Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Summary

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.

Abstract

A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito de drogas e retirada do mercado. Portanto, o uso de modelos adequados de avaliação de segurança cardíaca pré-clínica é uma etapa crítica durante o desenvolvimento do medicamento. Atualmente, a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de estudos em animais. No entanto, os modelos animais são atormentados pela baixa especificidade translacional para os seres humanos devido a diferenças específicas da espécie, particularmente em termos de características eletrofisiológicas cardíacas. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro inestimável para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Os CMCs hiPSC podem ser obtidos de indivíduos com diversas origens genéticas e várias condições doentes, tornando-os um substituto ideal para avaliar a cardiotoxicidade induzida por drogas individualmente. Portanto, metodologias para investigar de forma abrangente as características funcionais dos CME-hiPSC precisam ser estabelecidas. Neste protocolo, detalhamos vários ensaios funcionais que podem ser avaliados em CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio. No geral, a incorporação de hiPSC-CMs na avaliação pré-clínica da segurança cardíaca tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento de medicamentos.

Introduction

O desenvolvimento de medicamentos é um processo longo e caro. Um estudo de novos medicamentos terapêuticos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA entre 2009 e 2018 relatou que o custo médio estimado de pesquisas capitalizadas e ensaios clínicos foi de US $ 985 milhões por produto¹. A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito e retirada de drogas do mercado². Notavelmente, a cardiotoxicidade é relatada entre as múltiplas classes de drogas terapêuticas³. Portanto, a avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimen....

Protocol

1. Preparação de meios e soluções

1. Prepare o meio de manutenção hiPSC-CM misturando um frasco de 10 mL de suplemento de 50x B27 e 500 mL de meio RPMI 1640. Conservar o meio a 4 °C e utilizá-lo no prazo de um mês. Equilibre a temperatura média a temperatura ambiente (RT) antes de usar.
2. Preparar o meio de semeadura hiPSC-CM misturando 20 mL de reposição sérica e 180 mL de meio de manutenção hiPSC-CM (diluição a 10%, v/v). Embora o meio de semeadura recém-preparado seja preferido, ele pode ser armazenado a 4 °C por não mais de 2 semanas. Equilibre o meio para RT antes de usar.
3. Preparar a solução de revestimento da matriz extr....

Results

Este protocolo descreve como medir o movimento de contração, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca²⁺ de CM-hiPSC. Um diagrama esquemático incluindo a digestão enzimática, a semeadura celular, a manutenção e a condução do ensaio funcional é mostrado na Figura 1. A formação da monocamada hiPSC-CM é necessária para a medição do movimento de contração (Figura 2B). Um traço representativo do movimento de contração-relaxamento dos CM-h.......

Discussion

A tecnologia iPSC humana emergiu como uma plataforma poderosa para modelagem de doenças e triagem de medicamentos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir a contratilidade do hiPSC-CM, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca²+. Este protocolo fornece uma caracterização abrangente da contratilidade e eletrofisiologia do hiPSC-CM. Esses ensaios funcionais têm sido aplicados em múltiplas publicações do nosso grupo 12,13,18,24,25,26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prato de fundo de vidro de 35 mm com vidro de cobertura de micropoço #1.5 de 20 mm	Cellvis	D35-20-1.5-N	Patch clamp
50x suplementos B27	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM meio de cultura
6 poços placa de cultura	E & K Scientific	EK-27160	hiPSC-CM cultura
96 poços fundo plano transparente poliestireno preto microplacas tratadas com TC	Corning	3603	Medição de movimento de contração
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	Dissociação enzimática
Axion's Integrated Studio (AxIS)	Axion Biosystems		software de navegação
Capilares de vidro borossilicato	Harvard Apparatus	BF 100-50-10,	Grampo de remendo
CaCl2 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode' s solução
Corrediças de câmara de contagem de células	ThermoFisher Scientific	C10228	Contagem de células
Placas MEA de 48 poços	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	MEA
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	Meio de matriz extracelular
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	pipeta intracelular	Sigma-Aldrich	E3889
EPC 10 USB  amplificador de patch clamp	Warner Instruments	89-5000	Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant	ThermoFisher Scientific	F1221	Ca2+ medição transitória
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode' solução HEPES
	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode' solução
hiPSCs	Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode' s solução
KnockOut Serum Replacement	ThermoFisher Scientific	10828-028	hiPSC-CM meio de semeadura
KOH 8  M	Sigma-Aldrich	P4494	Solução de pipeta intracelular
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ medição transitória; fonte de luz de comutação de comprimento de onda de ultra-alta velocidade
Contador de células de fluorescência automatizado Luna-FL	WISBIOMED	LB-L20001	Contagem de células
Maestro Pro  Sistema MEA	Axion Biosystems		MEA
Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG) Matriz da Membrana Basal	Corning	356231	Meio de matriz extracelular
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Solução de pipeta intracelular
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode' s solução
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode' s solução
NaOH 10  M	Sigma-Aldrich	72068	Tyrode' s
solução NIS Elements AR
Pluronic F-127 (solução a 20% em DMSO)	ThermoFisher Scientific	P3000MP	Ca2+ medição transitória
RPMI 1640 meio	de cultura Life Technologies	11875-119	hiPSC-CM
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System	Sony Biotechnology		Medição de movimento de contração
Extrator de micropipetas	Sutter Instruments	P-97	Patch clamp
Mancha azul tripano	Life Technologies	T10282	Contagem de células