Mensuração Quantitativa em Tempo Real da Migração e Invasão de Células Tumorais Após Transfecção de RNAm Sintético

A motilidade das células tumorais desempenha um papel crucial na metástase1,2. A disseminação de células tumorais para tecidos saudáveis vizinhos e remotos dificulta o tratamento do câncer e contribui para a^recidiva3,4. Portanto, é essencial compreender os mecanismos de motilidade celular tumoral e desenvolver estratégias terapêuticas relevantes. Como muitas células tumorais apresentam perfis de expressão gênica alterados, é crucial entender quais alterações no perfil de expressão gênica levam à alteração da motilidade das células^tumorais5,6.

Vários ensaios têm sido desenvolvidos para medir a migração celular in vitro. Alguns ensaios fornecem apenas informações limitadas por permitirem apenas medições em momentos específicos, enquanto outros oferecem informações abrangentes sobre a motilidade celular tumoral em tempo real⁷. Embora muitos desses ensaios de motilidade celular possam fornecer resultados quantitativos em um determinado momento ou no desfecho, eles falham em fornecer informações suficientemente detalhadas sobre mudanças dinâmicas na taxa de migração celular ao longo do período experimental. Além disso, pode ser difícil examinar possíveis mudanças na taxa de migração celular dependendo do planejamento experimental, tipos de células e números de células. Além disso, os efeitos de tratamentos não complicados podem ser investigados pela simples quantificação de ensaios tradicionais de motilidade, mas quantificações mais sofisticadas podem ser necessárias para estudar os efeitos complexos de vários tratamentos combinados⁸.

Foi desenvolvido um instrumento para monitorar a corrente elétrica de uma placa de microtitulação coberta com microeletrodos⁹. A adesão das células à superfície do poço impede o fluxo de elétrons, e a impedância correlaciona-se com a ligação quantitativa e qualitativa das células. A presença dos microeletrodos no fundo do poço permite a medição da adesão, espalhamento e proliferação celular. A presença dos microeletrodos sob uma membrana microporosa da câmara superior permite medir a migração e invasão celular para a câmara inferior, com a câmara superior revestida com proteínas da matriz extracelular (MEC) para permitir a invasão¹⁰.

Anteriormente, foi demonstrado que medidas em tempo real baseadas em impedância da migração e invasão de células tumorais fornecem dados em tempo real durante todo o experimento, bem como comparações e quantificações instantâneas sob várias condições^{experimentais11}. Nesse artigo, o knockdown gênico foi induzido para testar o papel de proteínas de interesse na migração e invasão de células tumorais. Como um efeito knockdown completo do gene nas condições experimentais testadas levou 3-4 dias após a eletroporação com pequenos RNAs interferentes (siRNAs)⁸, as células foram replaqueadas após a eletroporação e recolhidas 3 dias depois para a medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células tumorais.

CT10 regulador da quinase (Crk) e Crk-like (CrkL) são proteínas adaptadoras que medeiam interações proteína-proteína a jusante de várias vias da quinase do receptor do fator de crescimento e vias da tirosina quinase não-receptora¹². Níveis elevados das proteínas Crk e CrkL contribuem para o mau prognóstico em vários cânceres humanos, incluindo o glioblastoma¹³. No entanto, não está claro como as proteínas Crk e CrkL elevadas levam a um prognóstico ruim. Portanto, é importante definir o efeito da superexpressão de Crk e CrkL sobre as funções das células tumorais. Anteriormente, um estudo de knockdown genético foi realizado para demonstrar que os níveis endógenos das proteínas Crk e CrkL são necessários para a migração e invasão de células de glioblastoma⁸. Aqui, um sistema de ensaio modificado foi desenvolvido para abordar o efeito da superexpressão de Crk e CrkL na migração e invasão de células tumorais.

Recentemente, a síntese in vitro de mRNA e suas aplicações terapêuticas têm chamado atenção renovada devido ao desenvolvimento das vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2 (revisado por Verbeke et ^al.14). Além disso, avanços notáveis têm sido obtidos no uso do RNAm sintético em câncer e outras doenças^15,16. A eletroporação de células é um método eficaz para liberar RNAm sintético e induzir modificações genéticas transitórias (revisado por Campillo-Davo et ^al.17), e o uso de RNAm sintético permite expressão gênica rápida e eficiente em fibroblastos^{imortalizados18}. Este artigo de método combina a superexpressão gênica usando mRNA sintético com análises celulares em tempo real para estudar a migração e invasão de células tumorais. Entretanto, o esquema experimental utilizado para siRNAs não funciona com transfecção de RNAm sintético, pois o nível de proteínas exógenas aumenta rapidamente e diminui gradualmente com a transfecção de RNAm sintético¹⁸. Portanto, o método foi modificado para realizar a análise em tempo real da migração e invasão celular logo após a transfecção sem a cultura adicional das células.

Este artigo de método demonstra que a combinação de medidas em tempo real baseadas em impedância com a transfecção de células tumorais com mRNAs sintéticos fornece uma análise rápida e abrangente dos efeitos da upregulation gênica na migração e invasão de células tumorais. Este artigo descreve procedimentos detalhados para medir como a migração e invasão de células de glioblastoma são afetadas pela superexpressão de Crk e CrkL. Ao examinar os efeitos dependentes da concentração do mRNA sintético na migração de células tumorais, o artigo descreve claramente como um aumento nos níveis de proteína estimula a migração de células tumorais. Além disso, uma abordagem de variação da concentração do gel de MEC é apresentada para avaliar os efeitos de alterações na expressão gênica sobre a invasão de células tumorais.

1. Síntese de mRNA

NOTA: Para a síntese de RNAm, todos os reagentes e equipamentos devem ser especialmente tratados para inativar as RNases antes do uso. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Linearização do DNA
   NOTA: Os cDNAs de camundongos de CrkI e CrkL foram clonados no vetor de expressão pFLAG-CMV-5a para adicionar o epítopo FLAG no terminal C e subclonados no vetor pcDNA3.1/myc-His para incorporar o promotor T7, como descrito anteriormente ^18,19.
   1. Adicionar 10 μL de tampão de reação 10x, 1,5 μL de PmeI (10.000 unidades/mL) e 10 μg de DNA plasmidial a um tubo de microcentrífuga para linearizar o DNA plasmidial com a enzima de restrição. Adicione água livre de nucleases para elevar o volume de reação a 100 μL.
   2. Misture batendo, gire para baixo e incube a mistura de reação a 37 °C durante a noite.
   3. Gire para baixo e adicione 5 μL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% e 1 μL de proteinase K (20 mg/mL, grau RNA) à mistura de reação. Misture batendo, gire para baixo e incube a 50 °C por 30 min.
   4. Sob o exaustor, adicionar 100 μL da fase inferior de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico à mistura de reação plasmidial para extração. Vórtice e, em seguida, centrifugar a 18.800 × g por 5 min à temperatura ambiente. Mova a fase superior para um novo tubo.
   5. Repetir o passo 1.1.4 com clorofórmio:álcool isoamílico a 24:1.
   6. No novo tubo, levar o volume de reação para 300 μL adicionando 200 μL de água livre de nuclease e, em seguida, adicionar 30 μL de acetato de sódio 3 M e 600 μL de etanol 100%.
   7. Misturar por vórtice e, em seguida, colocar a -20 °C por 30-60 min para a precipitação de etanol do DNA.
   8. Centrifugar a 18.800 × g por 20 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e enxaguar o pellet com 1 mL de etanol 70%. Repita a centrifugação por 10 minutos e, em seguida, remova completamente o sobrenadante.
   9. Secar com a tampa aberta por 2 min, adicionar 30 μL de água livre de nucleases e ressuspender o pellet de DNA.
   10. Determinar a concentração de DNA usando um espectrofotômetro.
   11. Verificar o tamanho e a quantidade do DNA linearizado usando eletroforese em gel de agarose.
2. Síntese de RNA utilizando T7 RNA polimerase
   1. Adicionar 2 μL de 10x de tampão de transcrição, ATP, GTP, UTP, CTP e T7 e 1 μg de um DNA linearizado a um tubo de microcentrífuga. Adicione água livre de nucleases para elevar o volume de reação para 20 μL.
   2. Misturar por batida, girar para baixo e incubar a mistura de reação a 37 °C por 2 h para síntese de RNA.
   3. Gire para baixo, adicione 1 μL de DNase (2 U/μL) e incube a 37 °C por 15 min para remover o DNA do molde.
3. Precipitação de cloreto de lítio do RNA
   1. Adicionar 10 μL de cloreto de lítio (7,5 M) à mistura de reacção. Misture batendo, girando para baixo e incube a mistura de reação a -20 °C por 30 min.
   2. Centrifugar a 18.800 × g por 20 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e enxaguar o pellet com 500 μL de etanol 70%. Repita a centrifugação por 10 minutos e, em seguida, remova completamente o sobrenadante.
   3. Secar com a tampa aberta por 2 min, adicionar 30 μL de água livre de nuclease e ressuspender o pellet de RNA.
4. Nivelamento
   1. Aqueça a amostra de RNA a 65 °C por 10 min e, em seguida, coloque-a no gelo para resfriamento.
   2. Adicionar 5 μL cada de 10x tampão de cobertura, 10 mM GTP e 1 mM (10x) S-adenosilmetionina (SAM), 2 μL cada de uma mistura de enzimas de capping e mistura de enzimas O-metiltransferase, e 1,25 μL de inibidor de RNase. Misturar por batida, girar para baixo e incubar a mistura de reação a 37 °C por 1 h.
5. Rejeito de poli(A)
   1. Gire a amostra e, em seguida, adicione 6 μL de água livre de nucleases, 20 μL de tampão E-PAP 5x, 10 μL de 25 mM MnCl₂, 10 μL de 10 mM ATP e 4 μL de enzima de rejeito E-PAP poli(A). Misturar por batida, girar para baixo e incubar a mistura de reação a 37 °C por 2 h.
6. Precipitação de cloreto de lítio e quantificação do RNAm sintético
   1. Adicionar 50 μL de cloreto de lítio (7,5 M) e efectuar a precipitação de cloreto de lítio conforme descrito nos passos 1.3.1-1.3.3.
   2. Medir a concentração do mRNA usando um espectrofotômetro.
   3. Verificar o tamanho e a quantidade de RNAm usando eletroforese em gel de formaldeído (1%-2%), agarose (1%).

2. Revestimento em gel da matriz extracelular (MEC) das placas de invasão e migração celular (CIM)

NOTA: Uma placa de invasão e migração celular (CIM) é uma placa de 16 poços fabricada comercialmente para análise celular em tempo real baseada em impedância. Para o ensaio de invasão celular, revestir placas CIM com gel de MEC, como descrito anteriormente, mas com algumas modificações¹¹.

1. Retire uma alíquota de caldo de gel ECM do congelador e mantenha-a no gelo.
2. Diluir o gel de MEC (10 mg/mL) para uma concentração de trabalho (100 μg/mL) misturando 990 μL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (sem soro ou antibióticos) com 10 μL de gel de MEC em um tubo de microcentrífuga. Misture por pipetagem suave.
3. Adicionar 60 μL de gel de ECM diluído a cada um dos 16 orifícios da câmara superior da placa CIM. Aplicar o método de pipetagem reversa evitando bolhas de ar^20,21.
   NOTA: Otimizar a concentração do gel de MEC para cada linhagem celular. Para linhagens celulares de glioblastoma, foi utilizado gel de MEC de 0,1 μg/μL a 1 μg/μL para otimização.
4. Coloque a câmara superior da placa CIM com a tampa da placa desligada em uma folha plástica protetora dentro de uma incubadora de CO₂ por aproximadamente 4 h para formar uma camada de gel.
   CUIDADO: Durante o revestimento da placa CIM com gel de ECM, os eletrodos da câmara superior da placa CIM não devem ter contato direto com as mãos do experimentador ou com as superfícies do equipamento, incluindo o gabinete de biossegurança ou a incubadora CO₂ .

3. Preparação das células tumorais

NOTA: Todos os materiais de cultura celular devem ser mantidos estéreis. Colher e eletroporar as células tumorais sob uma cabine de segurança biológica com equipamento de proteção individual (EPI) apropriado, como descrito anteriormente, mas com algumas^{modificações11}.

1. Cultura de células tumorais
   1. Cultura de células U-118MG em 10 mL de DMEM contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibióticos por placa de cultura de tecido de poliestireno 100 mm x 20 mm a 37 °C em incubadora de 5% CO₂ (condição de cultura).
2. Depleção sérica das células tumorais
   NOTA: A exposição das células aos quimioatrativos presentes na SFB deve ser minimizada antes dos ensaios de migração e invasão celular usando uma alta concentração de SFB.
   1. Retire o meio velho e adicione 10 mL de DMEM pré-aquecido contendo 0,5% de SFB e 1% de antibióticos por prato (meio de soro baixo).
   2. Repita a etapa 3.2.1.
   3. Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5% durante 4 h ou mais.
3. Colheita das células tumorais
   1. Remova o meio antigo, adicione 8 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) pré-aquecido de Dulbecco por prato, remova o DPBS, adicione tripsina-EDTA 0,05% pré-aquecido (2 mL/prato) para cobrir a superfície e incube na incubadora CO₂ por 30 s.
   2. Aspirar o EDTA-tripsina cuidadosamente, adicionar meio de soro baixo (7 mL/placa) e, em seguida, coletar células em um tubo de centrífuga de 50 mL ou 15 mL.
   3. Aliquot um pequeno volume de células, e use um contador de células automatizado portátil para contar as células.
   4. Calcular o número total de células e o volume necessário para 10.000 células/μL.
   5. Gire as células centrifugando-as a 100 × g por 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante, adicionar o volume calculado de DMEM contendo 0,5% de SFB (sem antibióticos) e ressuspender suavemente o pellet celular.
   6. Transferir 110 μL da suspensão celular, contendo 1,1 milhão de células, para um tubo de microcentrífuga para cada tratamento.
   7. Repetir o passo 3.3.6 para transferir as células para quatro tubos de microcentrífuga para quatro tratamentos diferentes.
      NOTA: Uma placa CIM tem um total de 16 poços. Projetar quatro tratamentos diferentes para comparação de modo que quatro poços da placa CIM possam ser atribuídos para cada tratamento. Utilizar as células eletroporadas para os seguintes experimentos: análises de western blot (0,3 milhão de células por placa de cultura de tecido de 35 mm), quatro poços de ensaios de migração celular em tempo real (0,1 milhão de células/poço) e quatro poços de ensaios de invasão celular em tempo real (0,1 milhão de células/poço) para cada tratamento. Ajustar o número de células que precisam ser eletroporosas se o desenho experimental mudar.

4. Eletroporação das células tumorais

1. Para remover o meio, adicione 1 mL de DPBS à suspensão celular em cada tubo, gire a suspensão da célula três vezes por 10 s cada vez enquanto gira o tubo 180° a cada 10 s usando uma mini centrífuga e remova o sobrenadante usando uma micropipeta.
   NOTA: É importante formar um pellet de célula compacto, mas facilmente ressussuspensável.
2. Adicionar 110 μL de tampão de ressuspensão R ao pellet celular para obter 0,1 milhão de células em 10 μL.
3. Adicionar mRNA sintético ao pellet celular para obter uma concentração de 0,2-20 ng/μL dependendo do nível de expressão desejado. Misture e ressuspenda o pellet de células suavemente batendo ou pipetando suavemente.
   NOTA: Use diferentes concentrações de mRNA sintético, examine a expressão de proteínas usando a análise de western blot e determine a concentração de mRNA sintético que leva ao nível de expressão desejado, a fim de investigar a correlação específica entre a expressão de proteínas e efeitos biológicos.
4. Eletroporato de 10 μL da suspensão celular com sistema de eletroporação a 1.350 V por 10 ms com três pulsos de cada vez.
5. Transferir as células eletroporadas para um novo tubo de microcentrífuga com 1,1 mL de DMEM contendo SFB a 0,5%.
6. Repita a eletroporação até que o restante da suspensão celular seja eletroporado. Combinar as células eletroporadas no tubo de microcentrífuga para obter 1,1 milhão de células em 1,1 mL.
   NOTA: Ambas as pontas de eletroporação de 100 μL e 10 μL podem ser usadas para eletroporar um grande volume de células, mas as pontas de eletroporação para 10 μL e 100 μL estão incluídas em dois kits separados e precisam ser adquiridas separadamente. O buffer de ressuspensão R está incluído em ambos os kits.
7. Ao completar todas as respectivas eletroporações, ressuspenda suavemente as células agrupadas.
8. Placa de 0,3 milhão de células em placa de cultura de tecido de poliestireno de 35 mm x 10 mm com 2 mL de DMEM contendo 5% de SFB e cultura das células por 1 dia sob condição de cultura para preparação de lisado celular total e análises de western blot.
9. Mantenha o restante das células eletroporosas à temperatura ambiente até que o sistema de análise celular em tempo real esteja pronto.

5. Configuração do analisador de células em tempo real, do programa e das placas CIM

NOTA: Prepare o analisador de células em tempo real e duas placas CIM, conforme descrito anteriormente¹¹.

1. Equilíbrio do analisador de células em tempo real
   1. Mova o analisador de células em tempo real para uma incubadora de CO₂ várias horas antes do uso para equilibrar o sistema sob a condição de cultura.
2. Configurando o programa de análise
   1. Abra o programa de análise clicando duas vezes no ícone do software de análise de células em tempo real na área de trabalho.
   2. Quando a opção Configuração de Padrão de Experimento estiver aberta, selecione a opção para executar três experimentos separadamente.
      Observação : cada berço tem uma janela separada. Existem diferentes guias para configurar o intervalo de medição e a duração, a análise de dados e outras condições experimentais.
   3. Abra cada berço clicando na guia Número .
   4. Clique na guia Notas do experimento, selecione a pasta na qual os dados serão salvos e insira o nome do experimento .
   5. Clique na guia Layout , configure poços quádruplos para cada condição de tratamento selecionando quatro poços de cada vez e inserindo as informações da amostra e, em seguida, clique em Aplicar.
   6. Clique na aba Programação | Adicione uma etapa para configurar o modo de duas etapas das medições de impedância da célula. Em seguida, clique em Aplicar para configurar a primeira etapa.
   7. Clique em Adicionar uma etapa novamente, digite 10 min para o intervalo e 48 h para a duração da migração e invasão, e clique em Aplicar para configurar a segunda etapa.
      NOTA: O primeiro passo faz uma medição de linha de base única (uma varredura com um intervalo de 1 minuto). A segunda etapa mede a impedância celular para o experimento (por exemplo, 289 varreduras com intervalo de 10 min por 48 h) no berço. Ajustar o intervalo e a duração em função do desenho experimental.
   8. Mova para o próximo suporte e configure-o repetindo as etapas 5.2.3-5.2.7.
3. Preparação das placas CIM
   1. Uma hora antes do início da impedância celular, preencher os orifícios da câmara inferior da placa CIM com 160 μL de DMEM contendo 10% de soro ou outros quimioatrativos.
   2. Montar a câmara superior que contém os poços revestidos com gel de MEC (para invasão) ou poços não revestidos (para migração) com a câmara inferior.
   3. Adicionar 50 μL de soro baixo aos orifícios da câmara superior da placa CIM para o ensaio de migração celular e colocar a placa CIM no berço do sistema.
   4. Clique na guia Mensagem e verifique se a mensagem Conexões ok é exibida. A placa CIM já está pronta para o experimento.
   5. Pré-incubar a placa CIM montada na incubadora CO₂ por 30-60 min antes da análise celular em tempo real para aclimatar a placa CIM à condição de cultura.

6. Análise de células em tempo real e exportação de dados

Observação : execute uma leitura de linha de base, propagação de célula, medição de impedância de célula e exportação de dados conforme descrito anteriormente¹¹.

1. Leitura da linha de base
   NOTA: A linha de base deve ser lida após a placa CIM ser aclimatada e antes que as células sejam adicionadas aos poços da câmara superior.
   1. Clique no botão Iniciar para cada suporte. Quando a janela Salvar como for exibida, salve o arquivo experimental para executar a leitura da linha de base.
2. Semeadura de células
   1. Retire a placa CIM do berço e coloque-a no armário de biossegurança no suporte da placa.
   2. Adicionar 100 μL (contendo 100.000 células) de células eletroporosas aos orifícios da câmara superior da placa CIM de acordo com o programa na unidade de controle. Aplique o método de pipetagem reversa evitando bolhas de ar.
   3. Deixe a placa CIM sob o gabinete de biossegurança por 30 minutos à temperatura ambiente para garantir que as células se espalhem uniformemente no fundo do poço.
3. Medição de impedância celular
   1. Mova a placa CIM totalmente montada de volta para o respectivo berço. Clique no botão Iniciar do suporte para iniciar a medição da impedância da célula para a segunda etapa.
   2. Clique na guia Plotar , clique no botão Adicionar Tudo e selecione as caixas Average e STD DEV para visualizar os dados em tempo real.
      Observação : A opção de plotagem padrão é tempo para o eixo x e índice de célula para o eixo y. A seção Plot Selection permite que o usuário selecione opções alternativas para o eixo y: Normalized Cell Index ou Delta Cell Index. Uma vez que a varredura final é feita, o experimento é concluído e os resultados são salvos automaticamente.
4. Exportação dos dados para análise
   1. Clique na guia Plotar e selecione as caixas Average e STD DEV para copiar os dados de cada poço individualmente.
   2. Clique com o botão direito do mouse na área de plotagem e selecione Copiar dados em formato de lista.
   3. Abra um arquivo de planilha vazio, cole os dados e salve o arquivo.
   4. Volte para o programa de análise, clique na guia Placa para cada berço e selecione Liberar para fechar o experimento para o berço.
   5. Volte para o arquivo de planilha e ajuste a hora dos dados brutos para que a hora de início na segunda etapa se torne a hora de início real da medição.

As proteínas Crk e CrkL desempenham papéis importantes na motilidade de muitos tipos celulares, incluindo neurônios22, células T23, fibroblastos 18,19 e uma variedade de células tumorais13. Uma vez que as proteínas Crk e CrkL foram relatadas como elevadas no glioblastoma24,25,26, os efeitos da superexpressão de CrkI, uma variante de emenda de Crk, sobre a migração celular de glioblastoma foram estudados neste trabalho. Células U-118MG foram eletroporosadas com diferentes concentrações de RNAm sintético de CrkI e analisadas quanto aos níveis de proteína e migração celular. A eletroporação de células de glioblastoma U-118MG com concentrações variáveis de mRNA sintético de CrkI resultou em um aumento dependente da concentração na proteína CrkI marcada com FLAG 1 dia após a transfecção (Figura 1A). Enquanto 0,2 ng/μL e 2 ng/μL de mRNA levaram a uma expressão indetectável ou modesta da proteína exógena CrkI, 20 ng/μL de mRNA resultaram em um nível de expressão muito maior do que a proteína CrkI endógena.

Os resultados do ensaio de migração celular usando o sistema de análise celular em tempo real indicaram que a eletroporação com 0,2 ng/μL ou 2 ng/μL de mRNA CrkI não afetou muito a migração celular. No entanto, a eletroporação com 20 ng/μL de RNAm CrkI levou a uma clara estimulação da migração celular, com mais células migrando entre 2 h e 13 h (Figura 1B). A comparação entre o nível da proteína CrkI e a migração celular revelou que a migração celular de glioblastoma foi estimulada pelo aumento do nível da proteína CrkI. Parece que o nível de proteína CrkI deve ser maior do que um certo limiar para causar uma estimulação substancial da migração celular. Se a migração celular tivesse sido medida de maneiras diferentes para contar ou observar as células migradas em pontos de tempo específicos, muito mais esforço poderia ter sido necessário para identificar esse tipo de mudança na migração celular.

Para estudar como a superexpressão de CrkL influencia a invasão celular de glioblastoma através de camadas de gel de MEC com diferentes concentrações de proteínas de MEC, células U-118MG foram eletroporosadas com mRNA sintético de CrkL e analisadas em termos de níveis de proteína e invasão celular através de uma camada de gel de MEC. A eletroporação de células de glioblastoma U-118MG com mRNA sintético de CrkL levou a uma expressão robusta da proteína CrkL marcada com FLAG 1 dia após a transfecção (Figura 2A). À medida que a concentração de proteínas da MEC aumentava, a invasão das células controle diminuía (Figura 2B). As células superexpressantes de CrkL também mostraram uma diminuição dependente da concentração do gel de MEC na invasão celular (Figura 2C). A comparação entre as células controle e as células superexpressantes de CrkL em diferentes concentrações de gel de MEC indicou que a superexpressão de CrkL geralmente estimulava a invasão celular através da camada de gel de MEC (Figura 2D-G). No entanto, a diferença entre as duas populações celulares tornou-se óbvia em diferentes momentos dependendo da concentração do gel de MEC.

Para o gel de MEC 0,1 μg/μL, a estimulação mediada por superexpressão de CrkL de invasão celular foi evidente entre 8 h e 20 h (Figura 2D), mas a diferença na invasão celular foi desprezível após 32 h. Para o gel de MEC de 0,2 μg/μL, a diferença na invasão celular com e sem superexpressão de CrkL foi mínima em todos os momentos (Figura 2E). Para o gel de MEC de 0,5 μg/μL, a diferença na invasão celular foi evidente entre 24 h e 36 h (Figura 2F). Para o gel de 1 μg/μL de MEC, o efeito da superexpressão de CrkL sobre a invasão celular tornou-se ligeiramente aparente em 48 h (Figura 2G). Os resultados sugerem que a janela para detectar a diferença entre as células controle e as células superexpressas de CrkL muda para tempos posteriores à medida que a concentração do gel de MEC aumenta. Os resultados também sugerem que as duas populações celulares foram afetadas diferencialmente pelo aumento da concentração do gel de MEC em diferentes momentos. Por exemplo, em 12 h, as células superexpressantes de CrkL mostraram invasão substancialmente maior apenas a 0,1 μg/μL de gel de MEC (Figura 2H). No entanto, em 24 h, as células superexpressas de CrkL mostraram invasão um pouco maior ou semelhante nas concentrações de gel de MEC testadas (Figura 2I). Portanto, é importante investigar as diferenças dependentes do tempo e dependentes da concentração do gel de MEC na invasão celular para obter uma visão abrangente das diferenças entre as duas populações celulares com e sem superexpressão de CrkL. Esses resultados demonstram que a combinação de superexpressão transitória usando RNAm sintético com análises celulares em tempo real baseadas em impedância fornece uma ferramenta poderosa para analisar a correlação potencial entre a superexpressão gênica e a migração e invasão de células tumorais. Examinar os efeitos das variações de concentração no RNAm sintético e no gel de MEC forneceria informações mais precisas e detalhadas.

Figura 1: Efeitos da superexpressão de CrkI na migração celular de glioblastoma. Células U-118MG foram eletroporadas com as concentrações indicadas (ng/μL) de mRNA CrkI marcado com FLAG. (A) Para as análises de western blot, as células eletroporadas foram cultivadas por 1 dia antes da preparação do lisado celular total. Os níveis de proteína na transfecção com RNAm sintético de CrkI foram comparados. Anticorpos anti-Crk e anti-CrkL foram usados para detectar as proteínas endógenas e marcadas com FLAG e para comparar a razão entre as proteínas endógenas e as proteínas marcadas com FLAG. Vinculina e α-tubulina foram usadas como controles de carregamento. (B) Para as análises de migração celular, as células eletroporadas foram plaqueadas em placa CIM sem cultura adicional. Os valores do índice celular foram obtidos de quatro poços para cada amostra, e seus valores médios ± DP são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Efeitos da superexpressão de CrkL na invasão celular de glioblastoma. Células U-118MG foram eletroporadas com mRNA de CrkL marcado com H2O livre de nuclease ou 20 ng/μL marcado com FLAG. (A) Para as análises de western blot, as células eletroporadas foram cultivadas por 1 dia antes da preparação do lisado celular total. Os níveis de proteína na transfecção com RNAm sintético de CrkL foram comparados. Anticorpos anti-Crk e anti-CrkL foram usados para detectar as proteínas endógenas e marcadas com FLAG e para comparar a razão entre as proteínas endógenas e as proteínas marcadas com FLAG. Vinculina e α-tubulina foram usadas como controles de carregamento. (B-G) Para a análise da invasão celular, as células eletroporadas foram plaqueadas em placa CIM com revestimento em gel de MEC sem posterior cultura. Os valores do índice celular foram obtidos de quatro poços para cada amostra, e seus valores médios ± DP são mostrados. (B) Os dados de invasão celular das células controle com diferentes concentrações de gel de MEC foram comparados. (C) Os dados de invasão celular das células superexpressando CrkL com várias concentrações de gel de MEC foram comparados. (D-G) Os dados de invasão celular entre as células controle e as células superexpressantes de CrkL foram comparados para a concentração de gel de MEC indicada. (H) Comparação da invasão celular em 12 h entre as células controle e as células superexpressas por CrkL. (I) Comparação da invasão celular em 24 h entre as células controle e as células superexpressantes de CrkL. Abreviações: MEC = matriz extracelular; CIM = invasão e migração celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Diagramas esquemáticos dos procedimentos experimentais após knockdown ou superexpressão gênica. (A) O procedimento experimental da análise celular em tempo real após a transfecção de siRNA. Uma vez que 3-4 dias são necessários para induzir o knockdown completo do gene após a transfecção de siRNA nas condições experimentais, as células foram replaqueadas e cultivadas por 3 dias após a eletroporação antes de estarem prontas para análises celulares em tempo real. (B) O procedimento experimental para a análise celular em tempo real após a transfecção de RNAm sintético. Como a expressão proteica da transfecção de RNAm sintético é rápida, as células eletroporadas foram utilizadas para análises celulares em tempo real no mesmo dia. Observe a diferença entre os dois procedimentos experimentais; enquanto a análise celular em tempo real foi realizada 3 dias após a eletroporação para knockdown gênico usando siRNAs, a análise celular em tempo real foi realizada logo após a eletroporação para superexpressão gênica com mRNA sintético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.