Method Article

Mapeando a densidade absoluta de DNA em núcleos celulares usando microscopia de localização de molécula única

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve um método que mede as densidades absolutas de DNA dentro de núcleos de células aderentes usando tesselação de Voronoi de dados de microscopia de localização de molécula única, volume conhecido, tamanho do genoma e estágio do ciclo celular.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dentro do núcleo da célula, os genes silenciosos geralmente estão localizados em áreas de cromatina de alta densidade chamadas heterocromatina, enquanto os genes ativos podem ser encontrados principalmente na interface entre a cromatina e o espaço intercromatina chamado eucromatina. Atualmente, a caracterização da eu- e heterocromatina é baseada principalmente em modificações epigenéticas de proteínas histonas ao longo da sequência de DNA, enquanto pouco se sabe sobre densidades absolutas de DNA em todo o núcleo celular e suas implicações funcionais. Modelos do núcleo baseados exclusivamente em dados bioquímicos e suposições sobre a natureza da cromatina como polímero ainda diferem fundamentalmente dos dados de imagem gerados por microscopia de alta resolução. Isso indica que ainda faltam informações importantes e estruturalmente relevantes. Acreditamos que restrições espaciais podem estar envolvidas na regulação gênica e, portanto, desenvolvemos um método que permite a medição de densidades absolutas de DNA em núcleos de células de mamíferos, transformando dados de localização de super-resolução em mapas de densidade em escala real por tesselação de Voronoi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desde os primórdios da biologia celular, o núcleo celular - a sede da informação genética - fascinou os biólogos. Depois de aplicar métodos de coloração citológica autodesenvolvidos, Emil Heitz descobriu, em 1928, áreas intensamente coradas de forma diferente dentro do núcleo da célula1. Ele chamou as áreas densas e mais intensamente coradas de "heterocromatina", enquanto chamou as áreas menos densas e menos coradas de "eucromatina". Com o tempo, tornou-se aparente que os genes ativos estão localizados principalmente na eucromatina, enquanto áreas mais densas foram encontradas como ricas em elementos repetitivos e genes silenciosos. Os termos heterocromatina e eucromatina sobreviveram até os dias atuais, embora sua definição tenha mudado de propriedades estruturais para moleculares (veja abaixo). Hoje sabemos que o núcleo da célula é dividido em duas fases principais. Um líquido (o compartimento de intercromatina), que abriga os corpos nucleares, o compartimento de splicing e o nucleoplasma, e o outro sólido, semelhante ao hidrogel, o domínio da cromatina, que inclui os territórios cromossômicos e os nucléolos2. Na interface com o espaço intercromatina, a cromatina é menos densa, e é aqui que ocorrem principalmente os processos geneticamente ativos, como transcrição, replicação e reparo 3,4,5, enquanto adjacente à lâmina, ao redor dos nucléolos e perto dos centrômeros, a cromatina mostra altos níveis de compactação e é, em geral, transcricionalmente bastante inativa6.

No nível molecular, a cromatina é construída a partir do DNA enrolado em nucleossomos (um octâmero das proteínas histonas centrais). As histonas possuem domínios de cauda intrinsecamente desordenados que podem ser modificados pós-traducionalmente pela adição de vários grupos químicos (metil-, acetil, fósforo-, biotina), aminoácidos (arginina) ou mesmo proteínas (SUMO, Ubiquitina)7. Essas modificações podem ser lidas e atrair outras proteínas (por exemplo, remodelador de cromatina, HP1, proteínas de reparo, RNA) e, assim, definir o estado fisiológico da sequência de DNA (transcricionalmente permissivo/restritivo), sem alterar diretamente sua sequência (portanto, "epi" genética)7. O tipo e o número de modificações em torno de uma sequência específica podem diferir profundamente entre os tipos de células, são reversíveis e podem mudar ao longo do desenvolvimento, senescência e doença 8,9,10. Existem modificações nas caudas das histonas que são mais prevalentes em regiões altamente transcritas e modificações que predominam em regiões do genoma que têm pouca ou nenhuma atividade transcricional.

Por exemplo, regiões altamente transcritas que são ricas em modificações de H3K4 ou cujas caudas de histonas são acetiladas são geralmente descritas como eucromatina, enquanto áreas ricas em modificações repressivas de histonas (H3K9me3, H3K27me3 ou H4K20me3) são chamadas de heterocromatina, que é dividida em heterocromatina constitutiva (transcricionalmente inativa em todas as células) (por exemplo, H4K20me3) e heterocromatina facultativa (cromatina silenciada dependendo do tipo de célula, por exemplo, H3K27me3)6. Embora os métodos bioquímicos e biológicos moleculares sejam muito adequados para medir mudanças químicas no nível da sequência, é muito mais desafiador usá-los para fazer declarações sobre propriedades espaciais na mesoescala usando esses métodos.

Por exemplo, foram feitas tentativas usando informações de proximidade de experimentos Hi-C, que detectam e mapeiam proximidades de DNA entre regiões de sequência, para reconstruir modelos espaciais do genoma11. No entanto, a comparação direta com imagens de luz de alta resolução e microscopia eletrônica mostra que isso só é possível de forma limitada (Figura 1). Embora métodos como o Hi-C12 possam detectar territórios cromossômicos em células interfásicas corretamente como entidades separadas, esses modelos são bastante "míopes", porque as proximidades da sequência de DNA por si só são cegas para refletir as relações espaciais entre partes mais distantes do genoma e, portanto, não são muito adequados para uma reconstrução adequada do genoma 3D. Portanto, as diferenças de densidade também não podem ser refletidas adequadamente pelas informações de frequência de contato. Isso leva a representações "espaguetificadas" do genoma no núcleo (ver Figura 1B), que parecem ocorrer em uma bola de lã, laços de livre acesso.

Para abrir caminho para uma imagem integrativa e mais realista do núcleo que combine informações bioquímicas com dados biofísicos e estruturais, é necessário desenvolver métodos que permitam gerar dados sobre diferentes aspectos da organização nuclear. Até recentemente, também era difícil determinar densidades absolutas de DNA em núcleos celulares a partir de dados de imagem. As razões para isso foram a resolução limitada dos microscópios de luz convencionais, problemas na microscopia eletrônica para corar especificamente o DNA e os pequenos volumes de observação na microscopia eletrônica.

A resolução dos microscópios de fluorescência convencionais é limitada pela difração da luz. A imagem de uma fonte pontual de luz é espalhada devido ao limite de difração e pode ser descrita pela Point-Spread-Function (PSF). De acordo com o PSF, a imagem de um fluoróforo, que pode ser considerada em boa aproximação como uma fonte pontual de luz, ocupa um volume de um determinado tamanho em torno de sua fonte de origem (fluoróforo)13. Quando muitos fluoróforos, localizados muito mais próximos uns dos outros do que as dimensões de suas imagens limitadas por difração, são excitados simultaneamente, as distribuições de intensidade da imagem são sobrepostas e a localização dos fluoróforos únicos não pode ser resolvida. A emissão de luz sequencial e estocástica de fluoróforos (piscando) permite o isolamento óptico de moléculas individuais e, assim, encontrar suas localizações exatas determinando os centros de gravidade de intensidade de seus sinais.

Isso pode ser usado para reconstruir informações estruturais de amostras pelo acúmulo de dados de localização de fluoróforos de muitas imagens gravadas. Este método é geralmente referido como microscopia de localização de molécula única (SMLM) (para mais informações, consulte14). Quanto mais fótons um fluoróforo emite durante seu 'on-time', mais precisamente os centros de gravidade podem ser determinados. As lentes astigmáticas no caminho do feixe transformam os sinais de fluoróforos acima ou abaixo do plano focal óptico em elipses, que podem ser usadas para determinar sua posição ao longo do eixo óptico. Os eixos longos das elipses originadas de sinais fluorescentes abaixo do plano focal são girados em 90° em comparação com os eixos das elipses originadas de fluoróforos acima do plano focal. Além disso, a razão de eixos dessas elipses permite determinar a posição da molécula ao longo do eixo óptico em relação ao plano focal dentro de uma faixa de ±300 nm15.

A qualidade das imagens de super-resolução geradas pela reconstrução de eventos de piscar estocásticos depende fortemente da densidade de rotulagem e do número de eventos de piscar. Estes últimos dependem da fotoestabilidade dos fluoróforos e do número de eventos intermitentes antes de eventualmente falharem (número de ciclos liga/desliga). O método descrito aqui para obter imagens de super-resolução da distribuição intranuclear do DNA é denominado fBALM (microscopia de localização ativada por ligação assistida por flutuação da estrutura do DNA). É baseado em fluoróforos que transitoriamente se intercalam em ácidos nucléicos e só fluorescem quando estão ligados ao DNA16,17. Devido aos resíduos carregados de sua estrutura de fósforo-diéster, o DNA é um polímero altamente carregado negativamente. A estabilização das fitas complementares de DNA em células vivas requer neutralização por proteínas carregadas positivamente (por exemplo, histonas) e íons. Ao diminuir o pH, a estabilidade do emparelhamento complementar das bases é reduzida para permitir que os corantes intercalantes se difundam para dentro e para fora16,17.

Dependendo do corante fluorescente intercalante, esse estado pode ser alcançado dentro de uma determinada faixa de pH. Corantes fluorescentes como YoYo-1 e SYTOX Orange só fluorescem quando ligados ao DNA e porque os corantes intercalantes (em contraste com os corantes que ligam o sulco menor do DNA, como Hoechst e 4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) geralmente se ligam de maneira independente da sequência, eles são adequados para mapear a distribuição do DNA dentro dos núcleos das células por microscopia de localização.

A tesselação de Voronoi é um método matemático que permite a subdivisão do espaço em diferentes partições com base na localização dos pontos. No espaço 2D, o tamanho dos ladrilhos resultantes reflete o inverso da densidade dos pontos18. Como a microscopia de localização reconstrói as imagens como um conjunto de pontos que representam a localização dos fluoróforos, a tesselação de Voronoi pode ajudar a determinar a densidade dos sinais de localização (Figura 2). Assim, o uso de um corante específico de DNA como fluoróforo permite medir as densidades de DNA.

O conhecimento a priori do conteúdo de DNA (número de pares de bases) e da dimensão espacial do núcleo permite a transformação das densidades relativas de DNA em densidades absolutas de DNA. O protocolo a seguir mostra o mapeamento das densidades absolutas de DNA em células aderentes usando SMLM em uma resolução muito alta e demonstra que essas densidades estão sujeitas a grandes variações.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: A Figura 3 fornece uma visão geral do fluxo de trabalho descrito nesta seção. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados aos reagentes, materiais, equipamentos e software usados neste protocolo. O código usado para esta publicação pode ser visualizado e baixado aqui: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Cultura de células

  1. Cultivar células C3H10T1/2, HFB e HeLa em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino a 37 °C em atmosfera umidificada suplementada com 5% de CO2. Quando as células estiverem próximas da confluência, subcultive as células dividindo-as na proporção de 1:3 (C3H10T1/2, HFB) e 1:10 (HeLa), respectivamente.
  2. Um dia antes de realizar as medições, semeie as células de culturas de crescimento exponencial em um prato quadriculado de 35 mm. Certifique-se de que os pratos de observação forneçam excelente qualidade óptica para microscopia de fluorescência (fundo de vidro com espessura de 170 μm, # 1,5) e possuam uma grade para localizar as células de forma inequívoca. Certifique-se também de que as células estão em uma suspensão unicelular e que toda a área da superfície do prato está coberta homogeneamente com células.
    NOTA: Recomenda-se usar pratos com uma grade impressa para encontrar novamente as células exatas que foram atribuídas a um determinado estágio do ciclo celular.
  3. Se o experimento exigir, adicionar 100 nM de trichostatin A (TSA) ao meio de cultura celular e incubar as células nas condições descritas anteriormente na etapa 1.1.

2. Preparação da amostra

  1. No dia da medição, lave as células uma vez com 1x DPBS antes de fixá-las por 30 min em paraformaldeído a 4% (PFA) em 1x DPBS.
    NOTA: Para resultados reprodutíveis, certifique-se de que uma nova solução de PFA seja preparada a cada vez e tome cuidado especial para que a concentração de PFA seja precisa.
  2. Após remover o fixador, lave as células novamente 2x com 1x DPBS antes de permeabilizá-las por 20 min em 1x DPBS contendo 0,4% de Triton X-100.
  3. Remova o tampão de permeabilização com uma pipeta e execute uma etapa de lavagem adicional com 1x DPBS antes de tratar as células com um coquetel de RNase (diluição 1:1.000 em 1x DPBS). Colocar as células numa incubadora durante 30 min a 37 °C numa câmara humidificada.
  4. Prepare a solução de coloração diluindo a solução estoque SYTOX Orange compatível com fBALM (5 mM em 1x DPBS na diluição de 1:10.000).
  5. Remova o tampão RNase usando uma pipeta e aplique uma etapa de lavagem adicional com 1x DPBS antes de adicionar a solução de coloração. Incube as células à temperatura ambiente em uma câmara umidificada por 5 min.
  6. Remova a solução de coloração SYTOX Orange das células com uma pipeta, lave com 1x DPBS e armazene as células em 1x DPBS, protegidas da luz intensa.

3. Determinação do ciclo celular citométrico

NOTA: Para esta etapa, um microscópio de triagem invertido de alto conteúdo foi usado aqui, mas qualquer microscópio de fluorescência de campo amplo inverso automatizado pode ser usado. A intensidade de todo o núcleo é uma medida de seu conteúdo de DNA; Portanto, certifique-se de abrir completamente o orifício se estiver usando um sistema confocal. As lentes de ar objetivas de baixa abertura numérica (NA) são preferíveis às lentes objetivas de imersão em óleo.

  1. Coloque o prato com as células em um microscópio de fluorescência inversa equipado com uma platina motorizada e um software que permite a reconstrução de grandes áreas na amostra costurando imagens gravadas automaticamente.
  2. Escolha uma lente objetiva que permita o registro de células suficientes por campo de visão (pelo menos 900 núcleos únicos no total [para detalhes, ver Roukos et al.19]) para que a aquisição de imagens para a determinação do ciclo celular possa ser realizada dentro de um tempo razoável. Use uma lente que não mostre grandes diferenças de intensidade entre o centro e as bordas. Se essa lente não estiver disponível, aplique uma correção de campo plano às imagens (consulte a etapa 7). Para seguir este protocolo, use um microscópio de fluorescência de campo amplo equipado com uma lente de ar 20x NA 0,4 com profundidade de foco = 8 μm.
  3. Durante a aquisição da imagem, cubra a área central do prato usando filtros apropriados para o fluoróforo usado. Tire imagens de campo claro no modo de luz transmitida.
    NOTA: As imagens de campo claro são importantes para a realocação de células na grade na etapa 4.6.
  4. Coloque o prato com as células no frigorífico a 4 °C até ao passo 4.4.
  5. Reconstrua a área digitalizada a partir das imagens individuais juntando as imagens individuais gravadas.
  6. Transfira os dados da imagem da coloração de DNA fluorescente para um computador que execute o software de código aberto CellProfiler4.2.120.
  7. Se for necessária uma correção de campo plano das imagens de fluorescência, gere uma imagem de referência do microscópio usado a partir das imagens gravadas. Abra o pipeline Illumination Correction.cpproj (incluído como Arquivo Suplementar 1); Observe que o pipeline aparece como uma sequência na tela na qual diferentes etapas podem ser clicadas. Arraste e solte as imagens no campo designado nas imagens da primeira etapa do pipeline.
    NOTA: Certifique-se de excluir todos os dados que não sejam de imagem nos arquivos listados usando as opções de filtro na parte inferior da janela.
  8. Na última etapa do pipeline de correção de iluminação, clique em Salvar imagens para definir um local onde as imagens de referência serão armazenadas e, em seguida, clique no botão Analisar imagens .
  9. Abra o pipeline CellCycleAnalysis.cpproj (incluído como Arquivo Suplementar 2). Arraste e solte as imagens gravadas na etapa 3.3 (consulte a Figura 4A como exemplo), incluindo a imagem de referência (etapa 3.8), no campo designado na primeira etapa Imagens da tubulação.
    NOTA: Certifique-se de excluir todos os dados que não sejam de imagem nos arquivos listados usando as opções de filtro na parte inferior da janela.
  10. Na etapa CorrectIlluminationApply do pipeline, escolha a imagem de referência no menu suspenso selecionando a função Selecionar a iluminação.
  11. Na última etapa do pipeline de análise do ciclo celular, defina um local onde a imagem de referência foi armazenada na etapa 3.7 e clique no botão Analisar imagens para começar a medir em massa as intensidades de fluorescência integradas de todos os núcleos nas imagens registradas na etapa 3.3.
    NOTA: O CellProfiler4.2.1 gerará um arquivo de texto "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt", que contém os dados de cada núcleo medido (Image, ObjectID, intensidade de fluorescência integrada, coordenadas de imagem) no formato CSV.
  12. Verifique se o elemento DisplayHistogram do pipeline está marcado como ativo.
  13. Observe as intensidades de fluorescência integradas no histograma para os picos G1 e G2 (consulte a Figura 4B como exemplo) e insira os intervalos em torno deles nos elementos FilteredObjects do pipeline. Ative os elementos da tubulação clicando nas caixas de seleção.
  14. Ative os elementos de pipeline DisplayDataOnImage correspondentes para gerar uma imagem realçando as células na fase G1 ou G2 e execute o pipeline novamente (consulte a Figura 4C como exemplo).
  15. Escolha até cinco células representando a fase do ciclo celular desejada a partir da imagem gerada na área marcada da câmara de observação e tente realocar as células no microscópio SMLM.
    NOTA: Uma vez que duas linhagens celulares com tamanho de genoma desconhecido são usadas aqui, os tamanhos do genoma foram determinados comparando os picos G1 de uma linha celular de fibroblastos humanos com os picos G1 de células HeLa e C3H10T1/2. Os histogramas e a relação proporcional entre seus tamanhos de genoma podem ser visualizados na Figura Suplementar S1.

4. SMLM-fBALM

NOTA: Embora a soma líquida de oxigênio nessas reações bioquímicas combinadas seja zero, recomenda-se realizar a reação em um prato que não esteja selado, pois concentrações limitadas de oxigênio podem retardar a produção de D-glucono-1,5-lactona. O aumento da concentração de D-glucono-1,5-lactona reduz gradualmente o pH, o que é necessário, pois uma redução imediata do pH alterará a ultraestrutura da amostra.

  1. Prepare 1 mL do tampão de imagem misturando os seguintes ingredientes: 900 μL de glicose (1 g/mL de glicose em 1x DPBS), 50 μL de glicose oxidase (0,5 mg/mL em 1x DPBS) e 50 μL de catalase (40 μg/mL em 1x DPBS).
  2. Remova o 1x DPBS da amostra usando uma pipeta e adicione 1 mL do tampão de imagem no prato que contém as células.
  3. Monte a placa no palco de um microscópio compatível com SMLM. Use uma lente objetiva de alta abertura numérica e uma alta ampliação óptica.
  4. Localize um dos núcleos escolhidos (da etapa 3.15) usando o sistema de coordenadas da antena e centralize-o no campo de view da câmera.
    NOTA: A reação enzimática leva ~ 60-180 min até que o pH correto para o método fBALM seja atingido e facilite o piscar apropriado. Recomenda-se montar o prato de observação o mais rápido possível para dar tempo suficiente para que a amostra se ajuste à temperatura do instrumento, pois as mudanças de temperatura podem levar ao desvio axial. Certifique-se de que a temperatura na sala que abriga o microscópio SMLM seja estável durante toda a medição.
  5. Determine a altura do núcleo alterando o foco com o z-drive do microscópio e registrando a posição dos limites superior e inferior.
  6. Em diferentes momentos, verifique se há piscadas adequadas produzidas pelo processo fBALM aumentando a potência do laser. Uma vez que a amostra mostre um piscar estocástico adequado, comece a aquisição da série de imagens necessária para a reconstrução do SMLM super-resolvido.
    NOTA: O microscópio usado para fBALM deve ser equipado com lasers de excitação adequados para excitar o fluoróforo usado e que podem gerar densidades de fótons suficientemente altas para garantir contagens de fótons suficientes por quadro. Teste isso em um experimento piloto antes de todos os outros experimentos.
  7. Uma vez que o piscar adequado do processo fBALM tenha sido garantido, comece a aquisição da série de imagens usando um tempo de exposição de 50 ms, resultando em uma taxa de quadros de ~ 20 fps.
  8. Pegue uma pilha z através do núcleo (em torno da seção intermediária) com intervalos de passo de 200 nm e apenas 500 quadros por seção óptica leve. De volta à seção intermediária, pegue uma série de imagens de 50.000 quadros para coletar eventos piscando suficientes para uma boa reconstrução de detalhes estruturais com alta precisão de localização (isso levará ~ 45 min).
    NOTA: A pilha z é importante para determinar a fração da seção intermediária do sinal de DNA em relação a todo o núcleo. Certifique-se de que o tamanho efetivo do pixel seja adequado para SMLM22 e que o sinal na câmera não sature o sensor.
  9. Certifique-se de que os seguintes requisitos sejam atendidos
    1. Certifique-se de que o computador de aquisição contenha espaço em disco suficiente, pois, dependendo do número e do tamanho das imagens de 16 bits, os tamanhos dos arquivos das pilhas de imagens podem se tornar muito grandes.
    2. Certifique-se de que o computador que executa o software de aquisição possa lidar com um sistema de arquivos no dispositivo de armazenamento usado capaz de lidar com arquivos grandes (>4 GB) e que a taxa de transferência para o dispositivo de armazenamento seja suficientemente alta para gravar os arquivos em tempo real ao gravar dados de imagem diretamente no dispositivo de armazenamento.
    3. Ao salvar os dados após a aquisição da imagem, certifique-se de que o computador esteja equipado com RAM suficiente (por exemplo, 64 GB).

5. Preparação e gravação de um prato com esferas fluorescentes para calibração z do microscópio SMLM

NOTA: Para uma calibração axial adequada das lentes astigmáticas do microscópio para atribuir localizações corretas ao longo do eixo óptico, deve-se considerar o registro de pilhas z de esferas fluorescentes de 100 nm.

  1. Dilua os grânulos 1:10.000 em 1x DPBS e semeie os grânulos de 100 nm no mesmo tipo de prato usado para as medições SMLM.
    NOTA: Use apenas a melhor qualidade óptica e especificações, como lamínulas #1.5.
  2. Monte o prato de calibração no microscópio; Registre as pilhas de imagens através do plano focal das contas (~ 1,5 μm no total; etapas de 10 nm usadas aqui) 15 .
  3. Transfira os dados para o computador de análise de dados.
    NOTA: Não armazene e use as lâminas de calibração por muito tempo.

6. Processamento de dados SMLM

NOTA: O plug-in ImageJ23 "ThunderSTORM"24 foi usado para o registro das localizações (por exemplo, conversão dos pontos piscantes na pilha de imagens em uma lista contendo coordenadas de localização, número do quadro, etc.). O ImageJ ou Fiji25 é executado em todos os principais sistemas operacionais de desktop (Linux/Windows/macOS) e pode ser baixado e usado gratuitamente.

  1. Para usar o ThunderSTORM em FijI, certifique-se de adicionar o site de atualização do Hohlbein Lab em AJUDA | Atualização | Gerenciar sites de atualização, marque a caixa de seleção do Hohlbein Lab e reinicie Fiji. Certifique-se de que o programa tenha acesso a memória suficiente.
    NOTA: Os dados da imagem precisam estar em um formato de arquivo que possa ser lido pelo ImageJ/Fiji. Ao gravar os dados em um sistema comercial padrão, abra diretamente os dados usando o plug-in Bio-Formats para ImageJ (que vem automaticamente com o Fiji). Neste caso, um script MATLAB h52tif.m (fornecido na página do GitHub mencionada no início do protocolo) foi usado para converter os dados gravados por nossa configuração personalizada do formato hdf5 para o formato TIFF.
    1. Dependendo da quantidade de memória disponível no sistema usado e do número de quadros a serem gravados, divida os dados em várias subpilhas para evitar ficar sem memória.
      NOTA: A seguir, as configurações que foram usadas para extrair os dados mostrados na seção de resultados estão sendo usadas. Para obter uma explicação mais detalhada das configurações do ThunderSTORM, consulte os tutoriais do ThunderSTORM, que podem ser encontrados online.
  2. Otimize as configurações para a detecção de sinais piscando adaptando as configurações do ThunderSTORM de acordo com as condições de gravação desejadas. Clique em ThunderSTORM | Execute a análise, escolha Configuração da câmera e insira o tamanho correto dos dados da imagem, a contagem A/D, a eficiência quântica da câmera usada, o nível base e o ganho EM (para esta configuração, tamanho do pixel: 65 nm, contagem A/D: 0,64, eficiência quântica: 0,8).
  3. Em seguida, escolha o algoritmo para determinar as coordenadas de localização ajustando os sinais piscando. Na seção Filtragem de imagem , use o filtro Wavelet (B-Spline) com uma ordem B-Spline 3 e uma escala B-Spline 2.0. Para as outras configurações, defina o método de localização aproximada de moléculas como Máximo local, Limite de intensidade de pico como 2*std(Wave.F1) e Conectividade como 8 vizinhanças. Na seção Localização de subpixel de moléculas , escolha PSF: Gaussiano integrado, Raio de ajuste [px]: 3, Método de ajuste: Máxima verossimilhança e Sigma inicial [px]: 1,6.
  4. Execute o plug-in para criar uma tabela contendo uma entrada para cada localização detectada e suas propriedades. Salve a tabela no disco rígido.
  5. Se várias pilhas de imagens precisarem ser analisadas ou as pilhas de imagens tiverem que ser divididas em várias pilhas (por exemplo, para permitir a análise de grandes conjuntos de dados ou caso não haja muita memória disponível no computador de análise de dados), automatize a detecção de localização executando uma macro.
  6. Se os dados de aquisição tiverem que ser particionados em várias pilhas de imagens, concatene as tabelas de localização no ThunderSTORM importando um arquivo após o outro. Certifique-se de que a opção Anexar à tabela atual no menu Importar esteja ativada e que o número inicial correto seja usado para evitar a substituição de localizações na tabela.
  7. Depois que a tabela de localização completa for gerada, verifique o resultado reconstruindo a imagem a partir dos locais na tabela de resultados. Pressione o botão Visualização na janela de resultados do ThunderSTORM e aguarde até que a imagem reconstruída (por exemplo, histograma das localizações) apareça.
  8. Verifique a imagem reconstruída em busca de problemas como desvio lateral e outros artefatos de imagem. Meça e corrija o desvio no submenu Desvio determinando a correlação cruzada das subseções somadas da pilha de dados (usada aqui) ou usando marcadores fiduciais na amostra. Depois de pressionar o menu >> , insira 5 compartimentos e o fator de ampliação (6,5 neste protocolo). Aguarde até que uma janela apareça mostrando o desvio x e y.
    NOTA: As primeiras imagens após a gravação ainda podem sofrer de uma forte fluorescência de fundo (ao mesmo tempo em que trazem os fluoróforos para o estado escuro); portanto, pode ser necessário excluir as primeiras centenas de imagens da análise (por exemplo, digite "quadro >500" no campo Filtro na janela principal do ThunderSTORM).
  9. Para evitar a contagem excessiva de sinais visíveis em vários quadros consecutivos, aplique a mesclagem aos dados de localização usando um raio que considere a precisão média de localização (20 nm aqui), 1 quadro escuro e 0 quadros máximos (sem restrição no tempo máximo de ativação de uma molécula).
  10. Se apenas uma seção ultrafina óptica de luz fina precisar ser analisada, exclua todas as localizações acima e abaixo do plano focal do conjunto de dados. Primeiro, procure o ponto em z que contém a maior parte da localização pressionando Plotar histograma na janela que contém a tabela de resultados e, em seguida, descarte as localizações 50 nm acima e abaixo desse ponto usando o comando de filtragem:
    z > "pico do histograma" - 50 & z < "pico do histograma" + 50
  11. Para determinar a fração de DNA na seção registrada, determine as localizações em cada plano da pilha de imagens (espessura de 200 nm; 100 nm de cada lado) registradas na etapa 4.7.1. Abra a primeira tabela de resultados de localização da pilha escolhendo plug-ins | Tempestade de trovão | Importação/Exportação | Importe os resultados e filtre cada fatia gravada para 200 nm. Para isso, clique em Aplicar após digitar no campo de filtro:
    z > -100 & z < 100
  12. Clique em Visualização e escolha a opção Histogramas para gerar uma imagem de cada fatia. Salve a imagem resultante em uma pasta no formato TIFF. Feche todas as imagens abertas. Repita isso para todos os planos de imagem.
  13. Abra todas as fatias e combine-as usando Imagem | Pilhas | Imagens para empilhar. Escolher imagem | Pilhas | Z-Project e escolha a opção Soma . Abra o ROI Manager no ImageJ (Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI); em seguida, escolha a Ferramenta de seleção de polígono na barra de ferramentas ImageJ na janela principal do ImageJ e contorne o núcleo. Clique em Adicionar no ROI-Manager.
    1. Clique em Analisar | Defina Medidas e selecione Densidade Integrada. Clique em Analisar | Medir. No ThunderSTORM, abra a tabela de resultados do plano central conforme descrito acima e filtre-a para uma espessura de 100 nm usando o seguinte comando no campo de filtro:
      z > -50 & z < 50
  14. Gere um histograma das localizações filtradas conforme descrito acima, ative o ROI definido selecionando-o no ROI Manager e clique em Analisar | Medir.
  15. Determine a fração das localizações na seção intermediária de 100 nm de espessura em relação ao número total de localizações, dividindo as densidades integradas medidas - o fator de conversão necessário na etapa 8.2 para calcular as densidades absolutas de DNA.
    NOTA: O conteúdo de DNA é proporcional ao número de localizações. Para estimar a fração de DNA na imagem de super-resolução (seção intermediária), é suficiente determinar o número total de localizações em todo o volume de todo o núcleo e determinar o número total de localizações na seção de interesse. Isso pode ser feito gerando histogramas 2D das localizações.

7. Calibração Z do microscópio SMLM

  1. Abra as pilhas de imagens gravadas na seção 5 em Fiji.
  2. No menu do plug-in ThunderSTORM, selecione o submenu de calibração 3D | Calibração de lentes cilíndricas.
  3. Insira o tamanho do passo usado para registrar os dados de calibração (10 nm) e defina a área da pilha de imagens que será usada para a calibração.
  4. Especifique um local para salvar o arquivo de calibração.
  5. Use os dados de calibração na janela de diálogo Executar análise selecionando PSF: Gaussiano elíptico (astigmatismo 3D) no painel Localização de subpixel de moléculas e ajustando o caminho do arquivo para o arquivo de calibração criado na seção 5.

8. Tesselação de Voronoi

NOTA: Depois que a tabela de localização for gerada e preparada, prossiga para a última etapa da análise da imagem - a tesselação de Voronoi. Use o MATLAB 2021 para esta etapa; os scripts MATLAB fazem parte do pacote de software "Localization Analyzer for Nanoscale Distributions" (LAND) e podem ser baixados dos links na Tabela de Materiais. Semelhante ao registro dos dados e à geração da tabela de localização, é importante usar um sistema bem equipado com memória e poder de processamento. O sistema usado para gerar as imagens para esta publicação foi equipado com 128 GB de RAM e uma CPU Intel i9 de 9 núcleos.

  1. Converta a tabela de localização do ThunderSTORM do formato .csv para o formato Orte executando o script MATLAB "TS2Orte.m", que transforma a tabela de localização em uma matriz MATLAB e a salva no formato ".mat".
  2. Assim que os dados estiverem no formato correto, inicie os preparativos para a tesselação de Voronoi e o cálculo da densidade de DNA. Calcule o fator de conversão dividindo o número de pares de bases no núcleo pelo número relativo de localizações na seção de imagem em relação ao volume (consulte a etapa 6.15). Vá para a pasta LAND-Voronoi e na subpasta /coreAlgorithm , abra o arquivo voronoiCluster.m e ajuste o fator de conversão para os cálculos de densidade absoluta na linha 13.
    NOTA: Veja a Figura 5 para um exemplo do núcleo G1 HeLa; um fator de conversão de 265 foi medido.
  3. Edite o script que inicia a análise "VonoRoi.m". Ajuste o caminho do arquivo para os dados de localização do Orte e a pasta de saída para os arquivos de resultado. Na lista de coordenadas, especifique as coordenadas que definem a área na qual a suavização de serrilhado deve ser feita. Como a tesselação de Voronoi pode levar muito tempo para ser calculada (dependendo das especificações da máquina usada), defina várias áreas para calcular no mesmo conjunto de dados de entrada.
  4. Depois de executar o script, procure a imagem que mostra as densidades absolutas de DNA junto com outros arquivos contendo gráficos mostrando o histograma da distribuição de área e um arquivo "densities.mat" contendo as densidades de cada célula de Voronoi calculada na pasta de saída.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O núcleo HeLa mostrado na Figura 5 foi escolhido da tabela gerada pelo CellProfiler4.2.1 na seção 3 para ter uma intensidade de fluorescência integrada próxima ao primeiro pico no histograma mostrado na Figura 5 que representa os núcleos na fase G1 . Dado seu pequeno tamanho e estrutura interna pronunciada, é provável que seja um núcleo G1 inicial que ainda está em processo de descondensação de sua cromatin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve como medir densidades absolutas de DNA em núcleos de células de mamíferos usando SMLM. Além disso, demonstramos como determinar o estágio do ciclo celular de células cultivadas e como usar essas informações para estimar a quantidade de DNA presente em uma seção óptica ultrafina leve. Também são descritos em detalhes a preparação de células aderentes para microscopia fBALM SMLM e como processar dados SMLM para gerar imagens microscópicas super-resolvidas de DNA genômi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos à Dra. Sandra Ritz por nos deixar usar o IMB Imaging Core Facility, ao Dr. Shih-Ya Chen por nos permitir usar seu microscópio SMLM personalizado, ao Dr. Leonard Kubben (IMB) por fornecer fibroblastos humanos, ao Dr. Christof Niehrs (IMB) por fornecer a linha celular C3H10T1/2 e ao Dr. Jan Neumann pelo MATLAB-Script que modificamos para este trabalho. Também queremos agradecer ao Dr. Marion Cremer, Dr. Thomas Cremer e Dr. Christoph Cremer pelas discussões frutíferas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cultura Celular
µ-Prato 35 mm, fundo de vidro Grid-500 altoIbidi81168
C3H 10T1/2IMB (Laboratório Niehrs)
DMEMThermoFisher12320032
dPBSThermoFisher14190144
FBSTecnologias de Vida16000-044
HelaInstalação Núcleo de Microscopia (IMB)
HFBIMB (Laboratório Kubben)
L-GlutaminaSigma-AldrichG7513
Aminoácidos e vitaminas não essenciais para HFB
Piruvato de SódioS8636
Preparação de Amostra
CatalaseMerck2593710
GlicoseThermoFisher241922500
Glucose OxidaseMerck49180
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127
RNase CocktailThermoFisherAM2286
SYTOX LaranjaThermoFisherS11368
Kit de Amostragem de Microsferas Fluorescentes TetraSpeckThermoFisherT7284
Triton X-100ThermoFisher327372500
Software
BioFormatosOpenMicroscopy.orgSoftware de código aberto https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgSoftware de código aberto https://cellprofiler.org
Fijinih.govSoftware de código aberto https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
TERRAnih.govSoftware de código aberto https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021Matemática Funcionasoftware comercial - requer "Caixa de Ferramentas de Processamento de Imagens"
R v.4.. 0.3r-project.orgSoftware de código aberto https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3Software de código aberto https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Microscópios:
AF 7000Leica
Leica GSDLeica
Microscópio SMLMLaboratório CremerConstruído sob medida pelo Dr. S-Y. Chen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Passarge, E. Emil Heitz and the concept of heterochromatin: longitudinal chromosome differentiation was recognized fifty years ago. American Journal of Human Genetics. 31 (2), 106-115 (1979).
  2. Cremer, T., Cremer, M. Chromosome territories. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (3), 003889(2010).
  3. Vecchio, L., Solimando, L., Biggiogera, M., Fakan, S. Use of halogenated precursors for simultaneous DNA and RNA detection by means of immunoelectron and immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (1), 45-55 (2008).
  4. Solimando, L., et al. Spatial organization of nucleotide excision repair proteins after UV-induced DNA damage in the human cell nucleus. Journal of Cell Science. 122, 83-91 (2009).
  5. Niedojadlo, J., et al. Transcribed DNA is preferentially located in the perichromatin region of mammalian cell nuclei. Experimental Cell Research. 317 (4), 433-444 (2011).
  6. Padeken, J., Heun, P. Nucleolus and nuclear periphery: velcro for heterochromatin. Current Opinion in Cell Biology. 28, 54-60 (2014).
  7. Zhang, Y., et al. Overview of histone modification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1283, 1-16 (2021).
  8. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Frontiers in Bioscience (Landmark Ed). 25 (6), 1058-1109 (2020).
  9. Saul, D., Kosinsky, R. L. Epigenetics of aging and aging-associated diseases). International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 401(2021).
  10. Eckersley-Maslin, M. A., Alda-Catalinas, C., Reik, W. Dynamics of the epigenetic landscape during the maternal-to-zygotic transition. Nature Reviews, Molecular Cell Biology. 19 (7), 436-450 (2018).
  11. Stevens, T. J., et al. 3D structures of individual mammalian genomes studied by single-cell Hi-C. Nature. 544 (7648), 59-64 (2017).
  12. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  13. Cremer, C., Masters, B. R. Resolution enhancement techniques in microscopy. The European Physical Journal H. 38 (3), 281-344 (2013).
  14. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  16. Szczurek, A., et al. Super-resolution binding activated localization microscopy through reversible change of DNA conformation. Nucleus. 9 (1), 182-189 (2018).
  17. Szczurek, A., et al. Imaging chromatin nanostructure with binding-activated localization microscopy based on DNA structure fluctuations. Nucleic Acids Research. 45 (8), 56(2017).
  18. Levet, F., et al. SR-Tesseler: a method to segment and quantify localization-based super-resolution microscopy data. Nature Methods. 12 (11), 1065-1071 (2015).
  19. Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  21. Team, R. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).
  22. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Maeshima, K., et al. The physical size of transcription factors is key to transcriptional regulation in chromatin domains. Journal of Physics. Condensed Matter. 27 (6), 064116(2015).
  27. Itoh, Y., Woods, E. J., Minami, K., Maeshima, K., Collepardo-Guevara, R. Liquid-like chromatin in the cell: What can we learn from imaging and computational modeling. Current Opinion in Structural Biology. 71, 123-135 (2021).
  28. Strickfaden, H., Xu, Z. Z., Hendzel, M. J. Visualization of miniSOG tagged DNA repair proteins in combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI). Journal of Visualized Experiments. (103), e52893(2015).
  29. Xie, L., et al. BRD2 compartmentalizes the accessible genome. Nature Genetics. 54 (4), 481-491 (2022).
  30. Heo, S. J., et al. Nuclear softening expedites interstitial cell migration in fibrous networks and dense connective tissues. Science Advances. 6 (25), (2020).
  31. Gelléri, M., et al. True-to-scale DNA-density maps correlate with major accessibility differences between active and inactive chromatin. bioRxiv. , (2022).
  32. Derenzini, M., Olins, A. L., Olins, D. E. Chromatin structure in situ: the contribution of DNA ultrastructural cytochemistry. European Journal of Histochemistry. 58 (1), 2307(2014).
  33. Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589, 2931-2943 (2015).
  34. Shah, F. A., Johansson, B. R., Thomsen, P., Palmquist, A. Ultrastructural evaluation of shrinkage artefacts induced by fixatives and embedding resins on osteocyte processes and pericellular space dimensions. Journal of Biomedical Materials Research A. 103 (4), 1565-1576 (2015).
  35. Gavelis, G. S., et al. Dinoflagellate nucleus contains an extensive endomembrane network, the nuclear net. Scientific Reports. 9 (1), 839(2019).
  36. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: a novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801-810 (2009).
  37. Gorisch, S. M., Richter, K., Scheuermann, M. O., Herrmann, H., Lichter, P. Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules. Experimental Cell Research. 289 (2), 282-294 (2003).
  38. Lenart, P., et al. Nuclear envelope breakdown in starfish oocytes proceeds by partial NPC disassembly followed by a rapidly spreading fenestration of nuclear membranes. The Journal of Cell Biology. 160 (7), 1055-1068 (2003).
  39. Verschure, P. J., et al. Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules. EMBO Reports. 4 (9), 861-866 (2003).
  40. Strickfaden, H., et al. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  41. Lin, Y. R., et al. M33 condenses chromatin through nuclear body formation and methylation of both histone H3 lysine 9 and lysine 27. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1868 (11), 119100(2021).
  42. Strickfaden, H., Sharma, A. K., Hendzel, M. J. A charge-dependent phase transition determines interphase chromatin organization. bioRxiv. , (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Density MappingCell NucleiSingle Molecule LocalizationSuper Resolution MicroscopyChromatin StructureVoronoi TessellationFPALM ImagingEpigenetic ModificationsCell Cycle StagesHeterochromatin Euchromatin

Related Articles