Artigo de método

Purificação polissóbica de nódulos simbióticos de soja

DOI:

10.3791/64269

⸱

1 de julho de 2022

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1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, 2Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology, University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um método de purificação de pórsome eucariótico a partir de nódulos de soja intactos. Após o sequenciamento, os dutos padrão para análise de expressão genética podem ser usados para identificar genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e translatome.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo deste protocolo é fornecer uma estratégia para estudar o traduzindo eucariótico do nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este artigo descreve métodos otimizados para isolar poliribos derivados de plantas e seus mRNAs associados a serem analisados usando sequenciamento de RNA. Em primeiro lugar, os licoplasatos citoplasmados são obtidos através da homogeneização em condições de preservação de poliso e RNA de nódulos inteiros e congelados de soja. Em seguida, os lysates são limpos por centrifugação de baixa velocidade, e 15% do supernante é usado para o isolamento total do RNA (TOTAL). O restante do lise limpo é usado para isolar pórsomeos por ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose de duas camadas (12% e 33,5%). O mRNA (PAR) associado ao polissomo é purificado a partir de pelotas polissonais após a ressuspensão. Tanto total quanto PAR são avaliados por eletroforese capilar altamente sensível para atender aos padrões de qualidade das bibliotecas de sequenciamento para RNA-seq. Como exemplo de uma aplicação a jusante, após o sequenciamento, os pipelines padrão para análise de expressão genética podem ser usados para obter genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e tradução. Em resumo, este método, em combinação com o RNA-seq, permite o estudo da regulação translacional de mRNAs eucarióticas em um tecido complexo como o nódulo simbiótico.

Introdução

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Plantas leguminous, como a soja (Glycine max), podem estabelecer simbiose com bactérias específicas do solo chamadas rizobia. Essa relação mutualista provoca a formação de novos órgãos, os nódulos simbióticos, nas raízes das plantas. Os nódulos são os órgãos vegetais que hospedam as bactérias e consistem em células hospedeiras cujo citoplasma é colonizado com uma forma especializada de rizobia chamada bacteroides. Esses bacteroides catalisam a redução do nitrogênio atmosférico (N2) em amônia, que é transferida para a planta em troca de carboidratos 1,2.

Embora essa simbiose fixador de nitrogênio seja uma das simbioses vegetais mais bem estudadas, muitos aspectos continuam sendo melhor compreendidos, como como as plantas submetidas a diferentes condições de estresse abiótico modulam sua interação com seu parceiro simbiótico e como isso afeta o metabolismo do nódulo. Esses processos poderiam ser melhor compreendidos analisando o translatome de nódulo (ou seja, o subconjunto de RNAs mensageiros [mRNAs] traduzido ativamente). Poliribosomes ou polissomos são complexos de ribossomos múltiplos associados ao mRNA, comumente usado para estudar a tradução3. O método de perfil polisome consiste na análise dos mRNAs associados aos polissomos e tem sido utilizado com sucesso para estudar os mecanismos pós-transcriionais que controlam a expressão genética que ocorre em diversos processos biológicos 4,5.

Historicamente, a análise da expressão do genoma tem focado principalmente na determinação da abundância de mRNA 6,7,8,9. No entanto, há falta de correlação entre a transcrição e os níveis de proteína devido aos diferentes estágios de regulação pós-escrita da expressão genética, particularmente a tradução 10,11,12. Além disso, não foi observada dependência entre as alterações no nível do transcriptome e aquelas que ocorrem no nível do traduzome13. A análise direta do conjunto de mRNAs que estão sendo traduzidos permite uma medição mais precisa e completa da expressão genética celular (cujo ponto final é a abundância de proteínas) do que a obtida quando apenas os níveis de mRNA são analisados 14,15,16.

Este protocolo descreve como os polimentos derivados das plantas são purificados de nódulos de soja intactos por centrifugação diferencial através de uma almofada de sacarose de duas camadas (Figura 1). No entanto, uma vez que os ribossomos derivados de bacteroides também estão presentes nos nódulos, uma mistura de ribossomos e espécies de RNA são purificadas, embora as eucarióticas representem a fração principal (90%-95%). O subsequente isolamento do RNA, quantificação e controle de qualidade também são descritos (Figura 1). Este protocolo, em combinação com o RNA-seq, deve fornecer resultados experimentais sobre a regulação translacional de mRNAs eucarióticas em um tecido complexo como o nódulo simbiótico.

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Figura 1: Visão geral esquemática da metodologia proposta para purificação de pórsomee eucariótico a partir de nódulos simbióticos. O esquema fornece uma visão geral das etapas seguidas no protocolo de (1) crescimento vegetal e (2) colheita de nódulos até (3) preparação dos extratos citolíticos, (3) obtenção de amostras TOTAIS e (4) amostras PAR e (5) extração e controle de qualidade do RNA. Abreviaturas: PEB = tampão de extração políduo; RB = tampão de resuspensão; TOTAL = RNA total; PAR = mRNA associado ao polissomo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

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1. Crescimento vegetal e inoculação de rizobia

  1. Para gerar os nódulos necessários, semeie as sementes de soja escolhidas no substrato selecionado em uma câmara de crescimento em condições controladas.
    NOTA: Neste protocolo, as sementes foram semeadas em uma garrafa plástica de 0,5 L recheada com uma mistura de areia:vermiculite (1:1). A câmara de crescimento foi definida com uma temperatura do ciclo dia/noite de 28 °C /20 °C, respectivamente, e um fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h, respectivamente. A intensidade de radiação fotossintética ativa foi de 620 μmol·m−2·s−1.
  2. Prepare com antecedência o líquido Levedura-Extrato mannitol (YEM)-medium (ver a Tabela de Materiais). Autoclave o meio.
  3. No mesmo dia da semeadura de sementes, inocula um frasco contendo 100 mL de YEM com a cepa Bradyrhizobium elkanii U1302. Incubar o frasco a 28 °C em um agitador orbital a 100 rpm.
    1. Deixe a rizobia crescer por 2 dias e inocular as mudas com 2 mL da cultura.

2. Tratamento de déficit hídrico (opcional)

NOTA: Este protocolo descreve o tratamento do déficit hídrico das plantas de soja. Esta parte pode ser alterada ou omitida inteiramente dependendo da questão experimental em questão.

  1. Cultivar as mudas de soja por 19 dias (estágio de desenvolvimento V2-3) sem restrição de água. Mantenha o substrato na capacidade de campo com B&D-médio17 suplementado com 0,5 mM KNO3.
  2. No dia 20, retire a rega.
    NOTA: Aqui, o teor de água foi medido diariamente por gravimetria (teor gravimétrico da água) durante os períodos de crescimento e déficit hídrico.
  3. Meça a condução estomatal em triplicado diariamente na superfície da folha abaxial com um porômetro, conforme instruído pelo fabricante (ver a Tabela de Materiais), do dia 20 até o final do período de déficit hídrico.
    NOTA: O fim do período de déficit hídrico foi determinado individualmente para cada planta quando o valor de condução estomatal foi de aproximadamente 50% do obtido no dia 20 da semeadura.

3. Colheita de nódulos

  1. Colete nitrogênio líquido em um recipiente limpo e rotule tubos de 15 mL (um para cada planta).
    ATENÇÃO: Manuseie nitrogênio líquido usando luvas criogenas, escudos faciais e óculos de segurança.
  2. Recupere cada planta individualmente. Corte e descarte a parte aérea. Lave bem a raiz com água para remover qualquer substrato restante.
  3. Retire cada nódulo da raiz e colete-os em um tubo de 15 mL pré-lhado. Congele os tubos e armazene-os a −80 °C.

4. Preparação de extratos citosóis

NOTA: O objetivo final deste protocolo é obter RNA total de alta qualidade (TOTAL) e RNA (PAR) associada a polisso. Portanto, trabalhe em condições que previnem a degradação do RNA, mantendo sempre as amostras a 4 °C e utilizando equipamentos e soluções de laboratório sem RNase. A menos que especificado, todas as soluções são preparadas com água ultrapura estéril.

  1. Elaboração de soluções de estoque tampão
    1. Prepare as soluções de estoque autoclaváveis listadas na Tabela 1, autoclave-as por 15 minutos e mantenha na RT.
    2. Prepare as soluções de estoque esterilizadas pelo filtro listadas na Tabela 1, esterilize-as por filtro e mantenha-as a −20 °C.
  2. Prepare o tampão de extração de polissóbio (PEB, consulte a tabela 1) e mantenha-o no gelo.
    NOTA: Os volumes dados são para seis amostras.
  3. Esfrie a centrífuga a 4 °C e coloque tubos de microcentrifuuagem de 2 mL no gelo.
  4. Pesar aproximadamente 0,2 g de nódulos intactos em um prato de pesagem e transferi-los para um tubo pré-cozido de 2 mL.
    NOTA: Faça esta etapa rapidamente para evitar o descongelamento das amostras. Alternativamente, um volume de nódulo estimado de 0,4-0,5 mL pode ser usado em vez do 0,2 g.
  5. Adicione 1,2 mL de PEB, deixe a amostra descongelar por 2 minutos e homogeneize com um moedor de tecido até a interrupção completa e homogeneização dos nódulos.
    NOTA: Certifique-se de moer os nódulos uma vez descongelados, pois serão macios o suficiente para serem facilmente interrompidos com moedores de tecido (veja a Tabela de Materiais) em tubos de microcentrifuuagem. Nódulos congelados são difíceis de moer. Além disso, recomenda-se colocar os tubos em um refrigerador benchtop (0 °C) para homogeneização adequada, mantendo as amostras frias.
  6. Incubar as amostras no gelo com agitação suave por 10 minutos ou até que todas as amostras tenham sido processadas.
  7. Centrifugar a 16.000 × g por 15 min a 4 °C para pelotar os detritos. Recupere o supernatante e repita o passo da centrífuga.
  8. Recupere cuidadosamente o extrato citosolico esclarecido e transfira uma alíquota de 200 μL para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL limpo para isolamento TOTAL (amostras TOTAIS; ver seção 7).

5. Preparação de almofadas de sacarose

NOTA: Este protocolo utiliza uma almofada de sacarose de duas camadas (12% e 33,5%) em tubos ultracentrífusos de 13,2 mL (ver a Tabela de Materiais). Todas as soluções são preparadas com água ultrauso estéril.

  1. Prepare as soluções de sacarose e sal.
    1. Prepare 100 mL de solução de sacarose de 2 M (68,5%, Tabela 1).
    2. Prepare a solução de sal 10x (Tabela 1).
  2. Prepare as duas camadas da almofada de sacarose conforme descrito na Tabela 2. Consulte a Tabela 1 para a composição das soluções de estoque antibiótico (CHX e CHL).
    NOTA: Os volumes dados são para seis almofadas.
  3. Despeje 4,5 mL da camada de sacarose de 33,5% nos tubos de centrífuga. Em seguida, adicione 4,5 mL da camada de 12% com cuidado e lentamente com uma micropipette P1000. Coloque os tubos no gelo até a adição do extrato citosolico esclarecido.

6. Purificação polissólida

  1. Carregar 1 mL do extrato citosolico esclarecido (etapa 4.8) em cima da almofada de sacarose, tubos cuidadosamente na parede lateral do tubo.
  2. Transfira os tubos ultracentrífugas para baldes pré-cozidos e centrífugas a 217.874 × g (35.000 rpm no rotor referenciado [ver a Tabela de Materiais]) por 2h a 4 °C.
  3. Descarte o extrato citosolico restante e a almofada de sacarose, e resuspenque a pelota polissomal com 200 μL de RB pré-cozido (previamente preparado de acordo com a Tabela 1).
  4. Incubar por 30 minutos no gelo e, em seguida, transferir a ressuspensão polissomal para tubos pré-cozidos de 1,5 mL. Proceder com a extração de RNA (amostras PAR).

7. Extração de RNA e controle de qualidade

NOTA: Esta etapa é realizada para amostras TOTAL (etapa 4.8) e PAR (etapa 6.4).

  1. Prepare 75% DeSI com água ultrapura estéril e esfrie-a a −20 °C. Além disso, esfrie o clorofórmio e o isopropanol a −20 °C.
  2. Homogeneize as amostras com 750 μL do reagente de isolamento de RNA e incubar por 5 min na RT.
  3. Adicione 200 μL de clorofórmio frio e agite os tubos vigorosamente por 15 s. Incubar na RT por 10 minutos.
  4. Centrifugar a 12.000 × g para 15 min a 4 °C para separação de fase. Transfira 500 μL da fase aquosa superior para um tubo limpo sem perturbar a fase orgânica rosa, e adicione 375 μL de isopropanol frio e 0,5 μL de glicogênio livre de RNase (ver a Tabela de Materiais). Misture bem por pipetar para cima e para baixo.
    NOTA: Glicogênio é um portador usado como co-precipitante para aumentar a recuperação de ácido nucleico da precipitação do álcool.
  5. Incubar a mistura por 10 min a 4 °C e centrífuga a 12.000 × g por 15 min. Descarte o supernatante.
  6. Lave o precipitado RNA com 1 mL de frio 75% etoh. Misture por um breve vórtice.
    NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C durante a noite.
  7. Centrifugar a 7.500 × g por 5 min a 4 °C, remover cuidadosamente o supernatante com uma micropipette e secar a pelota de RNA.
  8. Dissolva a pelota em 50 μL de água sem RNase e incubar a 65 °C por 5 min.
  9. Avalie a concentração e integridade do RNA com eletroforese capilar altamente sensível18 (ver a Tabela de Materiais) e/ou eletroforese em um gel de agarose 2% sem RNase19 (ver a Tabela de Materiais).
    NOTA: Se as amostras de RNA não forem usadas imediatamente ou forem enviadas para a instalação de sequenciamento para a preparação da biblioteca RNA-seq, recomenda-se usar o EtOH para precipitar-as.

8. Precipitação de RNA

  1. Esfrie a centrífuga e EtOH a 4 °C.
  2. Prepare acetato de sódio de 3 M.
  3. Prepare 70% EtOH com água ultrapura estéril e esfrie-a a −20 °C.
  4. Estime o volume da amostra. Adicione 0,1 volumes de acetato de sódio de 3 M, 3 volumes de EtOH frio e 0,5 μL de glicogênio sem RNase. Homogeneizar.
  5. Deixe a −20 °C até que seja necessário.
    NOTA: As amostras precipitadas de RNA podem ser armazenadas por até 1 ano a −80 °C.

9. Pipeline padrão para análise de expressão genética

  1. Realize uma média de leituras de extremidade pareada de 40M Desarlumina, com comprimento de leitura >100 bp, para análise de dados de transcriptome e translatome confiantes.
    NOTA: A análise padrão de dados RNA-seq inclui as seguintes etapas 9.2-9.5.
  2. Realize a inspeção de qualidade de leitura usando o FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) ou o MultiQCmultisample 20.
  3. Remova o adaptador e as sequências de baixa qualidade usando Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, foice23 ou Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), entre outros.
  4. Se um genoma de referência estiver disponível para a espécie, realize o mapeamento de leitura contra a referência, seguido de quantificação de abundância, usando Bowtie224, TopHat225 ou Salmon26, e featureCounts27, além de outras ferramentas de código aberto.
  5. Realize análise estatística para identificação de genes expressos diferenciais utilizando edgeR28, DESeq229 ou limma30, entre outros.
    NOTA: Estes softwares de código aberto podem ser usados localmente, através da linha de comando. Alternativamente, eles podem ser operados através de um navegador da Web em um servidor público, como o Galaxy31 ou GEOexplorer32, que oferecem uma interface gráfica de usuário, de modo que nenhum conhecimento de linha de comando é necessário para seu uso.

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Resultados

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A quantidade e a avaliação da qualidade das frações TOTAL e PAR purificadas com o procedimento acima mencionado é fundamental para determinar seu sucesso, uma vez que para a maioria das aplicações a jusante, como sequenciamento de RNA, amostras de alta qualidade são fundamentais para a preparação e sequenciamento da biblioteca. Além disso, a integridade das moléculas de RNA permite a captura de um instantâneo do perfil de expressão genética no momento da coleta da amostra18. Neste contexto, um núm...

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Discussão

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Estudar a regulação da expressão genética no nível translacional é fundamental para compreender melhor diferentes processos biológicos, uma vez que o ponto final da expressão genética celular é a abundância deproteínas 13,14. Isso pode ser avaliado analisando o translatório do tecido ou organismo de interesse para o qual a fração polissômica deve ser purificada e seus mRNAs associados analisaram 3,4,34,35,36.

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi financiada pela bolsa CSIC I+D 2020 nº 282, FVF 2017 grant No. 210 e PEDECIBA (María Martha Sainz).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
crescimento vegetal e inoculação de rizóbios
agitador orbitalDaihan ScientificModelo SHO-1D
YEM-médioAmrescoJ850 (extrato de levedura) 0122 (manitol)
tratamento do déficit hídrico
KNO3Merck
DispositivoPorometerModelo SC-1
Bisturi
< forte > Preparação de extratos citosólicos< / forte >
Brij L23Sigma-AldrichP1254
CentrífugaSigmaModelo 2K15
CloranfenicolSigma-AldrichC0378
CicloheximidaSigma-AldrichC7698
DOCSigma-Aldrich30970
DTTSigma-AldrichD9779
EGTASigma-AldrichE3889
Igepal CA 360Sigma-AldrichI8896
KClMerck1.04936
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Moedor de tecido de plásticoFisher Scientific12649595
PMSFSigma-AldrichP7626
PTESigma-AldrichP2393
TrisInvitrogen15504-020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Prato de pesagem Deltalab1911103
Preparação de almofadas de sacarose
SacaroseInvitrogen15503022
SW 40 Ti rotorUltracentrífuga Beckman-Coulter
UltracentrífugaBeckman-CoulterOptima L-100K
344059Tubos de 13,2 mL
< extração > RNA forte e controle de qualidade< / forte>
Agarose Thermo scientificR0492
BioanalyzerAgilentModelo 2100. Ensaio nano de RNA total eucarioto
ClorofórmioDI41191
EtanolDorwilUN1170
IsopropanolMallinckrodt3032-06
GlicogênioSigma10814-010
TRIzol LSAmbion102960028
Diversos
Tubos Falcon 15 mLBiologix10-0152
Pontas de filtro 10 µ LBioPointe Scientific321-4050
Pontas de filtro 1000 µ LBioPointe Scientific361-1050
Pontas de filtro 20 µ LBioPointe Scientific341-4050
Pontas de filtro 200 µ LTarsons528104
Tubos de microcentrífuga 1,5 mLTarsons500010-N
Tubos de microcentrífuga 2,0 mLTarsons500020-N
Empresa de sequenciamentoMacrogen
Estéril 250 mL frascoMarienfeld4110207
221295 Decagon Tubos de ultracentrífuga :

Referências

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