Method Article

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito de drogas e retirada do mercado. Portanto, o uso de modelos adequados de avaliação de segurança cardíaca pré-clínica é uma etapa crítica durante o desenvolvimento do medicamento. Atualmente, a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de estudos em animais. No entanto, os modelos animais são atormentados pela baixa especificidade translacional para os seres humanos devido a diferenças específicas da espécie, particularmente em termos de características eletrofisiológicas cardíacas. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro inestimável para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Os CMCs hiPSC podem ser obtidos de indivíduos com diversas origens genéticas e várias condições doentes, tornando-os um substituto ideal para avaliar a cardiotoxicidade induzida por drogas individualmente. Portanto, metodologias para investigar de forma abrangente as características funcionais dos CME-hiPSC precisam ser estabelecidas. Neste protocolo, detalhamos vários ensaios funcionais que podem ser avaliados em CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio. No geral, a incorporação de hiPSC-CMs na avaliação pré-clínica da segurança cardíaca tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento de medicamentos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O desenvolvimento de medicamentos é um processo longo e caro. Um estudo de novos medicamentos terapêuticos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA entre 2009 e 2018 relatou que o custo médio estimado de pesquisas capitalizadas e ensaios clínicos foi de US $ 985 milhões por produto1. A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito e retirada de drogas do mercado2. Notavelmente, a cardiotoxicidade é relatada entre as múltiplas classes de drogas terapêuticas3. Portanto, a avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimento de medicamentos. O paradigma atual para a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de modelos animais. No entanto, as diferenças de espécies em relação ao uso de modelos animais são cada vez mais reconhecidas como a principal causa de previsões imprecisas para a cardiotoxicidade induzida por drogas em pacientes humanos4. Por exemplo, a morfologia do potencial de ação cardíaca difere substancialmente entre humanos e camundongos devido às contribuições de diferentes correntes de repolarização5. Além disso, isoformas diferenciais de miosina cardíaca e RNAs circulares que podem afetar a fisiologia cardíaca têm sido bem documentadas entre as espécies 6,7. Para preencher essas lacunas, é imperativo estabelecer um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca.

A invenção inovadora da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) gerou plataformas sem precedentes de triagem de medicamentos e modelagem de doenças. Na última década, métodos para gerar cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) tornaram-se bem estabelecidos 8,9. Os CM-hiPSC têm atraído grande interesse em suas potenciais aplicações na modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Por exemplo, os CM-hiPSC têm sido utilizados para modelar os fenótipos patológicos de doenças cardíacas causadas por herança genética, como a síndrome do QT longo10, a cardiomiopatia hipertrófica 11,12 e a cardiomiopatia dilatada13,14,15. Consequentemente, foram identificadas as principais vias de sinalização implicadas na patogênese das doenças cardíacas, o que pode lançar luz sobre possíveis estratégias terapêuticas para um tratamento eficaz. Além disso, os CM-hiPSC têm sido utilizados para rastrear a cardiotoxicidade induzida por drogas associada a agentes anticancerígenos, incluindo doxorrubicina, trastuzumabe e inibidores da tirosina quinase16,17,18; estratégias para mitigar a cardiotoxicidade resultante estão sob investigação. Por fim, a informação genética retida nas CME-hiPSC permite a triagem e a predição da cardiotoxicidade induzida por fármacos tanto em nível individual quanto populacional19,20. Coletivamente, os hiPSC-CMs provaram ser uma ferramenta inestimável para a previsão personalizada da segurança cardíaca.

O objetivo geral deste protocolo é estabelecer metodologias para investigar de forma abrangente e eficiente as características funcionais dos CM-hiPSC, que são de grande importância na aplicação de CMhiPSC para modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Aqui, detalhamos uma série de ensaios funcionais para avaliar as propriedades funcionais dos CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio (Ca2+) (Figura 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação de meios e soluções

  1. Prepare o meio de manutenção hiPSC-CM misturando um frasco de 10 mL de suplemento de 50x B27 e 500 mL de meio RPMI 1640. Conservar o meio a 4 °C e utilizá-lo no prazo de um mês. Equilibre a temperatura média a temperatura ambiente (RT) antes de usar.
  2. Preparar o meio de semeadura hiPSC-CM misturando 20 mL de reposição sérica e 180 mL de meio de manutenção hiPSC-CM (diluição a 10%, v/v). Embora o meio de semeadura recém-preparado seja preferido, ele pode ser armazenado a 4 °C por não mais de 2 semanas. Equilibre o meio para RT antes de usar.
  3. Preparar a solução de revestimento da matriz extracelular descongelando um frasco (10 mL) de matriz de membrana basal a 4 °C durante a noite e alíquota de 500 μL de matriz de membrana basal em tubos estéreis de 1,5 mL. Conservar a -20 °C para posterior utilização. Misture 500 μL de matriz de membrana basal e 100 mL de meio DMEM/F12 gelado (diluição 1:200, v/v) para fazer uma solução de revestimento de matriz de membrana basal.
  4. Preparar 50 ml de solução de Tyrode contendo 135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de glucose e 10 mM de HEPES. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Prepare a solução fresca de Tyrode no dia da experiência.
  5. Preparar 50 mL de solução de pipeta intracelular contendo 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA e 10 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,2 com KOH. Aliquotar a solução de pipeta intracelular em tubos estéreis de 5 ml e armazená-la a -20 °C. No dia do experimento, adicionar MgATP à solução para atingir uma concentração final de 3 mM.
  6. Preparar 1 mL de solução de carga de Fura-2 AM contendo 2 μM de Fura-2 AM e F-127 Plurônico a 0,1%. Prepare uma solução de carregamento fresca no dia do experimento e proteja-a da luz.

2. Medição do movimento de contração hiPSC-CM

  1. Prepare placas revestidas de matriz de membrana basal adicionando 100 μL de solução de revestimento de matriz extracelular a cada poço de placas de 96 poços. Incubar as placas de 96 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
  2. Dissociação enzimática de hiPSC-CMs
    1. Solicite hiPSCs do Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Gerar hiPSC-CMs de acordo com as publicações anteriores 8,9. Observe os CMs hiPSC cultivados em placas de seis poços sob um microscópio com ampliação de 10x.
      NOTA: Não dissociar as células quando elas ainda estiverem proliferativas. Caso contrário, as células crescerão demais nos poços após o replating e levarão a resultados imprecisos dos ensaios funcionais. Normalmente, os CMs hiPSC param a proliferação nos dias 18-23.
    2. Certifique-se de que os hiPSC-CMs estão batendo fortemente e têm uma pureza de mais de 95%. Avaliar a pureza por imunomarcação contra troponina T cardíaca, um marcador específico de cardiomiócitos 8,9.
    3. Aspirar o meio de manutenção e lavar as células com 1x DPBS duas vezes. Adicionar 1 ml de solução de descolamento celular a cada alvéolo das placas de seis poços e incubar durante 10 min a 37 °C.
      NOTA: A duração da incubação deve ser monitorizada regularmente. Certifique-se de não digerir excessivamente as células, pois isso reduzirá a viabilidade celular.
    4. Pipete suavemente hiPSC-CMs para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta de 5 mL para gerar uma suspensão de célula única. Adicione um volume igual de meio de semeadura hiPSC-CMs para neutralizar a solução de descolamento celular.
    5. Centrífuga hiPSC-CMs a 300 x g por 3 min no RT. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1-2 mL de meio de semeadura hiPSC-CM.
    6. Quantifique a densidade celular e a viabilidade usando um método de exclusão de azul de tripano. Resumidamente, misture 10 μL de suspensão celular com um volume igual de azul de tripano, transfira para uma lâmina de contagem de células e, em seguida, conte usando um contador de células, conforme descrito anteriormente21.
  3. Semeadura hiPSC-CMs
    1. Remova a solução de revestimento da matriz extracelular das placas de 96 poços.
    2. Semear 50.000 células por poço em 100 μL de meio de semeadura hiPSC-CM e colocar as placas de 96 poços em uma incubadora de cultura celular umidificada a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
    3. Substitua o meio de semeadura hiPSC-CM por 100 μL de meio de manutenção hiPSC-CM 1 dia após o revestimento. Altere o meio de manutenção hiPSC-CM a cada 2 dias até a gravação.
  4. Aquisição de dados
    1. Meça o movimento de contração do hiPSC-CM pelo menos 10 dias após o plaqueamento (recomendado).
    2. Ligue o controlador de temperatura e defina 37 °C como a temperatura preferida. Ligue o microscópio, a câmera e a fonte de CO2 .
    3. Encher a camisa de água do suporte da placa com uma quantidade adequada de água desionizada estéril (Figura 2A). Coloque a placa de 96 poços no suporte da placa e permita que as células se aclimatem por pelo menos 5 minutos.
    4. Abra o software de visualização, defina a taxa de quadros da câmera para 75 quadros por segundo (fps) e a resolução de vídeo/imagem para 1024 × 1024 pixels. Aplique as funções de foco automático e brilho automático. Grave vídeos e imagens de hiPSC-CMs.
      NOTA: Evite a vibração da mesa do microscópio durante a gravação.
    5. Abra o software analisador para análise automática.

3. Medição do potencial de campo hiPSC-CM

  1. Preparação de placas revestidas de matriz de membrana basal
    1. Coloque cuidadosamente uma gota de 8 μL de solução de revestimento de matriz extracelular sobre a área do eletrodo de gravação de cada poço das placas de matriz de microeletrodos (MEA) de 48 poços. Consulte a Figura 3A para a área apropriada do eletrodo para a colocação de gotículas. Esta etapa é fundamental para manter a monocamada hiPSC-CM concentrada nos eletrodos. Evite tocar nos eletrodos em qualquer circunstância.
    2. Adicionar 3 mL de água desionizada estéril à área ao redor dos poços (Figura 3A) das placas MEA de 48 poços para evitar a evaporação da solução de revestimento. Incubar placas MEA de 48 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 por 45-60 min.
      NOTA: Não incube por muito tempo para evitar que a matriz da membrana basal seque.
  2. Realizar dissociação enzimática de hiPSC-CMs conforme descrito na etapa 2.2.
  3. Semeadura hiPSC-CMs
    1. Remova a maior parte do meio da matriz extracelular da superfície do poço sem tocar nos eletrodos usando uma ponta de pipeta de 200 μL dentro da mesma linha ou coluna única.
    2. Semear 50.000 células por poço em uma gota de 8 μL de meio de semeadura hiPSC-CM sobre a área do eletrodo de registro de cada poço da mesma linha ou coluna.
    3. Repita os dois últimos passos até que todos os poços tenham sido banhados com células. Verifique ao microscópio se todos os poços têm a suspensão hiPSC-CM. Para a densidade desejada, consulte a Figura 3B.
      NOTA: A fixação de hiPSC-CMs será comprometida se a matriz da membrana basal estiver completamente seca, tornando a fixação celular subótima.
    4. Incubar as placas MEA de 48 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 por 60 min.
    5. Adicione lenta e suavemente 150 μL de meio de semeadura hiPSC-CM a cada poço das placas MEA de 48 poços. Para adicionar o meio sem dispersar os hiPSC-CMs previamente semeados, segure a placa em um ângulo de 45°, incline a ponta da pipeta contra a parede de cada poço e solte o meio lentamente.
      NOTA: Adicionar meio muito rapidamente ou com alta pressão irá desalojar os cardiomiócitos aderidos. Evite o contato direto com a suspensão de queda hiPSC-CM.
    6. Incubar as placas MEA de 48 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
    7. Atualizar o meio de semeadura hiPSC-CM com 300 μL de meio de manutenção hiPSC-CM 1 dia após o revestimento. Altere o meio de manutenção hiPSC-CM a cada 2 dias antes da gravação.
  4. Aquisição de dados
    1. Realizar a medição de MEA pelo menos 10 dias após o revestimento (recomendado). No dia 10 pós-plaqueamento, verificar a densidade da monocamada de hiPSC-CM de batimento espontâneo sob um microscópio com ampliação de 10x, que deve ser como mostrado na Figura 3C.
    2. Coloque a placa MEA de 48 poços no instrumento de gravação. O ecrã táctil permite observar o estado da temperatura (37 °C) e do CO2 (5%).
    3. Abra o software do navegador. Na janela de configuração experimental, selecione Configuração em tempo real cardíaca e gravações de potencial de campo. Aplique configurações de batida espontâneas ou cadenciadas.
    4. Nos parâmetros de detecção de batimento, defina o limiar de detecção para 300 μV, o período mínimo de batimento para 250 ms e o período de batimento máximo para 5 s. Selecione Regressão polinomial para o cálculo da duração potencial do campo (FPD).
    5. Verifique se o sinal de atividade elétrica de linha de base está maduro e estável.
      NOTA: As formas de onda maduras registradas por cada eletrodo da placa MEA de múltiplos poços devem refletir o potencial do campo cardíaco com características facilmente identificáveis que coincidem com o pico de despolarização cardíaca e a fase de repolarização, como mostra a Figura 3D-F.
    6. Adquira as atividades cardíacas basais por 1-3 min. Se o tratamento medicamentoso for necessário, adicione compostos aos poços após o registro basal. Coloque a placa em uma incubadora por pelo menos 30 minutos antes da próxima gravação.

4. Medição do potencial de ação hiPSC-CM

  1. Preparar pratos revestidos de matriz de membrana basal colocando 500 μL de solução de revestimento de matriz extracelular na parte de fundo de vidro de placas de 35 mm (Figura 4A). Incubar as placas de 35 mm em incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
  2. Realizar dissociação enzimática de hiPSC-CMs conforme descrito na etapa 2.2.
  3. Semeadura hiPSC-CMs
    1. Remova a solução de revestimento de matriz extracelular das placas de 35 mm. Semeia 50.000 células por poço em 500 μL de meio de semeadura hiPSC-CM na parte inferior de vidro de placas de 35 mm.
    2. Incubar as placas de 35 mm em incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite. Remova o meio de semeadura hiPSC-CM e adicione 2 mL de meio de manutenção hiPSC-CM às placas de 35 mm.
      NOTA: Recomenda-se colocar uma ponta não filtrada de 200 μL sobre a pipeta de aspiração de 2 mL para remover o meio gasto para evitar o toque nas células.
    3. Altere o meio de cultura hiPSC-CM a cada 2 dias antes da gravação.
  4. Aquisição de dados
    1. Realizar a medição do potencial de ação pelo menos 10 dias após o chapeamento (recomendado). Preparar a solução fresca de Tyrode, conforme descrito no passo 1.4. Descongelar uma alíquota de solução de pipeta intracelular e adicionar MgATP a uma concentração final de 3 mM.
    2. Puxe as micropipetas dos capilares de vidro borossilicato usando um puxador de micropipeta.
      NOTA: É preferível uma resistência de 2-5 MΩ das micropipetas.
    3. Substitua o meio de manutenção hiPSC-CM pela solução de Tyrode e deixe que as células se acostumem à solução de Tyrode por 15 minutos (Figura 4C). Insira os sensores de temperatura na câmara, coloque o prato de 35 mm na câmara, como mostrado na Figura 4C, e ajuste a temperatura para 37 °C (Figura 4D).
    4. Encher as micropipetas com solução intracelular e inseri-las no suporte ligado ao headstage do amplificador patch-clamp (Figura 4E). Abra o software de estimulação/aquisição, carregue o protocolo de gravação do potencial de ação e selecione a configuração de pinça de tensão.
    5. Insira a micropipeta na solução de banho, selecione os hiPSC-CMs únicos apropriados e ajuste e diminua a posição da micropipeta ao lado da célula selecionada usando um micromanipulador. Quando a ponta da pipeta for inserida na solução de banho, verifique se há resistência da pipeta que pode ser observada no monitor do osciloscópio.
    6. Posicione a pipeta perto da célula e os pulsos de corrente diminuirão ligeiramente para refletir a crescente resistência à vedação. Aplique uma sucção suave com pressão negativa para aumentar a resistência, que formará um gigaseal. Aplique a função Selar .
    7. Aplique sucção adicional para quebrar a membrana para obter uma configuração de gravação de célula inteira. Uma vez que a porção da membrana dentro da área da pipeta é rompida por sucção, a solução interna está em equilíbrio com o citoplasma celular. Neste ponto, mude do modo de grampo de tensão (grampo em V) para o modo de grampo de corrente ou sem injeção de corrente (C-Clamp) usando a caixa de diálogo do amplificador. Pressione o botão Gravar para gerar e salvar os possíveis arquivos de gravação da ação.
      NOTA: A mudança de modo fornece um registro contínuo dos potenciais de ação espontânea de hiPSC-CMs através de nenhum gatilho e nenhum protocolo de gravação de estimulação, que pode ser monitorado na saída V-mon do amplificador patch-prancha.

5. Medição do transiente hiPSC-CM Ca2+

  1. Consulte o protocolo anterior para preparar câmaras celulares personalizadas para imagens Ca 2+ 21. Para a preparação da câmara celular revestida de matriz de membrana basal, coloque 200 μL de solução de revestimento de matriz extracelular nas câmaras celulares. Incubar as câmaras celulares em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
  2. Realizar dissociação enzimática de hiPSC-CMs conforme descrito na etapa 2.2.
  3. Semeadura hiPSC-CMs
    1. Remova a solução de revestimento da matriz extracelular das câmaras celulares. Semear 20.000 células por poço em 200 μL de meio de semeadura hiPSC-CM.
    2. Substitua o meio de semeadura hiPSC-CM por 200 μL de meio de manutenção hiPSC-CM 1 dia após o revestimento. Altere o meio de manutenção hiPSC-CM a cada 2 dias antes da gravação.
  4. Aquisição de dados
    1. Realize a medição transitória de Ca2+ pelo menos 10 dias após o revestimento (recomendado). Preparar a solução fresca de Tyrode, conforme descrito no passo 1.4. Preparar a solução de carregamento Fura-2 AM fresca, conforme descrito no passo 1.6.
    2. Aspirar o meio de manutenção hiPSC-CM e lavar com a solução de Tyrode's duas vezes. Aplicar 100 μL de solução de carregamento Fura-2 AM e incubar por 10 min no RT.
    3. Substitua a solução de carregamento Fura-2 AM pela solução da Tyrode e aguarde pelo menos 5 minutos para a desesterificação completa da Fura-2 AM.
    4. Adicione uma gota de óleo de imersão na objetiva de 40x de um microscópio de epifluorescência invertida equipado com uma objetiva de imersão em óleo de 40x (0,95 NA). Coloque a câmara celular no adaptador de palco do microscópio (Figura 5A).
    5. Instale os fios do controlador de temperatura na câmara de banho e defina-a para 37 °C. Instale os eletrodos de estimulação de campo elétrico e ajuste os pulsos em 0,5 Hz com uma duração de 20 ms.
    6. Ligue a fonte de luz de comutação de comprimento de onda de ultra-alta velocidade e configure-a para o modo de comutação rápida de 340 nm e 380 nm, de acordo com as instruções do instrumento.
    7. Aplique um tempo de exposição de 20 ms para ambos os comprimentos de onda e um tempo de gravação de 20 s no software. Grave o vídeo refletindo as mudanças em tempo real do transiente Ca2+ em CMs hiPSC. Exporte os dados para uma planilha e analise os dados conforme descrito anteriormente23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve como medir o movimento de contração, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+ de CM-hiPSC. Um diagrama esquemático incluindo a digestão enzimática, a semeadura celular, a manutenção e a condução do ensaio funcional é mostrado na Figura 1. A formação da monocamada hiPSC-CM é necessária para a medição do movimento de contração (Figura 2B). Um traço representativo do movimento de contração-relaxamento dos CM-h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A tecnologia iPSC humana emergiu como uma plataforma poderosa para modelagem de doenças e triagem de medicamentos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir a contratilidade do hiPSC-CM, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+. Este protocolo fornece uma caracterização abrangente da contratilidade e eletrofisiologia do hiPSC-CM. Esses ensaios funcionais têm sido aplicados em múltiplas publicações do nosso grupo 12,13,18,24,25,26,27.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. é co-fundador da Greenstone Biosciences, mas não tem interesses concorrentes, pois o trabalho apresentado aqui é completamente independente. Os demais autores declaram não haver interesses concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Blake Wu pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 e NASA NNX16A069A (JCW), e AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Prato de fundo de vidro de 35 mm com vidro de cobertura de micropoço #1.5 de 20 mmCellvisD35-20-1.5-NPatch clamp
50x suplementos B27Life Technologies17504-044hiPSC-CM meio de cultura
6 poços placa de culturaE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM cultura
96 poços fundo plano transparente poliestireno preto microplacas tratadas com TCCorning3603Medição de movimento de contração
AccutaseSigma-AldrichA6964Dissociação enzimática
Axion's Integrated Studio (AxIS)Axion Biosystemssoftware de navegação
Capilares de vidro borossilicatoHarvard ApparatusBF 100-50-10,Grampo de remendo
CaCl2 1 M in H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' s solução
Corrediças de câmara de contagem de célulasThermoFisher ScientificC10228Contagem de células
Placas MEA de 48 poçosAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Meio de matriz extracelular
DPBS, sem cálcio, sem magnésioFisher Scientific14-190-250
EGTApipeta intracelularSigma-AldrichE3889
EPC 10 USB  amplificador de patch clampWarner Instruments89-5000Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeantThermoFisher ScientificF1221Ca2+ medição transitória
GlicoseSigma-AldrichG8270Tyrode' solução HEPES
Sigma-AldrichH3375Tyrode' solução
hiPSCsStanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode' s solução
KnockOut Serum ReplacementThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM meio de semeadura
KOH 8  MSigma-AldrichP4494Solução de pipeta intracelular
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ medição transitória; fonte de luz de comutação de comprimento de onda de ultra-alta velocidade
Contador de células de fluorescência automatizado Luna-FLWISBIOMEDLB-L20001Contagem de células
Maestro Pro  Sistema MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG) Matriz da Membrana BasalCorning356231Meio de matriz extracelular
MgATPSigma-AldrichA9187Solução de pipeta intracelular
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s solução
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s solução
NaOH 10  MSigma-Aldrich72068Tyrode' s
solução NIS Elements AR
Pluronic F-127 (solução a 20% em DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ medição transitória
RPMI 1640 meiode cultura Life Technologies11875-119hiPSC-CM
Sony SI8000 Cell Motion Imaging SystemSony BiotechnologyMedição de movimento de contração
Extrator de micropipetasSutter InstrumentsP-97Patch clamp
Mancha azul tripanoLife TechnologiesT10282Contagem de células
de Solução de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216(2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345(2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628(2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859(2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117(2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662(2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565(2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles