; misture suavemente. Conservar a -20 °C.
   NOTA: A solução não congela e a atividade é robusta, de modo que a solução pode ser mantida como uma única alíquota por meses, ou mesmo anos, se manuseada com cuidado. A proteína de cobertura recombinante de camundongos, a mais comumente usada no passado em experimentos in vitro ¹³, em breve estará disponível comercialmente.
5. Resuspender a gelsolina (recombinante humano, marcada com His) (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante (20 μg de proteína em 20 μL frios H 2 O), com a sequência de centrifugação de pulso, mistura, etc. no gelo, conforme descrito para a actina na etapa_2.1. Cerca de 2 μL de gelsolina é usado por dia de experimentos; portanto, prepare alíquotas grandes (5-10 μL) e armazene a -80 °C.
   NOTA: O protocolo com gelsolina é fornecido como uma alternativa. Recomenda-se o uso de proteína de tamponamento no lugar da gelsolina, comprada ou purificada como em¹³.
6. Resuspender o VCA (WASP-VCA humano, etiquetado com TGS) (ver Tabela de Materiais) a uma concentração 2x superior à estipulada nas instruções do fabricante (500 μg de proteína em 250 μL frios H 2 O), com a sequência de centrifugação de impulso, mistura, etc. no gelo como para a actina na etapa_2.1. Fazer alíquotas de 10 μL e conservar a -80 °C.
   NOTA: Uma vez que a SpVCA (pVCA humana, estreptavidina e His-tagged) é comercializada ou se a purificação da proteína¹⁴ for possível, recomenda-se o uso de SpVCA em vez de VCA. VCA não fornece cometas de forma reprodutível sob as condições descritas aqui.

3. Medição das concentrações proteicas

1. Construa uma curva padrão de Bradford feita de duas diluições seriais sobrepostas de BSA.
   NOTA: A curva padrão só precisa ser construída a cada dois meses (ou até com menos frequência), desde que o espectrofotômetro não mude.
   1. Na fila 1 de um rack de microtubos, coloque tubos para a série de diluição BSA #1: quatro tubos de 2 mL seguidos por quatro tubos de 1,5 mL. Na linha 3 do rack, coloque tubos para a série de diluição BSA #2 como para a série #1. Na fila 5 do rack, coloque um tubo de 2 mL para cada amostra a ser medida junto com dois tubos de 1,5 mL. Adicione um único tubo de 1,5 mL na linha 5 para o espaço em branco.
   2. Meça o reagente de Bradford (ver Tabela de Materiais) nos tubos de 1,5 mL.
      1. Encha um tubo cônico de 15 mL até o topo com o reagente Bradford para facilitar a pipetagem (o excesso será devolvido ao frasco de estoque na geladeira) no gelo. Pegue 200 μL de Bradford Reagente e ejete-o de volta para o tubo cônico para molhar a ponta da pipeta. Como a solução é viscosa, pipete lentamente para permitir que a solução entre e deixe a ponta completamente sem fazer bolhas.
      2. Com a ponta "pré-molhada", pipete lentamente 200 μL de Reagente Bradford para cada um dos tubos de 1,5 mL no rack (quatro para cada diluição de BSA, um para o branco e dois para cada amostra a ser medida). Faça isso primeiro para permitir que o reagente Bradford aqueça completamente à temperatura ambiente antes de se misturar com soluções proteicas. Devolver o conteúdo restante do tubo cónico de 15 ml ao frasco.
   3. Meça H 2 O nos tubos de₂mL. Na linha 1 do rack, adicione 1.990 μL H₂O ao primeiro tubo e 900 μL aos outros três tubos. Para a linha 3, adicione 1.992,5 μL ao primeiro tubo e 900 μL aos outros três tubos. Adicionar 2.000 μL H₂O a cada um dos tubos de amostra da linha 5.
      NOTA: Para todos os volumes maiores que 1.000 μL, use uma pipeta de 1.000 μL, mas administre a quantidade total pipetando duas vezes. É importante deixar tudo pronto antes de iniciar as etapas subsequentes, a fim de evitar deixar proteínas altamente diluídas em H₂O por longos períodos de tempo.
   4. Para preparar a série de diluição BSA #1, misture 10 μL de BSA calibrado de 2 mg/mL (ver Tabela de Materiais) no tubo com 1.990 μL H₂O para fazer uma solução de 10 μg/mL. A partir disso, fazer três diluições seriadas (5 μg/mL, 2,5 μg/mL e 1,25 μg/mL BSA) transferindo 900 μL de cada solução para o tubo seguinte (contendo 900 μL H₂O).
   5. Para preparar a série de diluição BSA #2, misture 7,5 μL de BSA calibrado de 2 mg/mL no tubo com 1.992,5 μL H₂O para fazer uma solução de 7,5 μg/mL. A partir disso, fazer três diluições seriadas (3,75 μg/mL, 1,875 μg/mL e 0,9375 μg/mL BSA) transferindo 900 μL de cada solução para o próximo tubo (contendo 900 μL H₂O).
   6. Misture e leia a absorbância para gerar a curva padrão. Adicione 800 μL H₂O ao tubo reagente de Bradford para o espaço em branco e inicie o temporizador. Da forma mais eficiente possível, sem fazer bolhas, misture 800 μL de cada norma BSA com 200 μL de reagente Bradford nos tubos preparados. Uma vez que todos os padrões tenham sido misturados com o reagente de Bradford (< 5 min), despeje cada padrão em uma cubeta descartável e leia a absorvância a 600 nm no espectrofotômetro depois de cobrir a máquina.
      NOTA: A mesma cubeta pode ser usada para ler toda a série se o padrão menos concentrado for lido primeiro e a cubeta for bem esvaziada entre as leituras. Refaça a curva padrão até que o ajuste linear tenha um valor R de pelo menos 0,99. Somente depois que a pipetagem e a mistura suave forem dominadas, prossiga para a leitura das amostras.
2. Medir as concentrações de actina e proteínas de ligação à actina
   1. Nos tubos de 2 ml contendo 2.000 μL de H 2 O (preparados na etapa 3.1.3), misture suavemente o seguinte:₂μL cada de complexo Arp2/3 e profilina, 4 μL de G-actina marcada, 5 μL cada de gelsolina e VCA e 8 μL de proteína de encapsulamento (recombinante humano). Tomar imediatamente 800 μL da solução e misturar com o reagente de Bradford já preparado e, em seguida, repetir para ter duas leituras dentro de 5%-10 % uma da outra para cada amostra. Uma diferença maior indica um problema com a ressuspensão ou manuseio. Leia dentro de alguns minutos após a mistura com o reagente Bradford.
      NOTA: Se estiver a utilizar uma curva padrão de outro dia, apenas o espaço em branco do passo 3.1.6 tem de ser preparado, para além das amostras.
3. Calcular as concentrações de actina e proteínas ligadoras de actina utilizando a curva padrão e o factor de diluição. Refaça a medição para cada nova resuspensão. Os pesos moleculares para converter as leituras de mg/mL obtidas via ensaio de Bradford em μM são: actina 43 kD, complexo Arp2/3 224 kD, profilina 15 kD, gelsolina 95 kD, proteína de encapsulamento 68 kD (recombinante humano) ou 63,5 kD (recombinante de camundongo), VCA 43 kD e SpVCA 54 kD (peso molecular de monômero).

4. Revestimento de contas

1. Pré-arrefecer a centrífuga a 4 °C e ajustar o bloco seco agitador (ver Tabela de Materiais) para 18 °C.
2. Lavar os grânulos: pipetar 50 μL de tampão Xb para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 9 μL de suspensão de grânulos de 4,5 μm de diâmetro ou 2 μL de suspensão de grânulos de 1 μm de diâmetro (suspensão a 2,5 % p/v) (ver Tabela de materiais). Misturar cuidadosamente e centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   NOTA: A área de superfície total do talão de ambos os tamanhos de grânulos é de 3 cm²:
   
   derivada calculando o número de contas e, em seguida, sua superfície total usando equações clássicas para o volume e a área de superfície das esferas. Outros tamanhos de contas podem ser usados se as quantidades forem ajustadas para manter a área de superfície total constante a 3 cm².
3. Revestir as contas: remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as contas e ressuspenda o pellet de grânulos em 40 μL de 2 μM SpVCA (ou 7 μM VCA) em buffer Xb por pipetagem suave. Agite a 18 °C, 1.000 rpm durante 20 min.
4. Lavar as contas revestidas: centrifugar a mistura (20.000 x g durante 10 min a 4 °C) e remover cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender os grânulos em 50 μL de Xb/1% BSA fria e centrifugar a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e repita o passo de lavagem 1x.
5. Ressuspender o pellet de grânulo revestido da etapa 4.4 em 120 μL de Xb frio/1% BSA para ambos os tamanhos de grânulos, de modo que a quantidade de área de superfície do talão/μL de solução de grânulo seja a mesma. Armazenar no gelo em uma geladeira ou câmara fria. As contas revestidas continuarão a funcionar normalmente por pelo menos várias semanas.

5. Preparando a mistura de motilidade e lâminas para observação

NOTA: O volume total da mistura de motilidade é de 8,4 μL para permitir uma folga de cerca de 25 μm entre a lâmina e a derrapagem de cobertura de 18 mm x 18 mm, de modo que contas de todos os tamanhos (até 10 μm de diâmetro) não sejam espremidas. A mistura básica de motilidade é de aproximadamente 5 μM de G-actina (10% de actina fluorescente marcada) com 5 μM de perfilina, complexo Arp2/3 de 50 nM e proteína de encapsulamento de 25 nM (ou gelsolina de 240 nM).

1. Prepare a mistura de reação de motilidade. As quantidades exactas de actina (e, por conseguinte, de profilina) dependem da concentração calculada no passo 3.3, mas uma reacção representativa é a seguinte. Misturar no gelo, por esta ordem: 3,2 μL de MB13, 1,5 μL de profilina a 30 μM diluída em MB13, 1 μL de proteína de cobertura a 0,21 μM diluída em MB13 ou gelsolina diluída a 2 μM em MB13, 1 μL de complexo Arp2/3 a 0,47 μM diluído em MB13, 0,2 μL de suspensão de grânulos (vórtice imediatamente antes da utilização), e 1,5 μL de actina a 30 μM em tampão G. Misture bem, mas rapidamente, e inicie o temporizador.
2. Observe toda a mistura de reação de motilidade em uma lâmina. Cubra com uma tampa de 18 mm x 18 mm e sele a folha de cobertura com VALAP derretido usando um pequeno pincel. VALAP é uma mistura de lanolina, parafina e vaselina (ver Tabela de Materiais) 1:1:1 em peso, derretida e agitada.

6. Observação microscópica

1. Observe as reações de motilidade imediatamente usando uma objetiva de 100x em um microscópio vertical ou invertido (ver Tabela de Materiais), equipado com contraste de fase e/ou microscopia de epifluorescência (cubo GFP, ver Tabela de Materiais). As observações são feitas à temperatura ambiente (23-25 °C).
   1. Para obter velocidades médias de deslocamento para toda uma população de contas, registre o contraste de fase ou imagens estáticas fluorescentes ao longo do tempo, digitalizando todo o slide. Meça o comprimento do cometa à mão e plote o tempo. A inclinação do ajuste linear é a velocidade média de crescimento.
   2. Para avaliar a velocidade de contas individuais, colete filmes de lapso de tempo em microscopia de contraste de fase. Dependendo da velocidade do talão e da resolução necessária, leve quadros a cada 1-10 s. Use a ferramenta de rastreamento de qualquer programa de processamento de imagem para obter velocidades e trajetórias de contas.

Resultados

Um dos aspectos-chave da criação reprodutível de cometas de actina em contas é a pipetagem suave e precisa de delicadas proteínas de ligação à actina. Gerar uma curva padrão de Bradford é uma boa maneira de avaliar as habilidades de pipetagem. A Figura 1A,B mostra os tubos para a curva padrão e um exemplo de como são as duas diluições seriais da BSA uma vez misturadas com o reagente de Bradford. Observe a tonalidade azul graduada (maior concentração de proteína dá uma solução mais azul). Quando lidas no espectrofotômetro e plotadas, essas soluções fornecem uma curva padrão, como mostrado na Figura 1C. Para praticar uma pipetagem cuidadosa, o ensaio deve ser repetido até que o fator de correlação linear seja de 0,999, como mostrado.

Uma vez que as concentrações de proteínas resuspensas comerciais tenham sido cuidadosamente avaliadas através do ensaio de Bradford, as esferas revestidas e a mistura de motilidade são preparadas e misturadas. A Figura 2A mostra imagens representativas dos diferentes estágios de formação de cometas: nuvens de actina se formam em poucos minutos após a mistura de contas revestidas de SpVCA e meio de motilidade; a polarização das nuvens ocorre a ~5 min e a produção de cometas a 15-20 min. Os cometas actina, visíveis com epifluorescência e microscopia de contraste de fase (Figura 2A), continuam a se alongar por muitas horas, mas uma velocidade consistente não é mantida, de modo que a motilidade do talão é normalmente avaliada dentro de 1 h. Por outro lado, são necessários 30 minutos com contas revestidas de VCA para obter nuvens de actina brilhantes (Figura 2B), e nenhum cometa se forma, embora a simetria comece a quebrar em 1-2 h (seta na Figura 2B) e as nuvens mostrem polarização após a incubação noturna.

A Figura 3 mostra um exemplo de avaliação da velocidade do grânulo na presença de proteína de tamponamento. Como todas as contas quebram a simetria aproximadamente ao mesmo tempo, são realizadas gravações de "pseudo-lapso de tempo" onde o slide é escaneado e as imagens de toda a população de cometas são tiradas ao longo do tempo (Figura 3A). Os cometas não despolimerizam; portanto, o aumento nos comprimentos dos cometas medidos ao longo do tempo pode ser usado para calcular a velocidade de deslocamento (Figura 3B). A gelsolina pode ser usada no lugar da proteína de encapsulamento para a formação de cometas se 10x mais gelsolina for adicionada para compensar sua atividade de tamponamento reduzida. Os cometas formados na presença de gelsolina são qualitativamente os mesmos e se movem aproximadamente às mesmas velocidades que as contas com proteína de encapsulamento (Figura 3C). A atividade de encapsulamento é fundamental para concentrar a polimerização na superfície do talão, e quando nem a proteína de encapsulamento nem a gelsolina estão incluídas na mistura de motilidade, as nuvens de actina nunca se polarizam para formar cometas, embora nuvens de actina brilhantes se formem ao redor das contas (Figura 3D). Cometas em contas podem ser usados para medir a produção de força baseada em actina em diferentes contextos bioquímicos, alterando a mistura de motilidade e observando o resultado na motilidade usando diferentes técnicas de micromanipulação, por exemplo,¹⁵.

Figura 1: Curva padrão de Bradford . (A) Imagem de como configurar os tubos para fazer a curva padrão de Bradford. Os tubos de amostra não são mostrados. (B) Imagem das duas diluições em série de BSA sobrepostas, uma vez misturadas com o reagente de Bradford. (C) As absorvâncias a 600 nm das soluções indicadas em (B) são medidas no espectrofotómetro e são plotadas em função das concentrações proteicas das soluções BSA. O ajuste linear é usado para calcular a concentração da amostra. O fator de correlação, R, do ajuste linear é de 0,999. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Formação de cometas em contas revestidas de SpVCA em oposição a contas revestidas de VCA. (A) Contas representativas revestidas de SpVCA (contas diferentes em cada imagem) mostradas ao longo do tempo. Tempo a partir do momento da mistura é indicado. As nuvens de actina se formam imediatamente, e a polarização das nuvens dá cometas, que continuam a se alongar por horas. (B) Contas representativas revestidas de VCA (contas diferentes em cada imagem) mostradas ao longo do tempo. Mais de 1 h é necessário para ver o início da polarização da nuvem de actina (seta) e mesmo incubações longas não produzem cometas. Todas as imagens são de contas de 4,5 μm de diâmetro, imagens de epifluorescência de actina fluorescente emparelhadas com visualização de contraste de fase para os pontos de tempo de 15 e 20 min em (A), barras de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise da velocidade dos cometas e das contas. (A) e (C) Na presença de proteína de cobertura (CP) ou gelsolina, as nuvens de actina polarizam-se para formar cometas nos primeiros 20 minutos de reação, e os cometas alongam-se ao longo do tempo. Tempo de mistura indicado para cada imagem; cada imagem é uma conta diferente. Existe alguma variabilidade entre as contas e a preparação, mas, em média, as contas se movem a velocidades de mícron/submícron por minuto (0,2-1 μm/min) sob as condições padrão descritas aqui. (B) Gráfico representativo mostrando a avaliação do comprimento do cometa (população total de contas) ao longo do tempo. A inclinação da correlação linear corresponde à velocidade média de deslocamento, neste caso 0,24 μm/min. (D) Na ausência de atividade de tamponamento (sem proteína de encapsulamento ou gelsolina), nuvens de actina se formam em torno de contas, mas os cometas não se formam. Todas as imagens são de contas de 4,5 μm de diâmetro, imagens de epifluorescência de actina fluorescente, barras de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo detalhado aqui descreve como obter o crescimento da rede de actina em superfícies de contas, formação de cometas e motilidade de contas usando proteínas comercialmente disponíveis. No entanto, às vezes os cometas não são observados de forma reprodutível ou não são homogêneos entre o slide e o coverslip. A discussão a seguir enfatiza alguns pontos-chave do protocolo e sugere alguns parâmetros que podem ser ajustados. Um fator a ter em mente é que a formação de cometas e a velocidade do grânulo são afetadas pela temperatura, com temperaturas muito acima de 25 °C ou muito abaixo de 23 °C impactando negativamente a formação de cometas e fornecendo dados irreprodutíveis. O uso de um microscópio com temperatura controlada ou um microscópio em uma sala climatizada é altamente recomendado. Embora a actina marcada fluorescentemente seja frequentemente incluída na mistura de motilidade para observar cometas por microscopia de fluorescência, uma vez que os cometas têm mais de um diâmetro de contas de comprimento, eles também são visíveis por microscopia de contraste de fase como uma mancha escura ao lado da conta. A visualização do contraste de fase é mais apropriada para imagens de lapso de tempo, pois alguma fototoxicidade está associada à imagem de fluorescência, mesmo através de disco giratório. Como as contas se depositam com o tempo, um microscópio invertido produz menos deriva horizontal de contas do que um vertical e é mais apropriado para filmes. O uso de VALAP derretido para selar lâminas é importante, pois substâncias como o esmalte interferem na formação de cometas. Grandes quantidades de VALAP podem ser feitas em um copo e, em seguida, retiradas para reabastecer copos menores mais passíveis de derretimento rápido. VALAP é bom por anos à temperatura ambiente.

Outro aspecto técnico fundamental é a meticulosa preparação da mistura de buffer e motilidade. Deve-se ter cuidado ao preparar o MB13, em particular na etapa de ajuste do pH. O pH do MB13 deve ser ajustado rapidamente para neutro com NaOH para evitar a hidrólise do ATP, mas não muito rapidamente, pois o EGTA se solubiliza à medida que o pH se aproxima do neutro. O EGTA é um ingrediente chave porque complexa o cálcio ligado à actina, dando na mistura de motilidade a forma mais ativa de magnésio¹⁶. MB13 preparado muito rapidamente ou muito lentamente dá formação de cometa sub-ótima ou mesmo nenhuma. Um ponto-chave adicional é manter um controle cuidadoso da concentração de KCl na mistura de motilidade ao brincar com as condições. Por exemplo, ao usar 1x MB13 na mistura de reações e diluir a profilina, a proteína de encapsulamento e o complexo Arp2/3 no MB13, a concentração final de KCl na reação de motilidade é de cerca de 40-50 mM devido à diluição pelo tampão G. Esta concentração dá os melhores resultados no ensaio do cometa, e mais de 60 mM KCl diminui a atividade nucleante complexa Arp2/3.

Do lado da proteína, um aspecto técnico crítico da obtenção de cometas de actina é o manuseio adequado de proteínas comerciais de ligação à actina, em particular a pipetagem precisa de quantidades de microlitros. A linearidade da curva padrão de Bradford é um bom teste de pipetagem e a curva pode então ser usada para medições de rotina de concentrações de proteínas. De fato, ao usar proteínas comerciais ressuspensas para o procedimento cometa, é importante sempre verificar as concentrações de proteínas, pois a variabilidade do lote e o erro do usuário durante a ressuspensão podem levar a diferenças entre as concentrações reais e esperadas. Às vezes, pequenas diferenças nas concentrações de proteínas podem levar à completa ausência de cometas.

Outro aspecto importante do método aqui apresentado é o uso da G-actina complexada com perfilina como combustível para polimerização. Historicamente, os sistemas in vitro utilizaram a actina filamentosa pré-polimerizada (F-actina) como fonte de actina: despolimerização a granel alimentada com polimerização na superfície^10,17. Isso teve a vantagem de controlar os níveis de G-actina, mas adicionou uma camada de complexidade que exigia componentes adicionais para catalisar a despolimerização. Como a rotatividade da rede de actina não é necessária para a produção de força e motilidade, que são alimentadas por nucleação e polimerização na superfície do talão, enquanto fatores de despolimerização de actina, como ADF / cofilina, atuam nas redes envelhecidas longe da superfície¹⁸, a maior parte da reconstituição in vitro da motilidade à base de actina é agora feita sem rotatividade por simplicidade. No entanto, existem algumas desvantagens em usar a actina G. Primeiro, ao usar actina comercial, que foi liofilizada, os oligômeros estão presentes. As etapas de despolimerização aqui descritas são muito importantes na obtenção de resultados reprodutíveis. Em particular, embora o tampão G seja tradicionalmente ajustado ao pH 8, o pH mais baixo (pH 7, por exemplo) parece funcionar melhor nos ensaios descritos neste artigo, possivelmente porque o pH baixo aumenta a despolimerização¹⁹. Outra desvantagem do uso de G-actina é que, uma vez colocada em condições de sal permissivas à polimerização, ocorre nucleação espontânea e a F-actina se forma no volume, bem como na superfície do talão. A complexação da G-actina com a profilina suprime a nucleação espontânea na polimerização a granel e na extremidade pontiaguda, concentrando assim tanto a nucleação quanto a polimerização da extremidade farpada na superfície²⁰. A profilina-G-actina é fisiologicamente relevante, pois grande parte da actina na célula está presente nessa forma²¹. Aqui, uma proporção de 1:1 de profilina:actina é usada; no entanto, razões mais altas (por exemplo, 3:1) inibem mais completamente a polimerização a granel, embora razões mais altas também inibam o complexo Arp2/3 e o alongamento da extremidade farpada até certo ponto^22,23.

A atividade de encapsulamento também é fundamental para a formação de cometas, uma vez que garante a inserção de nova actina na superfície através de ciclos de nucleação pelo complexo Arp2/3 ativado pela superfície^24,25. Sem tampar, as nuvens de actina não quebram a simetria para formar cometas porque a polimerização na superfície não acumula tensão suficiente para abrir a nuvem²⁶. No passado, usamos a proteína de encapsulamento recombinante recombinante de camundongos¹³ purificada em casa, mas os testes realizados para este artigo indicam que a proteína de encapsulamento humano recombinante comercialmente disponível é igualmente eficaz, assim como a gelsolina comercialmente disponível, embora 10x mais gelsolina tenha que ser usada e, para certas aplicações, pode não ser apropriada, pois tem atividade de corte de actina, bem como tampamento²⁷.

Finalmente, a robustez deste método reside no uso de um ativador complexo Arp2/3 muito ativo, a estreptavidina-pVCA (SpVCA)²⁸. A SpVCA inclui o domínio de ligação profilina-G-actina do WASP (o domínio p), além do domínio de ligação complexa Arp2/3, uma vez que este é considerado mais eficiente em condições de profilina-G-actina²⁹. Mais importante ainda, o uso da tag estreptavidina, originalmente introduzida para permitir a funcionalização da superfície através da ligação biotina-estreptavidina, tem o efeito adicional de aumentar a ativação do complexo Arp2/3, presumivelmente devido ao fato de que a estreptavidina é um tetrâmero e, portanto, agrupa o ativador, conhecido por aumentar a atividade complexa Arp2/3³⁰ . O SpVCA produzido comercialmente está atualmente em desenvolvimento e em breve estará disponível para compra. Deve-se notar ainda que, embora 40 μL de 2 μM de SpVCA sejam rotineiramente usados para revestir 3 cm² de superfície do talão, outras concentrações de revestimento (cada vez mais baixas) também funcionam, e brincar com essas condições dá diferentes velocidades e morfologias de crescimento do cometa. De fato, quando os cometas não se formam ou o tamanho do cometa não é homogêneo na lâmina, diferentes condições de revestimento devem ser testadas, bem como diferentes concentrações de KCl e perfilina na mistura de motilidade. As concentrações de actina, complexo Arp2/3 e proteína de encapsulamento na mistura de motilidade também podem ser alteradas para otimizar a formação de cometas, mas em nossas mãos, mudar essas proporções muitas vezes dá resultados confusos.

Para concluir, os métodos aqui descritos produzem montagem de actina em superfícies de esferas e motilidade, mas qualquer superfície que possa ser funcionalizada com SpVCA pode ser usada. Nos casos em que a adsorção, como descrita aqui, não funciona, a fração estreptavidina pode ser usada para anexar SpVCA à superfície de interesse após a biotinilação. As estruturas de actina assim formadas, cometas ou não, podem ser utilizadas para testar diferentes aspectos bioquímicos e biofísicos das redes de actina, e são especialmente apropriadas para manipulações físicas com micropipetas, pinças ópticas e ablações a laser 15,26,31,32. Além de seus usos para a comunidade de pesquisa, a abordagem aqui descrita é apropriada como uma ferramenta de ensino para estudantes de graduação em biofísica estudarem conceitos de matéria ativa, como quebra de simetria e auto-organização.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Actina, músculo de coelho, conjugado Alexa Fluor 488	Invitrogen (ThermoFisher Scientific)	A12373 (descontinuado recentemente)	Este produto pode ser substituído por ATTO-488 actina da Hypermol.
Actina, músculo de coelho, ATTO-488	Hypermol	8153
Actina, músculo esquelético de coelho	Citoesqueleto	AKL99
Arp2/3 complexo	Citoesqueleto	RP01P
ATP	Sigma	A7699
BioEspectrômetro, básico	Eppendorf	035739
Bradford Reagente	Bio-Rad	500-0006
BSA,	Sigma	A3059
BSA padrão de alta qualidade 2 mg/mL (Pierce)	Thermo Scientific	23209
Proteína de capeamento (a1b2, recombinante de camundongo)	Purificado em casa (Referência 13)		Este produto estará disponível comercialmente em breve na Cytoskeleton.
Proteína de capeamento (a1b2, recombinante humano)	Hypermol	8322
Cube, GFP: U-MNIBA3 ou U-MWB2	Olympus	descontinuado	Qualquer cubo GFP, adaptado ao microscópio que está sendo usado, pode ser usado.
Bloco seco, agitador: ThermoMixer C (refrigerado)	Eppendorf	035963
** com SmartBlock, 24 microtubos 2 mL	Eppendorf	035969
Gelsolin (humano recombinante, His-tagged)	Citoesqueleto	HPG6
Lanolina	Sigma	49909
Microcentrífuga 5427R + rotor	Eppendorf	934126
Microscópio vertical: BX51	Olympus	descontinuado	Qualquer microscópio vertical de epifluorescência equipado com óptica de contraste de fase pode ser usado.
Microscópio invertido: IX70	Olympus	descontinuado	Qualquer microscópio invertido de epifluorescência equipado com óptica de contraste de fase pode ser usado.
Parafina	Sigma	76244
Vaselina: Vaselina	Sigma	16415
As pipetas Research Plus	Eppendorf		Gilson não funcionam tão bem para entrega de volumes muito pequenos (0,5 µ L, por exemplo).
**10 µ L		933954
**2.5 µ L		933953	Esses dois tamanhos são essenciais, mas recomenda-se o uso de pipetas de alta qualidade (um conjunto completo de Research Plus, por exemplo).
Contas de carboxilato de poliestireno	Polisciences
**aprox. 1 µ m diâmetro		08226
**aprox. 4,5 µ m de diâmetro		17140-5
Profilina 1 (humano recombinante, não marcado)	Citoesqueleto	PR02
SpVCA (domínio WASP pVCA humano, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag)	Purificado em casa (Referência 14)		Este produto estará em breve disponível comercialmente na Cytoskeleton.
VCA (domínio WASP VCA humano, marcado com GST)	Citoesqueleto	VCG03