Medindo a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos

Dentro da pesquisa metabólica, o exame da termogênese do músculo esquelético é uma nova avenida promissora para sondar a homeostase do peso corporal. A literatura publicada apoia a ideia de que as respostas termogênicas de um dos maiores sistemas de órgãos do corpo – o músculo esquelético – fornecem uma avenida para o aumento do gasto energético e outros efeitos metabólicos, reequilibrando efetivamente os sistemas dentro de doenças como a obesidade ^1,2,3. Se o músculo pode ser considerado um órgão termogênico, os estudos devem utilizar uma metodologia prática para estudar as mudanças termogênicas dentro deste órgão. O desejo de compreender o impacto endotérmico dos músculos esqueléticos e a utilidade dessa metodologia para o estudo da termogênese muscular sem tremores não são específicos dos estudos metabólicos. Disciplinas como evolução⁴, fisiologia comparativa⁵ e ecofisiologia ^6,7 têm demonstrado interesse em compreender as maneiras pelas quais a termogênese muscular pode contribuir para a endotermia e como esse mecanismo se adapta ao ambiente. O protocolo apresentado fornece os métodos críticos necessários para abordar essas questões.

O método fornecido pode ser utilizado na avaliação da modulação da temperatura muscular por estímulos contextuais e farmacológicos, incluindo a técnica única de fornecer odor de predador (PO) para mudar o contexto para replicar a ameaça do predador. Relatos prévios demonstraram a capacidade do PO de induzir rapidamente um aumento considerável na termogênese muscular⁸. Além disso, os estímulos farmacológicos também podem alterar a temperatura muscular. Isso foi demonstrado no contexto da termogênese muscular induzida por PO, onde o bloqueio farmacológico dos receptores β-adrenérgicos periféricos, utilizando nadolol, inibiu a capacidade do PO de induzir termogênese muscular sem afetar significativamente a termogênese contrátil durante a caminhada em esteira⁸. A administração central de agonistas do receptor de melanocortina em ratos também tem sido utilizada para discernir mecanismos cerebrais que alteram a termogênese ^9,10.

Fornecido aqui é uma investigação preliminar da capacidade do neurohormônio oxitocina (Oxt) para alterar a termogênese muscular em camundongos. Semelhante à ameaça predadora, os encontros sociais com um conespecífico do mesmo sexo aumentam a temperatura corporal, fenômeno denominado hipertermia social¹¹. Dada a relevância do Oxt para o comportamento social¹², especula-se que o Oxt seja um mediador da hipertermia social em camundongos. De fato, um antagonista do receptor de ocitocina diminui a hipertermia social em camundongos¹¹, e filhotes de camundongos sem Oxt apresentam déficits em aspectos comportamentais e fisiológicos da termorregulação, incluindo a termogênese¹³. Dado que Harshaw et al. (2021) não encontraram evidências que apoiassem a termogênese do tecido adiposo marrom (BAT) dependente do receptor adrenérgico β3 com hipertermia social¹¹, tem sido postulado que a hipertermia social pode ser impulsionada pela indução de termogênese muscular de Oxt.

Para medir a termogênese do músculo esquelético, o protocolo a seguir utiliza o implante de transponders IPTT-300 pré-programados adjacentes ao músculo de interesse em camundongos ou ratos 8,10,14,15. Esses transponders são microchips encapsulados em vidro que são lidos usando leitores de transponder correspondentes. Pouca ou nenhuma pesquisa utilizou essa tecnologia nessa capacidade, embora estudos tenham sugerido a necessidade da especificidade proporcionada por esse método^16,17. Investigações anteriores mostraram a confiabilidade desse método e uma variedade de maneiras pelas quais os transponders de temperatura podem ser usados em comparação com outros métodos de teste de temperatura¹⁸ ou em conjunto com métodos cirúrgicos (por exemplo, canulação¹⁹). No entanto, estudos dessa natureza dependem de diferentes posicionamentos estratégicos para medir a temperatura corporal global 20,21,22 ou tecidos especificados, como a MTD^23,24,25.

Em vez de medir a temperatura a partir desses locais ou ao usar termômetros de orelha ou reto²⁶, o método descrito aqui fornece especificidade para o músculo de interesse. A capacidade de atingir um local implantando diretamente transponders adjacentes aos músculos de interesse é mais eficaz para sondar a termogênese muscular especificamente. Fornece uma nova avenida, além daquelas fornecidas pela termometria infravermelha de superfície ^27,28 ou medições de temperatura cutânea via termopar ²⁹. Além disso, os dados fornecidos por meio desse método oferecem uma gama de caminhos de pesquisa, evitando a necessidade de equipamentos e softwares de grande porte, caros e de alta tecnologia, como a termografia infravermelha^30,31,32.

Este método tem sido utilizado com sucesso para medir a temperatura no quadríceps e gastrocnêmio, unilateralmente ou bilateralmente. Esse método também tem sido eficaz em conjunto com a cirurgia estereotáxica^14,15. Dentro de ~7-10 cm do membro do transponder, leitores de transponder portáteis (DAS-8027/DAS-7007R) são usados para digitalizar, medir e exibir a temperatura. Essa distância tem sido crítica e valiosa para investigações anteriores ^8,9,10, pois minimiza potenciais estressores e variáveis que alteram a temperatura, como o manuseio de animais durante os procedimentos de teste. Usando temporizadores, as medições podem ser registradas e coletadas ao longo de um período de tempo sem interação direta com os animais.

Para minimizar ainda mais a perturbação dos ratos durante o teste, este método descreve a montagem e o uso de risers feitos de tubulação de PVC para dar ao experimentador acesso ao fundo das gaiolas domésticas durante o teste. Usando os risers em conjunto com o leitor digital, as medições de temperatura do membro do transponder podem ser feitas sem qualquer interação animal após a colocação do estímulo. A um custo mínimo, este método pode ser utilizado em conjunto com estímulos farmacológicos e contextuais, tornando-o bastante acessível para os pesquisadores. Além disso, este método pode ser empregado com um número substancial de indivíduos (~ 16 ratos ou ~ 12 ratos) de cada vez, economizando tempo no aumento da taxa de transferência geral para qualquer projeto de pesquisa.

Introduzido neste método é um mecanismo criado para apresentar odores a ratos usando bolas de infusor de chá de malha de aço inoxidável, a partir de agora referidas como "bolas de chá". Embora essas bolas de chá sejam ideais para conter qualquer material de odor, nesses estudos, toalhas que serviram como cama na gaiola durante 2-3 semanas para furões, um predador natural de camundongos e ratos, são colocadas dentro de cada bola de chá de tratamento. Cada toalha é cortada em quadrados de 5 cm x 5 cm. Esta alíquota também é repetida com toalhas de controle inodoras idênticas. Apresentar esses odores sem barreira (ou seja, bola de chá) levou os ratos a triturar as fibras dentro de suas gaiolas, aumentando a atividade física. Esse comportamento não foi tão saliente em ratos. As bolas de chá fornecem um invólucro ventilado para a toalha, dando acesso total ao odor, mantendo-se protegidas durante todo o teste experimental. Essas bolas de chá podem ser higienizadas de acordo com os protocolos de uso animal, preparadas e introduzidas diretamente após a cirurgia para começar a habituar os animais à estrutura junto com o estímulo de controle. Os ratos podem então viver com o enriquecimento adicional, diminuindo a saliência da apresentação do estímulo agudo.

A habituação à presença da bola de chá é apenas um aspecto da habituação que é crítico para este método. O protocolo de habituação descrito também consiste na exposição repetida ao procedimento de teste para normalizar o ambiente de teste (ou seja, pessoal, transporte e movimento para o local de teste, exposição ao estímulo). Essa habituação prolongada minimiza as respostas matizadas dos animais e concentra as medições nas variáveis dependentes desejadas (por exemplo, estímulos farmacológicos ou contextuais). A avaliação prévia deste protocolo identificou quatro ensaios como o número mínimo de habituações necessárias antes do teste de temperatura dentro de gaiolas domésticas em ratos⁸. Se o teste for separado por longos períodos (mais de 2-3 semanas), os animais devem ser habituados novamente. Para habituação repetida, um mínimo de uma a duas tentativas são suficientes. No entanto, se os testes de temperatura forem separados por períodos de tempo mais prolongados, a repetição de mais ensaios pode ser necessária.

No esforço contínuo para acostumar camundongos e ratos ao procedimento de teste, um período de aclimatação antes da apresentação do estímulo deve ser incluído em cada ensaio experimental. Esse tempo de aclimatação é fundamental para reequilibrar a temperatura e a atividade depois de ser deslocado para o local de teste. Os roedores tendem a ter aumentos acentuados de temperatura devido à translocação. A aclimatação deve consistir em um mínimo de 1 h sem interação do experimentador no dia do teste antes de qualquer adição de um agente farmacológico ou estímulos contextuais. Isso é necessário a cada dia de teste.

Nos testes de temperatura da gaiola doméstica delineados, os ratos têm o alcance livre de sua gaiola doméstica para vagar em resposta ao estímulo testado. Isso pode causar mudanças variáveis na atividade, impactando a precisão das leituras de temperatura e, portanto, a análise dos efeitos termogênicos da variável independente (por exemplo, estímulo farmacológico ou contextual). Em reconhecimento às potenciais mudanças de temperatura devido ao nível de atividade, um protocolo é incluído abaixo descrevendo o uso da temperatura durante a caminhada em esteira. A literatura publicada descreve o uso bem-sucedido desse procedimento em ratos, e atualmente está sendo empregado com camundongos 8,10,14,15. A caminhada na esteira mantém uma velocidade constante de atividade para o sujeito do teste. Para este estudo, as esteiras são estritamente usadas para controlar o nível de atividade e, portanto, são ajustadas para a menor velocidade disponível na esteira para promover a caminhada para camundongos e uma configuração similarmente baixa para ratos.

O procedimento a seguir é descrito para a medição da temperatura do gastrocnêmio unilateral em camundongos e apresentação de odor de predador. O desenho pode ser usado em conjunto com agentes farmacológicos e é transferível para ratos e outros grupos musculares esqueléticos (ou seja, quadríceps) em camundongos. Para ratos, os transponders podem ser colocados no gastrocnêmio bilateralmente e no tecido adiposo marrom. Devido a limitações de tamanho e distância, apenas um transponder pode ser usado por mouse. Pequenas modificações (por exemplo, a remoção de estímulos contextuais) podem ser feitas para avaliar as respostas termogênicas a agentes farmacológicos.

Esses métodos podem ser aplicados a modelos de ratos e camundongos e foram realizados com aprovação institucional (Kent State University, IACUC Approval #359 e #340 CN 12-04). Antes da implementação do protocolo, os animais devem ser alojados em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparando o leitor de transponder

NOTA: Antes do uso, o leitor de transponder deve ser definido; as etapas a seguir incluem apenas as alterações de configuração necessárias para este estudo. Esta parte do protocolo está diretamente associada aos leitores portáteis DAS-8027-IUS; outros modelos de leitores devem seguir as instruções fornecidas pelo manual para obter resultados de programação.

1. Defina Bipe de áudio como DESATIVADO.
   1. Ligue o dispositivo pressionando o botão SCAN e aguarde até que a iluminação apareça na tela OLED. Mantenha pressionado o botão VOLTAR/MENU para acessar a tela do menu .
   2. Usando o botão NEXT/ENTER , percorra as opções até OPERATIONAL SETUP. Aqui, alterne as setas para cima ou para baixo para ativar SIM e abra o submenu operacional.
   3. Usando o botão NEXT/ENTER , role até AUDIO BEEP. Como a configuração padrão é ON, alterne as setas para cima ou para baixo e altere a configuração para OFF.
   4. Pressione o botão NEXT/ENTER para salvar essa alteração de configuração.
2. Defina Vibrar ao ler para ON.
   1. Siga as etapas 1.1 a 1.2 ou conclua a próxima etapa diretamente após a etapa 1.4.
   2. Usando o botão NEXT/ENTER , role até VIBRATE AO LER. Como a configuração padrão é OFF, alterne as setas para cima e para baixo e altere a configuração para ON para sentir, via vibração, quando a leitura tiver sido concluída, independentemente de poder visualizar a tela.

2. Transponders do programa

NOTA: Cada transponder implantado deve primeiro ser programado com uma identificação animal (identificação do animal ou identificação do transponder). Essa nomenclatura pode ser usada como identificação secundária para o sujeito do teste (por exemplo, quatro dígitos para a abreviação da cepa do rato, localização do transponder e mais três a quatro dígitos para indicar o número do animal). A programação pode ser concluída dias antes da cirurgia, mantendo os transponders estéreis antes da cirurgia.

1. Insira o código de identificação no transponder.
   1. Aplique uma bobina de reforço na cabeça do leitor - um acessório específico para o modelo DAS 8027-IUS, que ajuda no procedimento de programação.
   2. Usando uma mão enluvada, coloque o transponder (dentro do aplicador) na bobina de reforço.
   3. Ligue o dispositivo pressionando o botão SCAN e aguarde até que a tela OLED se acenda. Mantenha pressionado o botão VOLTAR/MENU para acessar a tela do menu .
   4. Usando o botão NEXT/ENTER , role pelas opções até WRITE TRANSPONDER ID. Aqui, alterne as setas para cima ou para baixo para transformar SIM.
   5. Usando o botão NEXT/ENTER , alterne para ENTER ID CODE.
   6. Use as teclas de seta para cima e para baixo para percorrer números e letras. Pressione NEXT/ENTER após cada seleção de caractere para ir para o caractere a seguir.
   7. Quando o código de ID estiver concluído, pressione SCAN para gravar o transponder.
   8. Remova o transponder da bobina de reforço e repita conforme necessário. Verifique se o transponder lê as mudanças de temperatura aquecendo os transponders fechados entre as mãos enluvadas e medindo usando o scanner de temperatura.
      NOTA: AS CONFIGURAÇÕES DE GRAVAÇÃO AUTOMÁTICA MÚLTIPLA e CONTAGEM SEQUENCIAL podem ser definidas como ON para permitir a programação de transponder múltiplo ou sequencial durante uma sessão. Cada transponder deve ser testado durante a programação.

3. Prepare "bolas de gaiola em casa"

1. Coloque 5 cm x 5 cm inodoro/toalha de controle em uma bola de chá.
2. Coloque essas bolas de gaiola domésticas em novas gaiolas domésticas após a cirurgia para começar a habituar o animal ao método em que os estímulos contextuais serão apresentados durante o teste. Substitua essas bolas de gaiola domésticas a cada 2 semanas.

4. Cirurgia e cuidados pós-operatórios

1. Pesar e registrar o peso corporal pré-cirúrgico dos sujeitos. Usando uma câmara de indução, forneça anestesia (por exemplo, isoflurano a 2-5%) ao animal.
2. Usando cortadores elétricos, raspe completamente o membro traseiro. Administrar analgesia (por exemplo, 5 mg/kg de cetoprofeno, s.c.) em conformidade com as diretrizes institucionais.
   NOTA: Analgesia adicional pode ser necessária se este procedimento for combinado com outros métodos cirúrgicos.
3. Limpe a área com álcool a 70% (ou toalhete de álcool estéril comercialmente disponível) e lavagem com iodopovidona (ou cotonetes de betadina estéreis e embalados individualmente disponíveis comercialmente) alternando pelo menos três vezes, terminando com iodopovidona.
4. Devolva o animal à câmara de indução e anestesiar o animal para níveis cirúrgicos. Em seguida, configure o rato com uma máscara facial para exposição contínua à anestesia. Aplique pomada oftálmica de neomicina nos olhos do animal para evitar a secura durante a anestesia.
   NOTA: O procedimento não deve começar até que o rato não mostre evidência de recepção da dor (ou seja, reflexo corneano, resposta de pinça da cauda, reflexo da pinça do dedo do pé).
5. Usando apenas uma tesoura cirúrgica, faça um corte raso através da pele no membro posterior direito.
6. Movendo-se paralelamente ao gastrocnêmio, coloque a borda afiada de um transponder estéril pré-programado e sem tampa na incisão. Certifique-se de que o êmbolo verde está virado para cima e visível. Continue empurrando o aplicador de transponder para a incisão até que a abertura do aplicador de transponder não seja mais visível.
   NOTA: Não pressione acidentalmente o êmbolo verde no aplicador do transponder durante a etapa 4.6. A descarga prematura do transponder levará à colocação inadequada.
7. Gire o aplicador em 180°, resultando no êmbolo verde voltado para baixo em direção ao membro do rato, não mais visível para o experimentador. Empurre o aplicador do transponder para o local final. Uma vez em posicionamento ideal, adjacente ou parcialmente fechado no gastrocnêmio, empurre o êmbolo verde, permitindo que a pressão do aplicador guie a mão do investigador para longe do rato.
8. Usando fórceps, mantenha unida a pele aberta e coloque um clipe de ferida com um autoclipe estéril ou sutura estéril. Se necessário, use suturas absorvíveis antes do autoclipe estéril para fechar a camada da fáscia. Usando o leitor de transponder, verifique a temperatura do músculo do rato.
9. Remova o rato da anestesia e coloque-o numa gaiola caseira limpa colocada em cima de uma almofada de aquecimento que circula água ajustada para baixo para recuperação. Certifique-se de que a gaiola em casa inclua uma bola de chá com uma toalha inodora para começar a habituação.
   NOTA: O rato deve acordar da cirurgia dentro de 15 minutos. Os alimentos podem ser colocados no fundo da gaiola para facilitar o acesso durante os dias de recuperação.
10. Cuidados pós-operatórios
    1. Registre os pesos e as temperaturas dos ratos diariamente usando um leitor de transponder por pelo menos 2 dias após a cirurgia ou até que os ratos recuperem ou estabilizem o peso corporal.
    2. Administrar analgesia não narcótica (por exemplo, 5 mg/kg de cetoprofeno, s.c.) uma vez ao dia aos camundongos por pelo menos 2 dias após a cirurgia, com doses adicionais fornecidas conforme necessário.
       NOTA: Ratos e camundongos devem se recuperar totalmente dentro de 5-8 dias após a cirurgia e podem ser submetidos a procedimentos de habituação e teste.

5. Preparação do teste - gaiola em casa

1. Construção de risers
   NOTA: A etapa abaixo é baseada em gaiolas com tampo de filtro de mouse de 194 mm x 181 mm x 398 mm. Para caber gaiolas maiores (por exemplo, uma gaiola caseira de ratos), a largura precisará ser ajustada.
   1. Corte o tubo de PVC com um cortador de PVC de catraca em oito seções e monte a seguir a Figura 1C. Isso dará uma estrutura de mesa aberta que pode conter aproximadamente quatro gaiolas. Faça o número desejado de risers.
2. Configuração do quarto
   1. Atribua um local a cada riser dentro da sala de testes. Separe os risers configurados para receber diferentes estímulos contextuais (ou seja, odores) por um mínimo de 2 m para evitar variáveis de confusão.
      NOTA: Cada rato deve ter um local de ensaio atribuído dentro da sala de ensaio e nos risers físicos, tanto quanto possível, para evitar o desenvolvimento de associações entre diferentes locais e estímulos termogénicos.
   2. Usando tiras magnéticas, prenda folhas cirúrgicas ou batas através dos risers, criando uma barreira visual entre o pesquisador e os sujeitos do teste. Defina essa barreira para minimizar as mudanças de temperatura resultantes da atividade do mouse ao visualizar os experimentadores se movendo em direção à gaiola ou ao redor da sala de testes.
   3. (Opcional) Coloque espelhos na superfície abaixo dos risers para facilitar a visualização do fundo da gaiola durante o teste.
      NOTA: Os risers podem ser higienizados através de um sistema de lavagem de gaiolas. Panos ou lençóis cirúrgicos devem ser lavados antes da habituação e do teste.
3. Preparação da bola de chá
   1. Prepare bolas de chá com controle e toalhas PO (aproximadamente 5 cm x 5 cm). Para evitar a contaminação cruzada, prepare bolas de chá de odor de controle primeiro.
      NOTA: As toalhas com odor de predador devem ser testadas antes do uso. Essas toalhas também devem ser contidas, e os materiais que interagem com elas devem ser imediatamente higienizados (ou seja, lavagem da gaiola), evitando a exposição do odor a outros animais.

6. Teste de temperatura - gaiola em casa

NOTA: Os animais precisam estar habituados a todo o procedimento de teste, excluindo estímulos contextuais ou farmacológicos experimentais. Isso deve ser concluído um mínimo de 4x antes do teste.

1. Transferir os animais para a sala de testes preparada. Coloque os animais em um local pré-designado no riser. Este local deve ser o mesmo em todos os procedimentos de habituação e teste.
2. Remova a "bola da gaiola doméstica" da gaiola doméstica do rato e volte a cobrir as gaiolas com um pano ou lençol cirúrgico. Permita que os ratos se acostumem ao espaço de teste por 1-2 h.
3. Após a conclusão da aclimatação, use o scanner para medir e registrar a temperatura de linha de base de cada indivíduo. Evite manipular os revestimentos de pano durante as medições.
   NOTA: Agentes farmacológicos podem ser aplicados aqui. O tempo de espera pós-injeção ou aplicação pode ser adicionado conforme necessário antes do teste. Recomenda-se o registro de uma linha de base secundária diretamente antes do teste após a adição de um agente farmacológico para monitorar a resposta a estímulos farmacológicos. Se a resposta ao odor não estiver sendo testada, as medições de temperatura dos camundongos podem começar diretamente após a injeção. A randomização deve ser empregada ao fornecer qualquer estímulo.
4. Descubra a gaiola e coloque a bola de chá (controle ou PO) no chão da gaiola doméstica. Substitua a tampa da gaiola e a cobertura do pano.
5. Inicie o cronômetro. Meça as temperaturas dos sujeitos do teste na mesma ordem de colocação da bola de chá. Registre as temperaturas e o tempo do relógio das medições seguindo os pontos de tempo desejados.
6. Quando o experimento estiver completo, remova a bola de tratamento. Coloque os ratos que receberam PO em uma nova gaiola doméstica com a "bola da gaiola doméstica" original. Devolva a "bola da gaiola em casa" para a gaiola dos ratos que receberam odor de controle. Transfira os ratos para o local de alojamento.
   NOTA: O procedimento acima pode ser traduzido para modelos de ratos dentro de gaiolas de tamanho apropriado. Ajustes nas medidas sugeridas na Figura 1C podem ser necessários para permitir um melhor acesso ao fundo da gaiola doméstica.

Figura 1: Transponders e teste de temperatura de gaiola doméstica . (A) Diagrama de colocação unilateral de transponder para testar a temperatura em um gastrocnêmio de camundongo. Uma vez programado e colocado, o leitor de transponder (DAS-8027-IUS, mostrado) pode ser usado para medir a temperatura. (B) Esquerda, foto de uma bola de chá de aço inoxidável de malha aberta e uma toalha de 5 cm x 5 cm. À direita, bola de chá fechada, usada para segurar toalhas de habituação e odor em testes de gaiola em casa. (C) Esquema de risers construídos com tubulação de PVC para testes de gaiolas domésticas. (D) Fluxo de trabalho do protocolo de teste de gaiolas domésticas. (E) Imagens de instalações da área de teste de gaiolas domésticas. À esquerda, quatro gaiolas de rato em cima de um riser. Tiras magnéticas estão localizadas na parede adjacente, e ímãs e pano cirúrgico estão na mesa. À direita, gaiolas de rato cobertas em risers. (A), (C) e (D) foram criados com Biorender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Teste de temperatura - caminhada em esteira

1. Atribua a cada animal uma esteira como local designado para procedimentos de habituação e teste.
2. Prepare as esteiras para testes, garantindo que os amortecedores estejam funcionais.
   NOTA: Para a caminhada em esteira, as esteiras devem ser ajustadas no ritmo mais baixo disponível que promova o movimento contínuo, mas não corra para habituação e teste. Para a Esteira Metabólica Modular Fechada 1012M-2, isso é de 5,2 m/min para camundongos e 7 m/min para ratos. Esse ritmo pode precisar ser ajustado com base na obesidade do sujeito. Os choques devem ser ajustados para uma intensidade e taxa de repetição de 5,0.
3. Habituation
   1. Mova os ratos para a sala de testes. Permita que os ratos 1-2 h se acostumem à transferência de quarto em suas gaiolas domésticas.
   2. Após a aclimatação, guie os ratos até a abertura de sua esteira designada e feche a esteira. Ligue o cinto, o amortecedor e o cronômetro.
   3. Permita que os ratos andem nas esteiras por 15 minutos, usando estímulo de choque como motivação para o movimento. Interromper o ensaio imediatamente se um animal permanecer num choque ativo durante um período prolongado.
   4. Após o teste, remova os ratos e devolva-os às gaiolas domésticas.
   5. Limpe as esteiras usando detergente líquido e água.
4. Teste
   1. Mova os ratos para a sala de testes. Permita que os ratos 1-2 h se acostumem à transferência de quarto em suas gaiolas domésticas.
   2. Meça e registre a temperatura de linha de base antes de mover o mouse para a esteira.
      NOTA: Para testes que incluam agentes farmacológicos, aplique-os ou injete-os aqui, seguindo o esquema mostrado na Figura 2A. O tempo de espera após a injeção pode ser adicionado conforme necessário antes que os ratos sejam colocados na esteira. A randomização deve ser empregada ao fornecer qualquer estímulo.
   3. Coloque 5 cm x 5 cm quadrados de toalhas de controle ou PO dentro da esteira mais próxima da frente da esteira. Adere as toalhas ao teto da esteira ou por baixo para facilitar a colocação e a remoção.
   4. Guie os ratos para a esteira designada. Ligue a correia da esteira e o amortecedor.
   5. Ligue o cronômetro. Faça medições dos sujeitos do teste na mesma ordem em que os ratos foram montados nas esteiras. Registre as temperaturas e o tempo do relógio das medições seguindo os pontos de tempo desejados.
      NOTA: A temperatura pode ser medida de forma confiável do lado de fora da esteira enquanto um rato está dentro de uma esteira fechada durante a atividade de caminhada. Para ratos, as limitações de tamanho da esteira e distância do transponder-leitor podem exigir que um experimentador mantenha a parte de trás da esteira aberta para inserir o leitor dentro da esteira, mais perto do assunto.
   6. Quando o teste estiver concluído, desligue os amortecedores e esteiras; devolva os ratos às gaiolas de origem. Transfira os ratos para o local de alojamento.
   7. Limpe as esteiras usando detergente líquido e água, prestando atenção específica para remover qualquer PO residual.
   8. Quando os experimentos estiverem completos, eutanasie os animais (por exemplo, usando inalação de CO₂ ) e confirme visualmente a localização do transponder.

Figura 2: Teste de temperatura controlada por atividade. (A) Fluxo de trabalho de teste de temperatura controlada por atividade com um agente farmacológico usando caminhada em esteira. (B) Imagens de instalações de esteiras. À esquerda, uma imagem da configuração completa do equipamento. À direita, uma imagem mais próxima de esteiras individuais e choques. (A) foi criado com Biorender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Transponders foram implantados unilateralmente no gastrocnêmio direito de dez camundongos de 4-6 meses de idade, do tipo selvagem (WT), criados a partir da cepa SF1-Cre (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, Cepa #012462, C57BL/6J e fundos FVB; fêmea N = 5; macho N = 5). Após a recuperação, os ratos foram habituados a um procedimento de teste de temperatura da gaiola domiciliar que não incluía um estímulo contextual (por exemplo, PO). As medições de temperatura usando uma varinha de transponder foram registradas dentro de sua sala de alojamento e após a transferência para o local de teste. Os ratos receberam 1-2 h para se aclimatarem à sala de testes e ao local. Ao término da aclimatação, foram registradas medidas basais e consecutivas de 1 h para cada rato. Este procedimento foi concluído quatro vezes.

No geral, não foram observadas diferenças entre os sexos. As temperaturas musculares aumentaram significativamente depois que os ratos foram movidos para a sala de teste, depois diminuíram pela medição de linha de base após 60 minutos gastos no contexto do teste. A análise de sexo combinado do ensaio 4 não mostrou diferença significativa entre as medidas de temperatura "antes do movimento" e "linha de base" (teste t bicaudal, pareado > 0,10), mostrando a eficácia da aclimatação de 1 h ao contexto do teste. Além disso, a comparação estatística das temperaturas na linha de base e 60 min mostrou uma diminuição significativa na temperatura (teste t bicaudal, pareado < 0,01), fornecendo evidências de que os camundongos se habituaram ao movimento do investigador durante a medição. No entanto, as fêmeas (mas não os machos) apresentaram respostas incrementais onde a temperatura medida de 5 min a 15 min foi menor com sucessivos ensaios de habituação (Figura 3). Ao observar os efeitos agudos do movimento ou aumento da temperatura após a linha de base, os ratos tendem a responder menos ao transporte para a sala de testes ao longo de sucessivos ensaios de habituação (Arquivo Suplementar 1, análise do estudo).

Camundongos WT adultos habituados descritos acima foram testados com Oxt, um agente farmacológico. Os ratos receberam injeções intraperitoneais (i.p., 2 mg/kg) de Oxt ou veículo (solução salina estéril) em uma ordem aleatória, e as temperaturas musculares foram medidas antes do movimento para a sala de teste e após 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 min de injeção. Cada rato recebeu os dois tratamentos. Uma análise de variância de medidas repetidas (ANOVA) revelou efeitos principais significativos do Oxt e do tempo, onde o Oxt diminuiu a temperatura muscular em relação ao veículo. O Oxt diminuiu a temperatura muscular em relação à linha de base tão rapidamente quanto 5 min após a injeção, com uma diminuição máxima observada 30 min após a injeção (Figura 4). As temperaturas musculares foram normalizadas em 60 min após a injeção de Oxt (teste t bicaudal, pareado > 0,10).

Ratos Sprague-Dawley machos adultos (N = 4, idade ~ 6 meses) implantados bilateralmente com transponders no gastrocnêmio foram habituados e, em seguida, testados em um ambiente de gaiola domiciliar com um estímulo PO (odor de furão). As medidas basais foram registradas, e cada rato foi presenteado com PO na forma de uma toalha. O odor foi então removido após 10 min de exposição; medidas consecutivas foram realizadas antes e após a retirada do estímulo. Esses dados preliminares (Figura 5) sugerem que o PO tem um impacto contínuo na termogênese do músculo esquelético após a remoção do estímulo.

Dados publicados anteriormente avaliaram a ativação da ameaça predadora da termogênese do músculo esquelético em ratos Sprague-Dawley machos adultos (idade ~ 6 meses)8. Ratos com transponders gastrocnêmios bilaterais implantados apresentaram odor predador (furão). As medidas foram realizadas em ambiente de gaiola domiciliar (N = 8, Figura 6A). Esses dados revelaram um aumento robusto na temperatura em comparação com os odores de controle. Para analisar as respostas termogênicas aversivas ou estressantes ao odor de furão, ratos machos (N = 7, Figura 6B) foram apresentados com um odor aversivo (ácido butírico), um novo odor (2-metilbenzoxazol) ou um odor de raposa, ou contidos por 1 minuto antes do teste (estresse moderado). As medidas foram realizadas em gaiola domiciliar durante um período de 2 h. A análise desses dados mostrou que o odor de furão produz e mantém uma forte mudança na termogênese em comparação com todas as outras condições. Juntos, esses dados fornecem evidências da influência mínima e transitória do odor de controle na termogênese do músculo esquelético.

Figura 3: Análise da temperatura muscular durante a habituação para teste de temperatura da gaiola domiciliar. Camundongos implantados unilateralmente com transponders no gastrocnêmio direito estavam habituados ao procedimento de teste. Os camundongos foram medidos na sala de alojamento de animais, "Before Move", na sala de testes, "After Move", após aclimatação por 1-2 h, "Baseline", em seguida, consecutivamente acima de 1 h. Todas as comparações estatísticas apresentadas foram feitas entre o ensaio 1 e o ensaio 4, * p < 0,05, ** p < 0,01 (teste t, N = 10); † p < 0,05, †† p < 0,01, ‡ p < 0,001 ensaio de efeito principal (ANOVA, N [ensaios] = 4). As barras de erro mostradas exibem o erro padrão da média (MEV). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Temperatura muscular durante a estimulação farmacológica da ocitocina em camundongos. Camundongos habituados, implantados unilateralmente com transponders, receberam 2 mg/kg (i.p.) de ocitocina ou veículo (solução salina estéril). Reduções significativas na temperatura muscular foram observadas aos 5 min após a injeção de ocitocina e normalizadas em 60 min, ** p < 0,01, *** p < 0,001 (teste t pareado bicaudal, N = 9). As barras de erro mostradas exibem o erro padrão da média. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Termogênese predador-odor no teste de temperatura de gaiola domiciliar de ratos. Medidas de temperatura em ratos com transponders implantados bilateralmente no gastrocnêmio após exposição ao odor de predador (furão) por 10 min. Após exposição por 10 min, as toalhas contendo o estímulo foram retiradas, conforme indicado pela seta. Os ratos mantiveram o aumento da temperatura 20 min após a remoção do estímulo. Significativamente maior que a temperatura basal, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 (teste t, N = 4). As barras de erro mostradas exibem o erro padrão da média. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: O odor de furão induz um rápido aumento da temperatura muscular em comparação com o controle. (A) A temperatura do gastrocnêmio foi significativamente elevada após o odor de predador (furão) em comparação com a exposição controle em ratos machos (teste t pareado bicaudal, N = 8). (B) Odores novos, aversivos ou de raposa não alteraram significativamente a temperatura muscular em comparação com o controle. A mudança de temperatura induzida pelo estresse moderado diminuiu rapidamente após 5 min. O odor de furão manteve uma resposta robusta, em comparação com outras condições, durante todo o teste (ANOVA, N = 7). † p < 0,05, odor de furão > todas as outras condições; * p < 0,025, comparação pontual entre odor de furão e estresse moderado vs. odor controle. Essa figura foi modificada com a permissão de Gorrell et al.8. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Marcação R para análise de habituação da Figura 3 . O arquivo Markdown para análise de habituação com código R mostra exemplos de métodos de codificação e maneiras pelas quais o sexo pode ser investigado dentro dos dados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.