Aqui, descrevemos um protocolo para visualização de células-tronco proliferantes na água-viva Cladonema. A hibridização in situ fluorescente de montagem completa com um marcador de células-tronco permite a detecção de células-tronco, e a marcação de 5-etil-2'-desoxiuridina permite a identificação de células em proliferação. Juntas, células-tronco em proliferação ativa podem ser detectadas.
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Artigo de método
Hibridização In Situ fluorescente e marcação de 5-etil-2'-desoxiuridina para células-tronco em águas-vivas hidrozoárias Cladonema pacificum
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os cnidários, incluindo anêmonas do mar, corais e águas-vivas, exibem morfologia e estilos de vida diversos que se manifestam em pólipos sésseis e medusas de natação livre. Como exemplificado em modelos estabelecidos, como Hydra e Nematostella, as células-tronco e/ou células proliferativas contribuem para o desenvolvimento e regeneração de pólipos cnidários. No entanto, os mecanismos celulares subjacentes na maioria das águas-vivas, particularmente no estágio de medusa, são em grande parte obscuros e, portanto, o desenvolvimento de um método robusto para identificar tipos específicos de células é crítico. Este trabalho descreve um protocolo para a visualização de células-tronco proliferantes na água-viva hidrozoária Cladonema pacificum. Cladonema medusae possuem tentáculos ramificados que crescem continuamente e mantêm a capacidade regenerativa durante toda a sua fase adulta, fornecendo uma plataforma única com a qual estudar os mecanismos celulares orquestrados por células proliferantes e / ou semelhantes a troncos. A hibridização in situ fluorescente de montagem completa (FISH) usando um marcador de células-tronco permite a detecção de células-tronco, enquanto a marcação de pulso com 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU), um marcador de fase S, permite a identificação de células em proliferação. Combinando a rotulagem FISH e EdU, podemos detectar células-tronco em proliferação ativa em animais fixos, e essa técnica pode ser amplamente aplicada a outros animais, incluindo espécies de águas-vivas não modelo.
Introdução
Cnidaria é considerado um filo de metazoários basalmente ramificado contendo animais com nervos e músculos, colocando-os em uma posição única para a compreensão da evolução do desenvolvimento e fisiologia animal 1,2. Os cnidários são categorizados em dois grupos principais: Anthozoa (por exemplo, anêmonas do mar e corais) possuem apenas larvas de plânula e estágios sésseis, enquanto Medusozoa (membros de Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa e Cubozoa) normalmente assumem a forma de medusas de natação livre, ou águas-vivas, bem como larvas de plânula e pólipos. Os cnidários comumente exibem alta capacidade regenerati....
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Protocolo
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.
1. Síntese da sonda
- Extração de RNA
- Coloque três medusas de Cladonema vivas que são cultivadas em água do mar artificial (ASW) em um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta de transferência de 3,1 mL com a ponta cortada e remova o máximo de ASW possível.
NOTA: ASW é preparado pela dissolução de uma mistura de sais minerais em água da torneira com neutralizador de cloro; a gravidade específica final (S.G.) é 1.018 ou as partes por mil (ppt) são ~27....
- Coloque três medusas de Cladonema vivas que são cultivadas em água do mar artificial (ASW) em um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta de transferência de 3,1 mL com a ponta cortada e remova o máximo de ASW possível.
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Resultados
Os tentáculos de Cladonema têm sido utilizados como modelo para estudar os processos celulares de morfogênese e regeneração15,16,17. A estrutura do tentáculo é composta por um tubo epitelial onde as células-tronco, ou células i, estão localizadas na região proximal, denominada bulbo tentáculo, e novos ramos são adicionados sequencialmente à parte posterior da região distal do bulbo ao longo do lado adaxial (
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Discussão
Células proliferantes e células-tronco são importantes fontes celulares em diversos processos, como morfogênese, crescimento e regeneração21,22. Este trabalho descreve um método de cocoloração do marcador de células-tronco Nanos1 por marcação FISH e EdU em Cladonema medusae. Trabalhos anteriores utilizando a marcação EdU ou BrdU sugeriram que as células proliferativas se localizam nos bulbos dos tentáculos16,17,
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela AMED sob o número de concessão JP22gm6110025 (para Y.N.) e pelo JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (para Y.N.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Pipeta de transferência Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 primer | 5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3' | ||
| Cladonema pacificum Nanos1 primário | 5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi primer | 5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3' | ||
| Kit de Proliferação de Células EdU Click-iT para Imagem, Corante Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C10337 | Kit EdU |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | neutralizador de cloro |
| DIG Kit de Detecção de Ácido Nucleico Reagente de Bloqueio | Roche | 11175041910 | tampão de bloqueio |
| Mistura de marcação de RNA DIG | Roche | 11277073910 | |
| TDT | Promega | P117B | |
| ECOS célula competente DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | célula competente |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | kit de extração de gel |
| gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamida | Wako | 068-00426 | |
| Sal de heparina sódica de suínos | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropil-β-D(-)-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Ágar | Invitrogen | 22700-025 | placa de ágar |
| LB Base de caldo | Invitrogen | 12780-052 | LB ácido |
| maleico | Wako | 134-00495 | |
| mini colunas de RNA de rotação rápida | Roche | 11814427001 | coluna de limpeza |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Espectrofotômetro com Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | espectrofotômetro |
| Polioxietileno (20) Monolaurato de Sorbitano (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogeneizador |
| Proteinase K | Nacaraí Tesque | 29442-14 | |
| Inibidor de RNase | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | Kit de isolamento de RNA total | 74004 |
| RQ1 Dnase sem RNase | Promega | M6101 | |
| Tampão de Citrato de Sódio Salino 20x pó (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mistura de sais minerais |
| T3 RNA polimerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polimerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Indutor de Hibridização |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polimerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cianina 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | técnica de amplificação de sinal de tiramida (TSA) |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | microscópio confocal de varredura a laser |
Referências
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire....
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Reimpressões e permissões
