Name: Medindo a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a medir a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos usando transponders de temperatura remotos. Este método minimiza o distúrbio aos animais e permite testes simultâneos de múltiplos indivíduos.

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Este trabalho é suportado pelo R15 DK097644 e R15 DK108668. Agradecemos ao Dr. Chaitanya K Gavini e à Dra. Megan Rich por contribuições anteriores e ao Dr. Stanley Dannemiller por garantir nossa conformidade com as diretrizes institucionais de uso de animais. Um agradecimento especial ao Dr. Tim Bartness por fornecer a pesquisa fundamental necessária para construir este método e seus estudos associados. As Figuras 1A, C, D e Figura 2A foram criadas por meio de Biorender.com.

Esses métodos podem ser aplicados a modelos de ratos e camundongos e foram realizados com aprovação institucional (Kent State University, IACUC Approval #359 e #340 CN 12-04). Antes da implementação do protocolo, os animais devem ser alojados em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Preparando o leitor de transponder
NOTA: Antes do uso, o leitor de transponder deve ser definido; as etapas a seguir incluem apenas as alterações de configuração necessárias para este estudo. Esta parte do protocolo está diretamente associada aos leitores portáteis DAS-8027-IUS; outros modelos de leitores devem seguir as instruções fornecidas pelo manual para obter resultados de programação.
<ol><li>Defina Bipe de áudio como DESATIVADO.<ol><li>Ligue o dispositivo pressionando o botão SCAN e aguarde até que a iluminação apareça na tela OLED. Mantenha pressionado o botão VOLTAR/MENU para acessar a tela do menu .</li>
		<li>Usando o botão NEXT/ENTER , percorra as opções até OPERATIONAL SETUP. Aqui, alterne as setas para cima ou para baixo para ativar SIM e abra o submenu operacional.</li>
		<li>Usando o botão NEXT/ENTER , role até AUDIO BEEP. Como a configuração padrão é ON, alterne as setas para cima ou para baixo e altere a configuração para OFF.</li>
		<li>Pressione o botão NEXT/ENTER para salvar essa alteração de configuração.</li>
	</ol></li>
	<li>Defina Vibrar ao ler para ON.<ol><li>Siga as etapas 1.1 a 1.2 ou conclua a próxima etapa diretamente após a etapa 1.4.</li>
		<li>Usando o botão NEXT/ENTER , role até VIBRATE AO LER. Como a configuração padrão é OFF, alterne as setas para cima e para baixo e altere a configuração para ON para sentir, via vibração, quando a leitura tiver sido concluída, independentemente de poder visualizar a tela.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transponders do programa
NOTA: Cada transponder implantado deve primeiro ser programado com uma identificação animal (identificação do animal ou identificação do transponder). Essa nomenclatura pode ser usada como identificação secundária para o sujeito do teste (por exemplo, quatro dígitos para a abreviação da cepa do rato, localização do transponder e mais três a quatro dígitos para indicar o número do animal). A programação pode ser concluída dias antes da cirurgia, mantendo os transponders estéreis antes da cirurgia.
<ol><li>Insira o código de identificação no transponder.<ol><li>Aplique uma bobina de reforço na cabeça do leitor - um acessório específico para o modelo DAS 8027-IUS, que ajuda no procedimento de programação.</li>
		<li>Usando uma mão enluvada, coloque o transponder (dentro do aplicador) na bobina de reforço.</li>
		<li>Ligue o dispositivo pressionando o botão SCAN e aguarde até que a tela OLED se acenda. Mantenha pressionado o botão VOLTAR/MENU para acessar a tela do menu .</li>
		<li>Usando o botão NEXT/ENTER , role pelas opções até WRITE TRANSPONDER ID. Aqui, alterne as setas para cima ou para baixo para transformar SIM.</li>
		<li>Usando o botão NEXT/ENTER , alterne para ENTER ID CODE.</li>
		<li>Use as teclas de seta para cima e para baixo para percorrer números e letras. Pressione NEXT/ENTER após cada seleção de caractere para ir para o caractere a seguir.</li>
		<li>Quando o código de ID estiver concluído, pressione SCAN para gravar o transponder.</li>
		<li>Remova o transponder da bobina de reforço e repita conforme necessário. Verifique se o transponder lê as mudanças de temperatura aquecendo os transponders fechados entre as mãos enluvadas e medindo usando o scanner de temperatura. NOTA: AS CONFIGURAÇÕES DE GRAVAÇÃO AUTOMÁTICA MÚLTIPLA e CONTAGEM SEQUENCIAL podem ser definidas como ON para permitir a programação de transponder múltiplo ou sequencial durante uma sessão. Cada transponder deve ser testado durante a programação.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Prepare "bolas de gaiola em casa"
<ol><li>Coloque 5 cm x 5 cm inodoro/toalha de controle em uma bola de chá.</li>
	<li>Coloque essas bolas de gaiola domésticas em novas gaiolas domésticas após a cirurgia para começar a habituar o animal ao método em que os estímulos contextuais serão apresentados durante o teste. Substitua essas bolas de gaiola domésticas a cada 2 semanas.</li>
</ol>4. Cirurgia e cuidados pós-operatórios
<ol><li>Pesar e registrar o peso corporal pré-cirúrgico dos sujeitos. Usando uma câmara de indução, forneça anestesia (por exemplo, isoflurano a 2-5%) ao animal.</li>
	<li>Usando cortadores elétricos, raspe completamente o membro traseiro. Administrar analgesia (por exemplo, 5 mg/kg de cetoprofeno, s.c.) em conformidade com as diretrizes institucionais. NOTA: Analgesia adicional pode ser necessária se este procedimento for combinado com outros métodos cirúrgicos.</li>
	<li>Limpe a área com álcool a 70% (ou toalhete de álcool estéril comercialmente disponível) e lavagem com iodopovidona (ou cotonetes de betadina estéreis e embalados individualmente disponíveis comercialmente) alternando pelo menos três vezes, terminando com iodopovidona.</li>
	<li>Devolva o animal à câmara de indução e anestesiar o animal para níveis cirúrgicos. Em seguida, configure o rato com uma máscara facial para exposição contínua à anestesia. Aplique pomada oftálmica de neomicina nos olhos do animal para evitar a secura durante a anestesia. NOTA: O procedimento não deve começar até que o rato não mostre evidência de recepção da dor (ou seja, reflexo corneano, resposta de pinça da cauda, reflexo da pinça do dedo do pé).</li>
	<li>Usando apenas uma tesoura cirúrgica, faça um corte raso através da pele no membro posterior direito.</li>
	<li>Movendo-se paralelamente ao gastrocnêmio, coloque a borda afiada de um transponder estéril pré-programado e sem tampa na incisão. Certifique-se de que o êmbolo verde está virado para cima e visível. Continue empurrando o aplicador de transponder para a incisão até que a abertura do aplicador de transponder não seja mais visível. NOTA: Não pressione acidentalmente o êmbolo verde no aplicador do transponder durante a etapa 4.6. A descarga prematura do transponder levará à colocação inadequada.</li>
	<li>Gire o aplicador em 180°, resultando no êmbolo verde voltado para baixo em direção ao membro do rato, não mais visível para o experimentador. Empurre o aplicador do transponder para o local final. Uma vez em posicionamento ideal, adjacente ou parcialmente fechado no gastrocnêmio, empurre o êmbolo verde, permitindo que a pressão do aplicador guie a mão do investigador para longe do rato.</li>
	<li>Usando fórceps, mantenha unida a pele aberta e coloque um clipe de ferida com um autoclipe estéril ou sutura estéril. Se necessário, use suturas absorvíveis antes do autoclipe estéril para fechar a camada da fáscia. Usando o leitor de transponder, verifique a temperatura do músculo do rato.</li>
	<li>Remova o rato da anestesia e coloque-o numa gaiola caseira limpa colocada em cima de uma almofada de aquecimento que circula água ajustada para baixo para recuperação. Certifique-se de que a gaiola em casa inclua uma bola de chá com uma toalha inodora para começar a habituação. NOTA: O rato deve acordar da cirurgia dentro de 15 minutos. Os alimentos podem ser colocados no fundo da gaiola para facilitar o acesso durante os dias de recuperação.</li>
	<li>Cuidados pós-operatórios<ol><li>Registre os pesos e as temperaturas dos ratos diariamente usando um leitor de transponder por pelo menos 2 dias após a cirurgia ou até que os ratos recuperem ou estabilizem o peso corporal.</li>
		<li>Administrar analgesia não narcótica (por exemplo, 5 mg/kg de cetoprofeno, s.c.) uma vez ao dia aos camundongos por pelo menos 2 dias após a cirurgia, com doses adicionais fornecidas conforme necessário. NOTA: Ratos e camundongos devem se recuperar totalmente dentro de 5-8 dias após a cirurgia e podem ser submetidos a procedimentos de habituação e teste.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Preparação do teste - gaiola em casa
<ol><li>Construção de risers NOTA: A etapa abaixo é baseada em gaiolas com tampo de filtro de mouse de 194 mm x 181 mm x 398 mm. Para caber gaiolas maiores (por exemplo, uma gaiola caseira de ratos), a largura precisará ser ajustada.<ol><li>Corte o tubo de PVC com um cortador de PVC de catraca em oito seções e monte a seguir a Figura 1C. Isso dará uma estrutura de mesa aberta que pode conter aproximadamente quatro gaiolas. Faça o número desejado de risers.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração do quarto<ol><li>Atribua um local a cada riser dentro da sala de testes. Separe os risers configurados para receber diferentes estímulos contextuais (ou seja, odores) por um mínimo de 2 m para evitar variáveis de confusão. NOTA: Cada rato deve ter um local de ensaio atribuído dentro da sala de ensaio e nos risers físicos, tanto quanto possível, para evitar o desenvolvimento de associações entre diferentes locais e estímulos termogénicos.</li>
		<li>Usando tiras magnéticas, prenda folhas cirúrgicas ou batas através dos risers, criando uma barreira visual entre o pesquisador e os sujeitos do teste. Defina essa barreira para minimizar as mudanças de temperatura resultantes da atividade do mouse ao visualizar os experimentadores se movendo em direção à gaiola ou ao redor da sala de testes.</li>
		<li>(Opcional) Coloque espelhos na superfície abaixo dos risers para facilitar a visualização do fundo da gaiola durante o teste. NOTA: Os risers podem ser higienizados através de um sistema de lavagem de gaiolas. Panos ou lençóis cirúrgicos devem ser lavados antes da habituação e do teste.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da bola de chá<ol><li>Prepare bolas de chá com controle e toalhas PO (aproximadamente 5 cm x 5 cm). Para evitar a contaminação cruzada, prepare bolas de chá de odor de controle primeiro. NOTA: As toalhas com odor de predador devem ser testadas antes do uso. Essas toalhas também devem ser contidas, e os materiais que interagem com elas devem ser imediatamente higienizados (ou seja, lavagem da gaiola), evitando a exposição do odor a outros animais.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Teste de temperatura - gaiola em casa
NOTA: Os animais precisam estar habituados a todo o procedimento de teste, excluindo estímulos contextuais ou farmacológicos experimentais. Isso deve ser concluído um mínimo de 4x antes do teste.
<ol><li>Transferir os animais para a sala de testes preparada. Coloque os animais em um local pré-designado no riser. Este local deve ser o mesmo em todos os procedimentos de habituação e teste.</li>
	<li>Remova a "bola da gaiola doméstica" da gaiola doméstica do rato e volte a cobrir as gaiolas com um pano ou lençol cirúrgico. Permita que os ratos se acostumem ao espaço de teste por 1-2 h.</li>
	<li>Após a conclusão da aclimatação, use o scanner para medir e registrar a temperatura de linha de base de cada indivíduo. Evite manipular os revestimentos de pano durante as medições. NOTA: Agentes farmacológicos podem ser aplicados aqui. O tempo de espera pós-injeção ou aplicação pode ser adicionado conforme necessário antes do teste. Recomenda-se o registro de uma linha de base secundária diretamente antes do teste após a adição de um agente farmacológico para monitorar a resposta a estímulos farmacológicos. Se a resposta ao odor não estiver sendo testada, as medições de temperatura dos camundongos podem começar diretamente após a injeção. A randomização deve ser empregada ao fornecer qualquer estímulo.</li>
	<li>Descubra a gaiola e coloque a bola de chá (controle ou PO) no chão da gaiola doméstica. Substitua a tampa da gaiola e a cobertura do pano.</li>
	<li>Inicie o cronômetro. Meça as temperaturas dos sujeitos do teste na mesma ordem de colocação da bola de chá. Registre as temperaturas e o tempo do relógio das medições seguindo os pontos de tempo desejados.</li>
	<li>Quando o experimento estiver completo, remova a bola de tratamento. Coloque os ratos que receberam PO em uma nova gaiola doméstica com a "bola da gaiola doméstica" original. Devolva a "bola da gaiola em casa" para a gaiola dos ratos que receberam odor de controle. Transfira os ratos para o local de alojamento. NOTA: O procedimento acima pode ser traduzido para modelos de ratos dentro de gaiolas de tamanho apropriado. Ajustes nas medidas sugeridas na Figura 1C podem ser necessários para permitir um melhor acesso ao fundo da gaiola doméstica.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64264/64264fig01.jpg"> Figura 1: Transponders e teste de temperatura de gaiola doméstica . (A) Diagrama de colocação unilateral de transponder para testar a temperatura em um gastrocnêmio de camundongo. Uma vez programado e colocado, o leitor de transponder (DAS-8027-IUS, mostrado) pode ser usado para medir a temperatura. (B) Esquerda, foto de uma bola de chá de aço inoxidável de malha aberta e uma toalha de 5 cm x 5 cm. À direita, bola de chá fechada, usada para segurar toalhas de habituação e odor em testes de gaiola em casa. (C) Esquema de risers construídos com tubulação de PVC para testes de gaiolas domésticas. (D) Fluxo de trabalho do protocolo de teste de gaiolas domésticas. (E) Imagens de instalações da área de teste de gaiolas domésticas. À esquerda, quatro gaiolas de rato em cima de um riser. Tiras magnéticas estão localizadas na parede adjacente, e ímãs e pano cirúrgico estão na mesa. À direita, gaiolas de rato cobertas em risers. (A), (C) e (D) foram criados com Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64264/64264fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
7. Teste de temperatura - caminhada em esteira
<ol><li>Atribua a cada animal uma esteira como local designado para procedimentos de habituação e teste.</li>
	<li>Prepare as esteiras para testes, garantindo que os amortecedores estejam funcionais. NOTA: Para a caminhada em esteira, as esteiras devem ser ajustadas no ritmo mais baixo disponível que promova o movimento contínuo, mas não corra para habituação e teste. Para a Esteira Metabólica Modular Fechada 1012M-2, isso é de 5,2 m/min para camundongos e 7 m/min para ratos. Esse ritmo pode precisar ser ajustado com base na obesidade do sujeito. Os choques devem ser ajustados para uma intensidade e taxa de repetição de 5,0.</li>
	<li>Habituation<ol><li>Mova os ratos para a sala de testes. Permita que os ratos 1-2 h se acostumem à transferência de quarto em suas gaiolas domésticas.</li>
		<li>Após a aclimatação, guie os ratos até a abertura de sua esteira designada e feche a esteira. Ligue o cinto, o amortecedor e o cronômetro.</li>
		<li>Permita que os ratos andem nas esteiras por 15 minutos, usando estímulo de choque como motivação para o movimento. Interromper o ensaio imediatamente se um animal permanecer num choque ativo durante um período prolongado.</li>
		<li>Após o teste, remova os ratos e devolva-os às gaiolas domésticas.</li>
		<li>Limpe as esteiras usando detergente líquido e água.</li>
	</ol></li>
	<li>Teste<ol><li>Mova os ratos para a sala de testes. Permita que os ratos 1-2 h se acostumem à transferência de quarto em suas gaiolas domésticas.</li>
		<li>Meça e registre a temperatura de linha de base antes de mover o mouse para a esteira. NOTA: Para testes que incluam agentes farmacológicos, aplique-os ou injete-os aqui, seguindo o esquema mostrado na Figura 2A. O tempo de espera após a injeção pode ser adicionado conforme necessário antes que os ratos sejam colocados na esteira. A randomização deve ser empregada ao fornecer qualquer estímulo.</li>
		<li>Coloque 5 cm x 5 cm quadrados de toalhas de controle ou PO dentro da esteira mais próxima da frente da esteira. Adere as toalhas ao teto da esteira ou por baixo para facilitar a colocação e a remoção.</li>
		<li>Guie os ratos para a esteira designada. Ligue a correia da esteira e o amortecedor.</li>
		<li>Ligue o cronômetro. Faça medições dos sujeitos do teste na mesma ordem em que os ratos foram montados nas esteiras. Registre as temperaturas e o tempo do relógio das medições seguindo os pontos de tempo desejados. NOTA: A temperatura pode ser medida de forma confiável do lado de fora da esteira enquanto um rato está dentro de uma esteira fechada durante a atividade de caminhada. Para ratos, as limitações de tamanho da esteira e distância do transponder-leitor podem exigir que um experimentador mantenha a parte de trás da esteira aberta para inserir o leitor dentro da esteira, mais perto do assunto.</li>
		<li>Quando o teste estiver concluído, desligue os amortecedores e esteiras; devolva os ratos às gaiolas de origem. Transfira os ratos para o local de alojamento.</li>
		<li>Limpe as esteiras usando detergente líquido e água, prestando atenção específica para remover qualquer PO residual.</li>
		<li>Quando os experimentos estiverem completos, eutanasie os animais (por exemplo, usando inalação de CO2 ) e confirme visualmente a localização do transponder.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64264/64264fig02.jpg"> Figura 2: Teste de temperatura controlada por atividade. (A) Fluxo de trabalho de teste de temperatura controlada por atividade com um agente farmacológico usando caminhada em esteira. (B) Imagens de instalações de esteiras. À esquerda, uma imagem da configuração completa do equipamento. À direita, uma imagem mais próxima de esteiras individuais e choques. (A) foi criado com Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64264/64264fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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<li>Kasahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oxytocin+receptor+expressed+in+the+rostral+medullary+raphe+in+thermoregulation+during+cold+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Role of the oxytocin receptor expressed in the rostral medullary raphe in thermoregulation during cold conditions.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 180(2015).</li>
<li>Yuan, J., Zhang, R., Wu, R., Gu, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+oxytocin+to+rectify+metabolic+dysfunction+in+obese+mice+are+associated+with+increased+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The effects of oxytocin to rectify metabolic dysfunction in obese mice are associated with increased thermogenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 514, 110903(2020).</li>
<li>Scholl, J. L., Afzal, A., Fox, L. C., Watt, M. J., Forster, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+anxiety-like+behaviors+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Sex differences in anxiety-like behaviors in rats.</a> Physiology & Behavior. 211, 112670(2019).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Este protocolo de teste de temperatura fornece ao campo uma avenida para medir diretamente a termogênese do músculo esquelético. Isso é crítico à medida que a pesquisa se aprofunda na identificação dos mecanismos subjacentes à termogênese muscular33. O método fornece dois protocolos custo-efetivos para medir a termogênese do músculo esquelético sob condições contextuais e farmacológicas. Este protocolo enfatiza a importância da habituação e da aclimatação dentro desses procedimentos. A habituação ...

Dentro da pesquisa metabólica, o exame da termogênese do músculo esquelético é uma nova avenida promissora para sondar a homeostase do peso corporal. A literatura publicada apoia a ideia de que as respostas termogênicas de um dos maiores sistemas de órgãos do corpo – o músculo esquelético – fornecem uma avenida para o aumento do gasto energético e outros efeitos metabólicos, reequilibrando efetivamente os sistemas dentro de doenças como a obesidade 1,2,3. Se o músculo pode ser considerado um órgão termogênico, os estudos devem utilizar uma metodologia prática para estudar as mudanças termogênicas dentro deste órgão. O desejo de compreender o impacto endotérmico dos músculos esqueléticos e a utilidade dessa metodologia para o estudo da termogênese muscular sem tremores não são específicos dos estudos metabólicos. Disciplinas como evolução4, fisiologia comparativa5 e ecofisiologia 6,7 têm demonstrado interesse em compreender as maneiras pelas quais a termogênese muscular pode contribuir para a endotermia e como esse mecanismo se adapta ao ambiente. O protocolo apresentado fornece os métodos críticos necessários para abordar essas questões.
O método fornecido pode ser utilizado na avaliação da modulação da temperatura muscular por estímulos contextuais e farmacológicos, incluindo a técnica única de fornecer odor de predador (PO) para mudar o contexto para replicar a ameaça do predador. Relatos prévios demonstraram a capacidade do PO de induzir rapidamente um aumento considerável na termogênese muscular8. Além disso, os estímulos farmacológicos também podem alterar a temperatura muscular. Isso foi demonstrado no contexto da termogênese muscular induzida por PO, onde o bloqueio farmacológico dos receptores β-adrenérgicos periféricos, utilizando nadolol, inibiu a capacidade do PO de induzir termogênese muscular sem afetar significativamente a termogênese contrátil durante a caminhada em esteira8. A administração central de agonistas do receptor de melanocortina em ratos também tem sido utilizada para discernir mecanismos cerebrais que alteram a termogênese 9,10.
Fornecido aqui é uma investigação preliminar da capacidade do neurohormônio oxitocina (Oxt) para alterar a termogênese muscular em camundongos. Semelhante à ameaça predadora, os encontros sociais com um conespecífico do mesmo sexo aumentam a temperatura corporal, fenômeno denominado hipertermia social11. Dada a relevância do Oxt para o comportamento social12, especula-se que o Oxt seja um mediador da hipertermia social em camundongos. De fato, um antagonista do receptor de ocitocina diminui a hipertermia social em camundongos11, e filhotes de camundongos sem Oxt apresentam déficits em aspectos comportamentais e fisiológicos da termorregulação, incluindo a termogênese13. Dado que Harshaw et al. (2021) não encontraram evidências que apoiassem a termogênese do tecido adiposo marrom (BAT) dependente do receptor adrenérgico β3 com hipertermia social11, tem sido postulado que a hipertermia social pode ser impulsionada pela indução de termogênese muscular de Oxt.
Para medir a termogênese do músculo esquelético, o protocolo a seguir utiliza o implante de transponders IPTT-300 pré-programados adjacentes ao músculo de interesse em camundongos ou ratos 8,10,14,15. Esses transponders são microchips encapsulados em vidro que são lidos usando leitores de transponder correspondentes. Pouca ou nenhuma pesquisa utilizou essa tecnologia nessa capacidade, embora estudos tenham sugerido a necessidade da especificidade proporcionada por esse método16,17. Investigações anteriores mostraram a confiabilidade desse método e uma variedade de maneiras pelas quais os transponders de temperatura podem ser usados em comparação com outros métodos de teste de temperatura18 ou em conjunto com métodos cirúrgicos (por exemplo, canulação19). No entanto, estudos dessa natureza dependem de diferentes posicionamentos estratégicos para medir a temperatura corporal global 20,21,22 ou tecidos especificados, como a MTD23,24,25.
Em vez de medir a temperatura a partir desses locais ou ao usar termômetros de orelha ou reto26, o método descrito aqui fornece especificidade para o músculo de interesse. A capacidade de atingir um local implantando diretamente transponders adjacentes aos músculos de interesse é mais eficaz para sondar a termogênese muscular especificamente. Fornece uma nova avenida, além daquelas fornecidas pela termometria infravermelha de superfície 27,28 ou medições de temperatura cutânea via termopar 29. Além disso, os dados fornecidos por meio desse método oferecem uma gama de caminhos de pesquisa, evitando a necessidade de equipamentos e softwares de grande porte, caros e de alta tecnologia, como a termografia infravermelha30,31,32.
Este método tem sido utilizado com sucesso para medir a temperatura no quadríceps e gastrocnêmio, unilateralmente ou bilateralmente. Esse método também tem sido eficaz em conjunto com a cirurgia estereotáxica14,15. Dentro de ~7-10 cm do membro do transponder, leitores de transponder portáteis (DAS-8027/DAS-7007R) são usados para digitalizar, medir e exibir a temperatura. Essa distância tem sido crítica e valiosa para investigações anteriores 8,9,10, pois minimiza potenciais estressores e variáveis que alteram a temperatura, como o manuseio de animais durante os procedimentos de teste. Usando temporizadores, as medições podem ser registradas e coletadas ao longo de um período de tempo sem interação direta com os animais.
Para minimizar ainda mais a perturbação dos ratos durante o teste, este método descreve a montagem e o uso de risers feitos de tubulação de PVC para dar ao experimentador acesso ao fundo das gaiolas domésticas durante o teste. Usando os risers em conjunto com o leitor digital, as medições de temperatura do membro do transponder podem ser feitas sem qualquer interação animal após a colocação do estímulo. A um custo mínimo, este método pode ser utilizado em conjunto com estímulos farmacológicos e contextuais, tornando-o bastante acessível para os pesquisadores. Além disso, este método pode ser empregado com um número substancial de indivíduos (~ 16 ratos ou ~ 12 ratos) de cada vez, economizando tempo no aumento da taxa de transferência geral para qualquer projeto de pesquisa.
Introduzido neste método é um mecanismo criado para apresentar odores a ratos usando bolas de infusor de chá de malha de aço inoxidável, a partir de agora referidas como "bolas de chá". Embora essas bolas de chá sejam ideais para conter qualquer material de odor, nesses estudos, toalhas que serviram como cama na gaiola durante 2-3 semanas para furões, um predador natural de camundongos e ratos, são colocadas dentro de cada bola de chá de tratamento. Cada toalha é cortada em quadrados de 5 cm x 5 cm. Esta alíquota também é repetida com toalhas de controle inodoras idênticas. Apresentar esses odores sem barreira (ou seja, bola de chá) levou os ratos a triturar as fibras dentro de suas gaiolas, aumentando a atividade física. Esse comportamento não foi tão saliente em ratos. As bolas de chá fornecem um invólucro ventilado para a toalha, dando acesso total ao odor, mantendo-se protegidas durante todo o teste experimental. Essas bolas de chá podem ser higienizadas de acordo com os protocolos de uso animal, preparadas e introduzidas diretamente após a cirurgia para começar a habituar os animais à estrutura junto com o estímulo de controle. Os ratos podem então viver com o enriquecimento adicional, diminuindo a saliência da apresentação do estímulo agudo.
A habituação à presença da bola de chá é apenas um aspecto da habituação que é crítico para este método. O protocolo de habituação descrito também consiste na exposição repetida ao procedimento de teste para normalizar o ambiente de teste (ou seja, pessoal, transporte e movimento para o local de teste, exposição ao estímulo). Essa habituação prolongada minimiza as respostas matizadas dos animais e concentra as medições nas variáveis dependentes desejadas (por exemplo, estímulos farmacológicos ou contextuais). A avaliação prévia deste protocolo identificou quatro ensaios como o número mínimo de habituações necessárias antes do teste de temperatura dentro de gaiolas domésticas em ratos8. Se o teste for separado por longos períodos (mais de 2-3 semanas), os animais devem ser habituados novamente. Para habituação repetida, um mínimo de uma a duas tentativas são suficientes. No entanto, se os testes de temperatura forem separados por períodos de tempo mais prolongados, a repetição de mais ensaios pode ser necessária.
No esforço contínuo para acostumar camundongos e ratos ao procedimento de teste, um período de aclimatação antes da apresentação do estímulo deve ser incluído em cada ensaio experimental. Esse tempo de aclimatação é fundamental para reequilibrar a temperatura e a atividade depois de ser deslocado para o local de teste. Os roedores tendem a ter aumentos acentuados de temperatura devido à translocação. A aclimatação deve consistir em um mínimo de 1 h sem interação do experimentador no dia do teste antes de qualquer adição de um agente farmacológico ou estímulos contextuais. Isso é necessário a cada dia de teste.
Nos testes de temperatura da gaiola doméstica delineados, os ratos têm o alcance livre de sua gaiola doméstica para vagar em resposta ao estímulo testado. Isso pode causar mudanças variáveis na atividade, impactando a precisão das leituras de temperatura e, portanto, a análise dos efeitos termogênicos da variável independente (por exemplo, estímulo farmacológico ou contextual). Em reconhecimento às potenciais mudanças de temperatura devido ao nível de atividade, um protocolo é incluído abaixo descrevendo o uso da temperatura durante a caminhada em esteira. A literatura publicada descreve o uso bem-sucedido desse procedimento em ratos, e atualmente está sendo empregado com camundongos 8,10,14,15. A caminhada na esteira mantém uma velocidade constante de atividade para o sujeito do teste. Para este estudo, as esteiras são estritamente usadas para controlar o nível de atividade e, portanto, são ajustadas para a menor velocidade disponível na esteira para promover a caminhada para camundongos e uma configuração similarmente baixa para ratos.
O procedimento a seguir é descrito para a medição da temperatura do gastrocnêmio unilateral em camundongos e apresentação de odor de predador. O desenho pode ser usado em conjunto com agentes farmacológicos e é transferível para ratos e outros grupos musculares esqueléticos (ou seja, quadríceps) em camundongos. Para ratos, os transponders podem ser colocados no gastrocnêmio bilateralmente e no tecido adiposo marrom. Devido a limitações de tamanho e distância, apenas um transponder pode ser usado por mouse. Pequenas modificações (por exemplo, a remoção de estímulos contextuais) podem ser feitas para avaliar as respostas termogênicas a agentes farmacológicos.

<table><tbody><tr><td>1012M-2 Esteira Metabólica Modular Fechada para Camundongos, 2 Pistas com Amortecedor</td><td>Instrumentos Columbus</td> 1012R-2 <td></td><td></td></tr><tr><td>Esteira Metabólica Modular Fechada para Ratos, 2 Pistas com Amortecedor</td><td>Columbus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-1/4 pol. Cortador de PVC com catraca</td><td>BrassCraft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes Betadine</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-945</td><td></td></tr><tr><td>Bobina de reforço</td><td>Acessório de transponder</td><td>BioMedic Data Systems</td><td></td></tr><tr><td>Clippers elétricos</td><td>Andis</td><td></td><td>40 Ultraedge Clipper</td></tr><tr><td>Blade Folhas de espelho flexíveis</td><td>Amazon</td><td></td><td>Espelho Autoadesivo Não Vidro Azulejos</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>89259-940</td><td></td>Câmara de Indução de</tr><tr><td>Almofada</td><td></td><td></td><td></td>de Aquecimento</tr><tr><td>(isoflurano)</td> <td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-0730</td><td>3.0 L Câmaras de Baixo Custo para Vaporizadores Tradicionais</td></tr><tr><td>Ketoprophen</td><td>Med-Vet Intl.</td><td>RXKETO-50</td><td></td></tr><tr><td>Tiras Magnéticas</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ímãs</td><td>Amazon</td><td></td><td>DIYMAG Ganchos Magnéticos 40lbs</td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>Med-Vet Intl.</td><td>26400</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina/Polimixina/Bacitracina com Pomada Oftálmica de Hidrocortisona, 3,5 g</td><td>Med-Vet Intl.</td><td>RXNPB-HC</td><td></td></tr><tr><td>Oasis Sutura Absorvível</td><td>Med-Vet Intl.</td><td>MV-H821-V</td><td></td></tr><tr><td>Predator (furão) Toalhas de odor</td><td>Marshall BioResources</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td></td><td></td><td></td>de PVC</tr><tr><td>Removedor de clipe de ferida reflexo</td><td>CellPoint Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clipe de ferida reflexo, 7 mm (mouse)</td>Clipe de ferida reflexo <td>CellPoint Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 9 mm (rato)</td><td>CellPoint Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Srerile Autoclip, 7 mm (mouse)</td><td>CellPoint Scientific</td><td></td><td>Wound Clip Applier (mouse)</td></tr><tr><td>Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Autoclip, 9 mm (rat)</td><td>CellPoint Scientific</td><td></td><td>Wound Clip Applier (rato)</td></tr><tr><td>Sterile Saline</td><td>Med-Vet Intl.</td><td>RX0.9NACL-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>Lençóis Cirúrgicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toalhas (Controle/Habituação)</td><td>Amazon</td><td></td><td>100% Algodão Toalhas, Branco</td></tr><tr><td>Transponders</td><td>BioMedic Data Systems</td><td></td><td>Modelo: IPTT-300</td></tr><tr><td>Transponders Reader</td><td>BioMedic Data Systems</td><td></td><td>Modelo: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R</td></tr><tr><td>Versaclean</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-200-700</td><td>detergente líquido</td></tr><tr><td>Webcol Preparação de Álcool</td><td>Covidien</td><td>22-246-073&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Peças de cunha para tubo</td><td></td><td></td><td></td> de PVC</tr></tbody></table>

medindo a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos

Measuring Skeletal Muscle Thermogenesis in Mice and Rats

A termogênese do músculo esquelético fornece uma avenida potencial para uma melhor compreensão da homeostase metabólica e dos mecanismos subjacentes ao gasto energético. Surpreendentemente, pouca evidência está disponível para ligar os mecanismos neurais, miocelulares e moleculares da termogênese diretamente a mudanças mensuráveis na temperatura muscular. Este artigo descreve um método no qual transponders de temperatura são utilizados para recuperar medidas diretas da temperatura muscular esquelética de camundongos e ratos.
Transponders remotos são implantados cirurgicamente dentro do músculo de camundongos e ratos, e os animais têm tempo para se recuperar. Camundongos e ratos devem então ser repetidamente habituados ao ambiente e procedimento de teste. Mudanças na temperatura muscular são medidas em resposta a estímulos farmacológicos ou contextuais na gaiola doméstica. A temperatura muscular também pode ser medida durante a atividade física prescrita (ou seja, andar na esteira a uma velocidade constante) para fatorar as mudanças na atividade como contribuintes para as mudanças na temperatura muscular induzidas por esses estímulos.
Este método tem sido usado com sucesso para elucidar os mecanismos subjacentes ao controle termogênico muscular no nível do cérebro, sistema nervoso simpático e músculo esquelético. São fornecidas demonstrações desse sucesso usando odor de predador (PO; odor de furão) como estímulo contextual e injeções de ocitocina (Oxt) como estímulo farmacológico, onde o odor de predador induz a termogênese muscular e o Oxt suprime a temperatura muscular. Assim, esses conjuntos de dados exibem a eficácia desse método na detecção de mudanças rápidas na temperatura muscular.

Transponders foram implantados unilateralmente no gastrocnêmio direito de dez camundongos de 4-6 meses de idade, do tipo selvagem (WT), criados a partir da cepa SF1-Cre (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, Cepa #012462, C57BL/6J e fundos FVB; fêmea N = 5; macho N = 5). Após a recuperação, os ratos foram habituados a um procedimento de teste de temperatura da gaiola domiciliar que não incluía um estímulo contextual (por exemplo, PO). As medições de temperatura usando uma varinha de transponder foram registradas dentro de sua sala de al...

Camundongos e ratos são implantados cirurgicamente com transponders de temperatura remotos e, em seguida, habituados ao ambiente de teste e procedimento. As mudanças na temperatura muscular são medidas em resposta a estímulos farmacológicos ou contextuais na gaiola doméstica ou durante a atividade física prescrita (ou seja, caminhada em esteira a uma velocidade constante).

Medindo a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos

Skeletal muscle thermogenesis provides a potential avenue for better understanding metabolic homeostasis and the mechanisms underlying energy expenditure. ...

Este protocolo é significativo, pois fornece um método direto e econômico para medir a temperatura do músculo esquelético. Além disso, pode ser usado em vários contextos e sob a estimulação de agentes farmacológicos. A principal vantagem desta técnica é o número de animais que podem ser testados simultaneamente.A perturbação animal mínima descrita aqui evita a necessidade de métodos de alta tecnologia, como a termografia infravermelha. Os indivíduos podem ter dificuldade em medir a temperatura dos animais dentro da gaiola doméstica ou em esteiras enquanto em movimento. Isso pode ser mitigado pela prática de técnicas de medição durante os ensaios de habituação.Comece aquecendo os transponders fechados entre as mãos enluvadas e certifique-se de manter a esterilidade, enquanto trabalha com transponders. Meça a temperatura usando um scanner de temperatura e verifique se o transponder lê as mudanças de temperatura. Depois de anestesiar o camundongo, conforme descrito no manuscrito, use uma tesoura cirúrgica para fazer um corte raso através da pele do membro posterior direito.Coloque a borda afiada de um transponder estéril pré-programado e sem tampa na incisão, paralelamente ao gastrocnêmio. Certifique-se de que o êmbolo verde está virado para cima e visível. Continue empurrando o aplicador do transponder para a incisão até que a abertura do aplicador do transponder não seja mais visível.Gire o aplicador a 180 graus, de modo que o êmbolo verde fique voltado para baixo em direção ao membro do rato e não seja mais visível para o experimentador. Uma vez que o aplicador do transponder é colocado adjacente ou parcialmente fechado no gastrocnêmio, empurre o êmbolo verde, permitindo que a pressão do aplicador guie a mão do investigador para longe do rato. Usando fórceps, mantenha a pele aberta unida.Coloque um clipe de ferida com um autoclipe estéril, dobre, se necessário. Use suturas absorvíveis antes do autoclipe estéril para fechar a camada da fáscia. Usando o leitor de transponder, verifique a temperatura do músculo do rato.Depois de remover o rato da anestesia, coloque-o em uma gaiola doméstica limpa em cima de uma almofada de aquecimento e certifique-se de que a gaiola doméstica inclua uma bola de chá com uma toalha inodora para iniciar a habituação. Atribua um local ao riser na sala de teste e, para evitar variáveis de confusão, separe os risers definidos para receber diferentes estímulos contextuais por um mínimo de dois metros. Usando tiras magnéticas, prenda folhas cirúrgicas através do riser e crie uma barreira visual para minimizar as flutuações de temperatura devido à atividade do rato, em resposta ao movimento do experimentador.Prepare bolas de chá com toalhas de controle e odor predador. Transfira o animal para a sala de testes preparada. Coloque o animal em um local pré-designado no riser e evite alterar a localização do riser entre os procedimentos de habituação e teste.Remova a bola da gaiola doméstica da gaiola doméstica do rato. Recupere a gaiola com um pano ou lençol cirúrgico e permita que o rato se acostume ao espaço de ensaio durante uma a duas horas. Após a conclusão da aclimatação, use o scanner para medir e registrar a temperatura de linha de base do sujeito.Descubra a gaiola e coloque a bola de chá no chão da gaiola doméstica. Substitua a tampa da gaiola e a cobertura do pano. Inicie o cronômetro e meça as temperaturas dos sujeitos do teste na mesma ordem de colocação da bola de chá.Registre as temperaturas e o tempo do relógio das medições, seguindo os pontos de tempo desejados. Prepare as esteiras para testes, garantindo que os amortecedores estejam funcionais. Certifique-se de que os animais usem a mesma esteira para procedimentos de habituação e teste.Mova o mouse para a sala de testes e deixe-o se aclimatar por uma a duas horas em sua gaiola doméstica. Antes de mover o mouse para a esteira, meça e registre sua temperatura de linha de base. Para facilitar a colocação e remoção, cole as toalhas de controle ou odor predador no teto ou embaixo da frente da esteira.Guie o mouse para a esteira atribuída. Ligue a correia da esteira e o amortecedor, ligue o cronômetro e faça medições dos sujeitos de teste na mesma ordem em que foram configurados nas esteiras. Registre as temperaturas e o tempo do relógio das medições, seguindo os pontos de tempo desejados.Quando o teste estiver concluído, desligue o amortecedor e a esteira e devolva o mouse à gaiola doméstica. Limpe a esteira usando detergente líquido e água e remova qualquer odor residual de predador. Repetidos ensaios de habituação diminuíram significativamente a temperatura muscular dos camundongos, mostrando os ratos habituados ao ambiente e protocolo de teste.A análise de sexo combinado do ensaio quatro não mostrou diferença significativa entre as medições de temperatura antes do movimento e a linha de base, demonstrando a eficácia da aclimatação de uma hora ao contexto de teste. A estimulação farmacológica usando ocitocina em camundongos mostrou diminuição da temperatura muscular em relação à linha de base, com uma diminuição máxima após 30 minutos. As temperaturas musculares foram normalizadas 60 minutos após a injeção de ocitocina.Um aumento sustentado na temperatura muscular foi observado em ratos Sprague Dawley, após a remoção do odor do predador como estímulos contextuais. Os ratos Sprague Dawley apresentaram um aumento robusto na temperatura em resposta ao odor de furão, em comparação com o odor de controle. Na presença de outros odores aversivos, o odor de furão produz e mantém uma mudança termogênica robusta em comparação com todas as outras condições.Ao tentar este procedimento, é fundamental habituar os animais ao protocolo de teste e agendar uma a duas horas de aclimatação a cada dia de teste.

measuring-skeletal-muscle-thermogenesis-in-mice-and-rats

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Um método de imagiologia funcional do rato tecido adiposo castanho (BAT), que é descrito no frio estimulada a captação de 18F-fluorodeoxiglicose (FDG) em BAT é avaliada de forma não invasiva com um protocolo padronizado micro-PET/CT. Este método é robusto e sensível para detectar diferenças nas atividades da BAT em modelos do rato.

Imagem Funcional de gordura marrom em ratos com FDG micro-PET/CT

Este protocolo descreve o uso de um analisador de composição do corpo e sistema de monitoramento animal metabólico para caracterizar a composição corporal e parâmetros metabólicos em camundongos. Um modelo de obesidade induzido pelo alto teor de gordura alimentar é usado como um exemplo para a aplicação dessas técnicas.

Composição corporal e análise de enjaulamento metabólico em ratos de alta gordura Fed

Aqui nós apresentamos um novo método para medir com precisão as diferenças de temperatura de corpo em anafilaxia sistêmica passiva (PSA) e modelos de rato de alergia alimentar usando um termômetro infravermelho. Este procedimento tem sido duplicado com precisão em resultados anteriores de PSA.

Medição de temperatura de corpo do mouse usando o termômetro infravermelho durante passiva anafilaxia sistêmica e avaliação de alergia alimentar

A regulação intacta da absorção de glicose muscular é importante para manter a homeostase de glicose corporal inteira. Este protocolo apresenta avaliação da absorção de glicose estimulada pela insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado ao delinear o impacto de várias intervenções fisiológicas em todo o metabolismo da glicose corporal.

Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Imagem funcional e quantitação de depósitos de adiposos termogênicos em camundongos usando uma abordagem baseada em imagens micro-PET/MR.

Visualização e Quantificação de Tecidos Adiposos Marrons e Bege em Camundongos usando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Este manuscrito descreve um protocolo para medir a taxa metabólica basal e a capacidade oxidativa de adipócitos termogênicos em camundongos obesos.

Determinando o gasto energético basal e a capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia em camundongos obesos

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar o significado fisiológico do impacto da atividade do tecido adiposo marrom (BAT) no metabolismo humano. Isto é conseguido combinando carga de carboidratos e calorimetria indireta com medidas de mudanças supraclaviculares de temperatura. Esta nova abordagem pode ajudar a desenvolver um alvo farmacológico para a termogênese BAT em humanos.

Usando uma combinação de calorimetria indireta, termografia infravermelha e níveis de glicose no sangue para medir a termogênese do tecido adiposo marrom em humanos

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade do tecido adiposo marrom após uma refeição em humanos e animais de laboratório.

Termografia infravermelha para detecção de alterações na atividade do tecido adiposo marrom

Neste protocolo, métodos relevantes para metabolômica arteriovenosa otimizada para BAT usando GC-MS em um modelo de camundongo são descritos. Esses métodos permitem a aquisição de informações valiosas sobre a troca de metabólitos mediada por MTD em nível de organismo.

Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Aprenda a medir a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos usando transponders de temperatura remotos. Este método minimiza o distúrbio aos animais e permite testes simultâneos de múltiplos indivíduos.

Medindo a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos

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