Apresentamos um protocolo para um modelo de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) em camundongos. Para induzir a PAIR, desenvolvemos um dispositivo novo e simples usando plástico corrugado, uma gaiola armadilha para ratos e um alto-falante. O potencial evocado auditivo de tronco encefálico e a imagem de imunofluorescência foram empregados para avaliar a função auditiva e o dano às células ciliadas externas, respectivamente.
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Artigo de método
Condições experimentais modificadas para perda auditiva induzida por ruído em camundongos e avaliação da função auditiva e lesão das células ciliadas externas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um modelo animal de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) é útil para patologistas, terapeutas, farmacologistas e pesquisadores da audição entenderem completamente o mecanismo da PAIR e, posteriormente, otimizarem as estratégias de tratamento correspondentes. Este estudo tem como objetivo criar um protocolo aprimorado para o desenvolvimento de um modelo de PAIR em camundongos. Camundongos C57BL/6J machos foram utilizados neste estudo. Camundongos não anestesiados foram expostos a ruídos intensos (1 e 6 kHz, apresentados simultaneamente a 115-125 dB NPS-A) continuamente por 6 h por dia durante 5 dias consecutivos. A função auditiva foi avaliada 1 dia e 1 semana após a exposição ao ruído, por meio do potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE). Após a medida do PEATE, os camundongos foram sacrificados e seus órgãos de Corti foram coletados para coloração por imunofluorescência. A partir das medidas do potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE), observou-se perda auditiva significativa 1 dia após a exposição ao ruído. Após 1 semana, os limiares auditivos dos camundongos experimentais diminuíram para ~80 dB NPS, que ainda era um nível significativamente maior do que os camundongos controles (~40 dB NPS). A partir dos resultados da imagem de imunofluorescência, as células ciliadas externas (CCE) mostraram-se danificadas. Em resumo, criamos um modelo de PAIR usando camundongos machos C57BL/6J. Um novo e simples dispositivo para gerar e fornecer ruído de tom puro foi desenvolvido e então empregado. As medidas quantitativas dos limiares auditivos e a confirmação morfológica do dano das CCE demonstraram que o ruído aplicado induziu com sucesso uma perda auditiva esperada.
Introdução
Cerca de 1,3 bilhão de pessoas no mundo sofrem de perda auditiva devido à exposição ao ruído1. O objetivo deste estudo foi estabelecer um passo a passo claro para a indução e confirmação da perda auditiva induzida por ruído (PAIR). A PAIR resulta de degeneração/destruição das células ciliadas (HCs) e neurônios do gânglio espiral (SGNs), dano nos estereocílios do HC e/ou perda de sinapses entre os HCs internos da cóclea e os SGNs. Tais anormalidades também podem causar zumbido e prejuízo na percepção da fala (principalmente em ambientes acústicos complexos), além da PAIR. As funções sociais, psicológicas e cognitivas podem ser afetadas sequencialmente por essas deficiências fisiológicas 2,3,4,5,6.
Em estudos pré-clínicos relacionados à PAIR baseados em camundongos, as linhagens de camundongos mais populares são CBA/CaJ 2,3,6,7 e C57BL/6 4,5,8. Além disso, os camundongosmachos 3,4,7 são mais comumente utilizados do que as fêmeas, pois o estrógeno tem um efeito protetor sobre a audição. Portanto, neste estudo foram utilizados apenas camundongos machos9. Após consulta à literatura, optou-se por 1 kHz e 6 kHz como as frequências do ruído aplicado. A intensidade do ruído aplicado foi de 115 dB NPS-A (ao redor da gaiola) a 125 dB NPS-A (no centro da gaiola). Após a exposição contínua dos camundongos experimentais ao ruído por 6 h por dia, durante 5 dias consecutivos, um ótimo aumento no limiar auditivo indicou que uma ótima extensão de PAIR foi gerada nos camundongos experimentais. As operações para o manuseio dos animais, construção do arranjo experimental e indução de ruído estão claramente descritas passo a passo no protocolo fornecido.
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Protocolo
Os experimentos em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Mackay Medical College. Camundongos C57BL/6J machos com oito semanas de idade foram comprados do National Laboratory Animal Center (Nova Taipei, Taiwan). Todos os camundongos foram criados e alojados de acordo com o protocolo animal padrão.
1. Indução de PAIR em camundongos
- Preparar a gaiola para os ratos experimentais
- Para isso, use uma gaiola armadilha para ratos com dimensões de 14 cm × 17 cm × 24 cm. Corte quatro pedaços de papelão ondulado em tamanhos adequados, fazendo-os caber na gaiola (13 cm × 23 cm e 13 cm × 16 cm).
- Para evitar que os ratos sejam cortados pela grade de malha, coloque duas das peças na parte inferior e na parte de trás, respectivamente. Coloque as outras duas peças perpendicularmente interligadas uma com a outra, para dividir o espaço dentro da gaiola em quartos.
- Realizar este estudo em uma caixa à prova de som. Coloque um alto-falante de 8,5 cm na frente da gaiola e coloque o alto-falante e a gaiola em uma caixa à prova de som.
- Abra o software de aplicativo CLIO
- Mova o cursor para o ícone do alto-falante e clique em TwoSin. Digite e altere o valor de Freq 1 para 1000 Hz, Freq 2 para 6000 Hz, e clique em OK para começar a reproduzir o som.
- Na guia Leq, altere dBV para dBSPL. Depois de definir a hora na interface do software, clique no botão triângulo verde para reproduzir o som.
- Coloque um microfone na frente do alto-falante a uma distância de 8,5 cm para calibrar o nível de ruído (consulte Arquivo Suplementar 1). Ajuste o nível de ruído para 125 dB SPL-A e monitore continuamente por pelo menos 3 minutos para garantir que o nível de ruído seja suficientemente estável. Use um gerador, um analisador e um amplificador para criar e controlar o ruído. (Gráfico 1)
NOTA: Faça esta etapa em uma caixa à prova de som para evitar danos à audição do operador. - Coloque quatro camundongos C57BL/6J machos na gaiola (um para cada quarto) para exposição ao ruído. Atribua aleatoriamente os ratos em cada trimestre durante a exposição ao ruído. Coloque um microfone na parte superior da gaiola para monitorar o nível de ruído durante a exposição ao ruído (Figura 2).
NOTA: Faça esta etapa em uma caixa à prova de som para evitar danos à audição do operador. - Expor os ratos ao ruído nas frequências de 1 kHz e 6 kHz continuamente durante 6 h por dia, durante 5 dias consecutivos.
- Medir os limiares auditivos dos camundongos 1 dia após a exposição ao ruído (ou seja, no6º dia) medindo o PEATE. Após a aferição do PEATE, sacrificar todos os camundongos envolvidos e colher suas cócleas (Figura 3).
2. Avaliação dos limiares auditivos de tronco encefálico (PEATE)
- Utilizar um sistema comercial de teste ABR projetado especificamente para pequenos animais10.
- Injetar intraperitonealmente uma mistura de tiletamina e zolazepam (40 mg/kg) e xilazina (9,3 mg/kg) nos camundongos para anestesia geral.
NOTA: A avaliação do PEATE leva ~2 h. Certifique-se de fornecer suporte térmico através de uma almofada de aquecimento e aplique pomada ocular para evitar o ressecamento enquanto o mouse estiver sob anestesia. - Medir o PEATE no camundongo sob anestesia geral. Coloque eletrodos de agulha subdérmica (12 mm) no vértice, atrás do pavilhão auricular da orelha esquerda e de volta perto da cauda para medir o limiar auditivo.
- Apresentar estímulos acústicos utilizando uma caixa acústica posicionada a 1 cm da orelha esquerda do animal.
- Use um osciloscópio para controlar os estímulos acústicos. Escolha Onda Sine para os estímulos e 10k para a escala de janela. Gire o botão Frequência para obter a frequência desejada dos estímulos acústicos.
- Ajuste a intensidade do estímulo girando o botão AMLP no gerador de funções. Obter a intensidade de estímulo desejada girando o botão AMLP para uma tensão adequada, calculada a partir da calibração.
- Coletar as medidas do PEATE sob uma série de intensidades de estímulo, de 10 dB NPS a 100 dB NPS, com tamanho de passo de 10 dB.
NOTA: Meça o limiar auditivo em uma caixa à prova de som. O nível mínimo de intensidade do estímulo que poderia dar origem a uma onda V discernível no sinal coletado foi assumido como sendo o limiar do PEATE10,11 (Figura 4). Após a avaliação do PEATE, monitorar o animal até que ele se recupere da anestesia (~1 h).
3. Exame microscópico
- Fixação do tecido colhido
- Após as medidas do PEATE, sacrificar o camundongo injetando intraperitonealmente uma mistura de tiletamina e zolazepam (100 mg/kg) e xilazina (23,25 mg/kg) para o exame microscópico.
- Colher as cócleas do camundongo e mergulhá-las imediatamente em formaldeído (AF) a 10% para fixação (duas cócleas/mL) por pelo menos 8 h a 4 °C.
- Após a fixação, substituir a solução de AG por uma solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10% para descalcificação durante 3-4 dias a 4 °C. Em seguida, verifique cada cóclea com uma pinça para confirmar se as cócleas estão suficientemente amolecidas.
- Coloque as cócleas em uma placa de Petri preenchida com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e corte o órgão espiral de Corti (OC) (cada cóclea descalcificada) em três seções - giro basal, giro médio e giro apical - para coloração tecidual.
- Sob microscópio dissecante (aumento: 8x-35x), remova as estruturas ósseas (escala vestibular, escala timpânica e modíolo) das cócleas descalcificadas e obtenha os tecidos moles, incluindo o CO (espessura: cerca de 40 μm).
- Coloração por imunofluorescência da cóclea
- Preparação do tampão de bloqueio: Preparar soluções de albumina de soro bovino (BSA) a 2% e Triton X-100 a 0,2% em PBS.
- Transfira o tecido a ser corado da placa de Petri para um tubo de microcentrífuga e mergulhe o tecido em 0,1 mL do tampão de bloqueio por 2 h à temperatura ambiente (TR).
- Preparação do tampão de anticorpos primários Myo7A: Diluir o anticorpo primário Myo7A no tampão de bloqueio a uma proporção de volume de 1:200.
- Tratar o tecido no tubo de microcentrífuga com 100 μL de tampão primário de anticorpos Myo7A durante 2 h na RT.
- Enxaguar o tecido três vezes em PBS por 5 min cada.
- Preparação do anticorpo secundário Myo7A (Myo7A-Rb-488) e do anticorpo faloidina (faloidina-594): Anticorpo secundário Myo7A diluído (1:400) e anticorpo faloidina (1:200) no tampão de bloqueio.
- Tratar o tecido com 100 μL de anticorpo secundário Myo7A e tampão de anticorpos faloidínicos por 2 h na RT.
- Após o tratamento com anticorpos + anticorpos contra faloidina, enxaguar o tecido em PBS três vezes, por 5 min cada.
- Transfira o tecido enxaguado do tubo de microcentrífuga para uma placa de Petri preenchida com PBS usando uma pipeta de transferência plástica de 1 mL com uma ponta de corte.
- Para se preparar para o exame microscópico, desdobre o tecido, coloque-o em uma lâmina de vidro e adicione 15 μL de meio fluoromount 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) no tecido para cobri-lo completamente. Coloque uma tampa de vidro suavemente sobre o tecido. Deixe a lâmina durante a noite no RT antes de selá-la com esmalte.
- Aquisição de imagens
- Adquira imagens 2D usando um microscópio de fluorescência vertical e um software de aquisição de imagens.
- Antes de realizar o exame microscópico, centralize o tecido no campo de visão e ajuste a sensibilidade para ISO 100. Ajuste o tempo de exposição inicialmente clicando no botão Modo Automático do software e, em seguida, ajuste manualmente clicando no botão Ajustar para otimizar a relação sinal-ruído.
- Ajuste o comprimento de onda da luz incidente para excitar os fluoróforos girando o cubo de fluorescência. Pseudocores foram utilizadas para marcar a emissão de diferentes rótulos fluorescentes (luz azul: DAPI; luz verde: Myo7A; luz vermelha: faloidina).
- Ao escanear a amostra de tecido, gere e colete os dados de imagem como .tif e .jpg arquivos de imagem.
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Resultados
Alteração do limiar auditivo do PEATE
O limiar auditivo dos camundongos foi medido por meio do PEATE ton-burst 1 dia ou 1 semana após a exposição ao ruído. Observou-se aumento significativo do limiar auditivo nas três frequências testadas (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB NPS; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB NPS; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB NPS) 1 dia após a exposição ao ruído (ou seja, o 6ºdia). A recuperação parcial da audição ocorreu 1 semana após a exposição ao ruído (ou seja, o13º dia), mas os ...
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Discussão
A PAIR pode ser dividida em dois tipos: a PAIR temporária, que mostra um desvio temporal do limiar auditivo, e a PAIR permanente, que é caracterizada por uma mudança permanente do limiar auditivo. Acredita-se que a perda auditiva observada no6º dia (1 dia após a exposição ao ruído) seja uma combinação destes dois tipos. Neste caso, o limiar auditivo apresentaria uma recuperação gradual ao longo do tempo devido ao componente temporal da perda auditiva. Em nossos estudos experimentais preliminares, os resultados...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos as bolsas do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST) do Governo de Taiwan (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3), e bolsas de pesquisa intramuros do Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1/4" grupo padrão GRAS do microfone do livre-campo | do | 428158 para o | |
| módulo de entrada do amplificador | BIOPAC | para a resposta auditiva do tronco encefálico | |
| Bio-amplificador, BIO100C | BIOPAC | para a resposta auditiva do tronco encefálico | |
| Albumina bovina | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence que mancha |
| software | de CellsensCiência da vida | Aquisição da imagem | |
| Fluoromount plástico | |||
| de DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | Coloração da imunofluorescência |
| Ácido Ethylenediaminetetraacético | SIGMA | E5134 | |
| Amplificador evocado da resposta da | BIOPAC | Para a resposta | |
| auditiva do tronco encefálicoFormaldeído | APLHA | F030410 | Fixação do sistema de aquisição de dados de |
| alto desempenho coclear, MP160 | BIOPAC | Para resposta auditiva do tronco encefálico | |
| Cabo de extensão modular, MEC110C | BIOPAC | Para resposta auditiva do tronco encefálico | |
| Anticorpo primário Myo7A | Proteus | 25-6790 | Coloração por imunofluorescência |
| Anticorpo secundário Myo7A | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Eletrodo de agulha para coloração de imunofluorescência |
| , unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | Para resposta auditiva do tronco encefálico | |
| anticorpo de faloidina | Alexa Fluor | A12381 | Coloração de imunofluorescência |
| solução salina tamponada com fosfato | SIGMA | P4417 | |
| armadilha de rato | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- solução para injeção de xilazina | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Amplificador de som, MT-1000 | unika | Para exposição ao ruído | |
| Gerador/analisador/diversos de som, FW-02 | CLIO | 620300719 | Para exposição ao ruído |
| Câmara à prova | de som IEA Tecnologia | Para exposição ao ruído e Alto-falante ABR | |
| Electroacústica IEA | Para exposição ao ruído | ||
| Módulo Estimulador, STM100C | BIOPAC | Para resposta auditiva do tronco encefálico | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Coloração por imunofluorescência |
| Conjunto de Tubephone, OUT101 | BIOPAC | Para resposta auditiva do tronco encefálico | |
| Microscópio vertical, BX53 | Olympus | Aquisição de imagem | |
| Zoletil | Virbac |
Referências
- World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).
- Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
- Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).
- Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
- Tsai, S. C. -S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254(2022).
- Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
- Yu, S. -K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
