A análise de alterações na função contrátil e integridade celular de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC é de imensa importância para o desenvolvimento de medicamentos não clínicos. Um sistema híbrido de análise celular de 96 poços aborda ambos os parâmetros de maneira fisiológica e em tempo real para obter resultados confiáveis e relevantes para o ser humano, necessários para uma transição segura para os estágios clínicos.
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Artigo de método
Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco
Neste artigo
Resumo
Resumo
A avaliação da contratilidade cardíaca é de imensa importância para o desenvolvimento de novas terapêuticas e sua transição segura para os estágios clínicos. Embora os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) prometam servir como um modelo relevante para o ser humano em fases pré-clínicas de descoberta de medicamentos e farmacologia de segurança, sua maturidade ainda é controversa na comunidade científica e em constante desenvolvimento. Apresentamos uma tecnologia híbrida de contratilidade e impedância/potencial de campo extracelular (EFP), adicionando recursos significativos de promaturação a uma plataforma de 96 poços padrão da indústria.
O sistema de impedância/EFP monitora a funcionalidade celular em tempo real. Além da taxa de batimento das células contráteis, as leituras de espectroscopia de impedância elétrica detectam alterações morfológicas induzidas por compostos, como densidade celular e integridade da monocamada celular. No outro componente do sistema de análise de células híbridas, as células são cultivadas em membranas bio-compatíveis que imitam o ambiente mecânico do tecido cardíaco real. Este ambiente fisiológico suporta a maturação de hiPSC-CMs in vitro, levando a respostas contráteis semelhantes a mais adultos, incluindo efeitos inotrópicos positivos após o tratamento com isoproterenol, S-Bay K8644 ou omecamtiv mecarbil. Parâmetros como a amplitude da força de contração (mN/mm2) e a duração do batimento também revelam efeitos a jusante de compostos com influência nas propriedades eletrofisiológicas e no manuseio do cálcio.
O sistema híbrido fornece a ferramenta ideal para a análise holística de células, permitindo a avaliação pré-clínica do risco cardíaco além das perspectivas atuais de ensaios baseados em células relevantes para humanos.
Introdução
Um dos principais objetivos do desenvolvimento de medicamentos modernos é a melhoria da taxa de sucesso do banco ao leito de novas terapêuticas no pipeline de descoberta de medicamentos. O teste farmacológico de segurança desses novos medicamentos geralmente revela reações adversas a medicamentos no sistema cardiovascular que representam quase um quarto da taxa de atrito de medicamentos nos estágios pré-clínicos1. O desenvolvimento e a integração de novas metodologias de abordagem (NAMs) desempenham um papel fundamental na modernização da avaliação pré-clínica, em particular dos órgãos da bateria central, como o coração. Como essas metodologias....
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Protocolo
NOTA: O fluxo de trabalho para a contratilidade e a medição da impedância/EFP é apresentado na Figura 2 Suplementar.
1. Revestimento da placa
- Abra a embalagem selada a vácuo e retire a placa de 96 poços. Os procedimentos de manuseio para placas de 96 poços de ambos os módulos são os mesmos. Deixe a placa de contração coberta pelo protetor de membrana fornecido adicionalmente até a medição no módulo de contratilidade.
- Revestir as placas flexíveis de 96 poços para semear cardiomiócitos.
- Prepare uma solução diluída de revestimento de gel EHS transferindo 2,75 mL de solução pronta par....
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Resultados
Os efeitos do inibidor de quinase erlotinib sobre a contratilidade dos CM-hiPSC são mostrados na Figura 1. As células foram tratadas com concentrações variando de 10 nM a 10 μM por 5 dias e os parâmetros de batimento foram registrados diariamente. O erlotinibe, um EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e inibidor da tirosina quinase com um risco comparativamente baixo de cardiotoxicidade, teve uma dose menor e um efeito dependente do tempo nos CM-hiPSC apenas em concentrações na .......
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Discussão
O sistema híbrido impedância/EFP/contratilidade é uma metodologia abrangente para avaliação farmacológica e toxicológica de alta segurança de rendimento de passivos cardíacos para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos. Ele fornece uma abordagem moderna para testes de segurança pré-clínicos sem o uso de modelos animais, mas com maiores capacidades de rendimento que reduzem significativamente o tempo e os custos. Este sistema tem o potencial de ser usado como uma abordagem complementar para o Langendorff Heart e o.......
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Divulgações
B.L., M.Go. e P.L. são empregados na innoVitro GmbH, fabricante das placas flexíveis. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. e S.S. são empregados na Nanion Technologies GmbH, fabricante do dispositivo híbrido.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por subvenções do Ministério Federal Alemão para Assuntos Econômicos e Ação Climática (ZIM) e do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (KMUinnovativ). Agradecemos à FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, EUA) por gentilmente fornecer cardiomiócitos e à Ncardia B.V. (Leiden, Holanda) por gentilmente fornecer cardiomiócitos, usados neste estudo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cardiomiócitos humanos comerciais derivados de iPSC | Centrífuga Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| (tubos de 50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| pipeta ajustável de 12 canais (100-1250 μ L) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS com Ca2+ e Mg2+GE | Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 placa de poço profundo | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| gel EHS | Gel de matriz extracelular | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte dispositivo híbrido | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Sistema de análise de células híbridas |
| Placas de Sensor FLX-96 FLEXcyte Nanion | Technologies | 20 1010 | |
| Solução estoque de fibronectina (Opcional ao Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Cardiomiócitos derivados de iPSC humano Meio de plaqueamento e manutenção | FCDI | R1059 | |
| Incubadora (37 ° C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Capuz de Fluxo Laminar | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Placas de Sensor 2.0 mm transparentes | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pontas de pipeta (1250µ L) | de 94420813 | Integra Biosciences | |
| Integra Biosciences | 8096-11 | ||
| Pipeta sorológica (por exemplo, 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Pipeta ajustável de canal único (por exemplo, 100-1000 μ L) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Sistema de aspiração a vácuo | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Opcional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Automação de laboratório Robô |
| Banho-maria (37 ° C) | Thermo Fisher 15365877 |
Referências
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I.
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Reimpressões e permissões
