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Artigo de método

In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D

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DOI:

10.3791/64291

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9 de dezembro de 2022

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1Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, National Engineering Research Centre of Immunological Products, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA, 2Institute of Combined Injury of PLA, College of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University of Chinese PLA

Neste artigo

Resumo

O protocolo apresenta métodos detalhados para avaliar se o adjuvante da nanoemulsão ofiopogonina D promove respostas imunes celulares eficazes.

Resumo

Como ingrediente principal das vacinas, os adjuvantes podem induzir ou melhorar diretamente as respostas imunes poderosas, generalizadas, inatas e adaptativas associadas aos antígenos. Ophiopogonin D (OP-D), um componente purificado extraído da planta Ophiopogon japonicus, foi encontrado para ser útil como um adjuvante da vacina. Os problemas de baixa solubilidade e toxicidade do OP-D podem ser efetivamente superados usando um método de emulsificação de baixa energia para preparar a ofiopogonina D (NOD) em nanoemulsão. Neste artigo, uma série de protocolos in vitro para avaliação da atividade celular são examinados. Os efeitos citotóxicos da L929 foram determinados usando um ensaio kit-8 de contagem celular. Em seguida, os níveis de citocinas secretadas e o número de células imunes correspondentes após a estimulação e cultura de esplenócitos de camundongos imunizados foram detectados pelos métodos ELISA e ELISpot. Além disso, a capacidade de captação de antígenos em células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs), que foram isoladas de camundongos C57BL/6 e amadurecidas após incubação com GM-CSF mais IL-4, foi observada por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). É importante ressaltar que a ativação de macrófagos foi confirmada pela medição dos níveis de citocinas IL-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por kits ELISA após a cocultura de macrófagos peritoneais (PMs) de camundongos em branco com o adjuvante por 24 h. Espera-se que este protocolo forneça a outros pesquisadores abordagens experimentais diretas e eficazes para avaliar as eficácias da resposta celular de novos adjuvantes vacinais.

Introdução

As vacinas são um meio importante de prevenir e tratar doenças infecciosas e não transmissíveis. A adição adequada de adjuvantes e veículos de entrega às formulações de vacinas é benéfica para aumentar a imunogenicidade dos antígenos e gerar respostas imunes duradouras1. Além do alúmen adjuvante clássico (sal de alumínio), existem seis tipos de adjuvantes para vacinas que são atualmente comercializados: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 e Matrix-M5. Geralmente, quando o corpo humano encontra um ataque viral, a primeira e a segunda linhas de defesa (pele, mucosa e macrófagos) assumem a liderança na limpeza do vírus e, finalmente, a terceira linha de defesa, envolvendo os órgãos imunológicos e as células imunes, é ativada. O alumínio e os sais de alumínio têm sido os adjuvantes mais utilizados para vacinas humanas desde o início da década de 1920, provocando uma resposta imune inata eficaz6. No entanto, tem sido proposto que a ativação de células apresentadoras de antígenos (APCs) por adjuvantes clássicos, que estimula as células imunes a gerar conjuntos específicos de citocinas e quimiocinas, é o mecanismo pelo qual os adjuvantes funcionam e pode ser uma das razões pelas quais os adjuvantes exercem apenas efeitos transitórios sobre respostas imunes específicas7. A presença de adjuvantes licenciados limitados para uso humano é um fator restritivo para o desenvolvimento de vacinas que provocam respostas imunes eficazes8.

Atualmente, um número crescente de estudos adjuvantes está demonstrando a capacidade de induzir uma forte resposta imune celular em camundongos. Demonstrou-se que o QS-21 induz uma resposta imune equilibrada do T-helper 1 (Th1) e do T-helper 2 (Th2), produz níveis mais altos de títulos de anticorpos e prolonga a proteção como adjuvante, mas sua forte toxicidade e propriedades hemolíticas limitam seu desenvolvimento como adjuvante clínico autônomo 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopiranosídeo) é uma das saponinas esteroides isoladas da raiz da planta medicinal chinesa Ophiopogon japonicas4. Além disso, é o principal componente farmacologicamente ativo (Shen Mai San) encontrado em Radix Ophiopogonis e é conhecido por ter certas propriedades farmacológicas11. Além disso, é um membro da família Liliaceae e é amplamente utilizado por seus efeitos inibitórios e protetores na inflamação celular e lesão miocárdica. Por exemplo, o OP-D melhora as lesões semelhantes à dermatite atópica induzidas por DNCB e as células inflamatórias HaCaT do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em camundongos BALB/c12. É importante ressaltar que o OP-D promove a proteção antioxidante do sistema cardiovascular e protege o coração contra a lesão autofágica induzida pela doxorrubicina, reduzindo a geração de espécies reativas de oxigênio e interrompendo os danos na membrana mitocondrial. Experimentos mostraram que tomar OP-D com monodesmosídeo ajuda a aumentar a saúde imunológica, aumentar a contagem de glóbulos brancos e a síntese de DNA e fazer com que os anticorpos durem maistempo 13. Verificou-se anteriormente que o OP-D tem um efeito adjuvante14.

As nanoemulsões são nanoformulações de óleo em água compostas por uma combinação de surfactantes, óleo, cosurfactantes e água12,15. Esses desenhos de nanovacinas permitem que antígenos e adjuvantes sejam encapsulados juntos para melhorar a estimulação imunológica, proteger os antígenos e promover a maturação das células dendríticas (DC)16. Para o desenvolvimento desses novos adjuvantes obtidos a partir da triagem, é importante encontrar métodos apropriados para avaliar suas habilidades de resposta celular.

O objetivo deste protocolo é avaliar sistematicamente se os adjuvantes podem aumentar a fagocitose e a expressão de células imunes em cultura de células in vitro e elaborar os principais métodos experimentais. O experimento é dividido em quatro subseções: (1) a toxicidade das células OP-D e NOD para L929 é determinada pelo ensaio kit-8 de contagem de células (CCK-8); (2) os níveis de citocinas de IFN-γ endócrino e IL-17A e os números celulares correspondentes em camundongos imunizados são detectados por estimulação de esplenócitos e ensaios de ELISpot; (3) a capacidade de apresentação do antígeno das CDs após estimulação adjuvante é observada por microscopia confocal; e (4) são detectados os três tipos de citocinas, IL-1β, IL-6 e TNF-α, nos sobrenadantes obtidos de macrófagos peritoneais (PMs) em camundongos normais cocultivados com adjuvantes.

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Protocolo

Todos os experimentos celulares foram realizados em um laboratório de engenharia celular equipado com salas de cirurgia básicas, salas de tampão, salas de cultura estéreis e salas de identificação e análise. O ambiente e as condições de trabalho estavam livres de contaminação microbiana e outros fatores prejudiciais. Os experimentos com animais foram conduzidos com base nas Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar e Ética Animal de Laboratório da Terceira Universidade Militar de Medicina.

1. Autoclave e preparação de materiais

  1. Preparar os reagentes e consumíveis, tais como solução salina tamponada com fosfato (PBS), tesoura, pinça e malha abrasiva, por esterilização térmica húmida por autoclave a 121 °C durante 20 min.
  2. Para os reagentes e equipamentos necessários, consulte a Tabela de Materiais. Para a fórmula da nanoemulsão em branco (BNE), verifique a Tabela 1.

2. Ensaio de citotoxicidade L929

  1. Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 °C. Recolher um tubo de células L929 congeladas a partir de azoto líquido e descongelar rapidamente num banho de água a 37 °C.
  2. Pipetar as células para um tubo centrífugo estéril de 15 mL rapidamente após o descongelamento, adicionar 2 mL de DMEM e misturar bem.
  3. Centrifugar as amostras a 129 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Em seguida, adicione 2mL de DMEM para ressuspender as células e centrifugar as amostras novamente a 129 x g por 5 min.
  4. Descarte o sobrenadante, adicione 6 mL de meio DMEM completo (contendo 10% de FBS) para ressuspensão, e transfira para um frasco de cultura T25 em incubadora de 37 °C com 5% de CO2 para cultura por 48 h.
  5. Rejeitar o meio de cultura no balão de cultura e lavar as células duas vezes com 2 ml de PBS. Em seguida, adicione 1 mL de tripsina a 0,25% para digerir as células por 1-2 min a 37 °C.
  6. Quando o arredondamento das células for observado, adicione 4 mL de meio DMEM completo para terminar a digestão imediatamente e misture bem. Em seguida, aspirar as células em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e centrífuga a 129 x g por 5 min.
  7. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio DMEM completo. Use uma suspensão celular de 20 μL para contagem de células usando placas de contagem de células e dilua as células restantes para 1 x 105 células/mL com meio DMEM completo.
  8. Adicionar 100 μL de água ultrapura à periferia de uma placa de 96 poços e adicionar 100 μL de diluente celular apenas aos poços internos. Colocar a placa na incubadora para cultura aderente durante 4 h a 37 °C.
  9. Após a adesão das células, adicione OP-D e NOD separadamente em meio completo DMEM a um volume final de 200 μL/poço (as concentrações finais de cada fármaco são 480 μg/mL, 240 μg/mL, 120 μg/mL, 60 μg/mL e 30 μg/mL). Para cada concentração, use três poços como replicantes. Em seguida, coloque as células de volta na incubadora e faça cultura por mais 24 horas.
  10. Diluir CCK-8 a 10% com meio DMEM completo e adicionar diluições de 100 μL/poço contendo as soluções adjuvante e celular à placa de 96 poços. Coloque a placa de volta na incubadora e incube por mais 2-3 h.
  11. Misture frequentemente enquanto chapeia a solução celular para evitar a não homogeneidade devido à precipitação celular. Agite suavemente a placa várias vezes antes e depois de adicionar o CCK-8 para misturar bem o meio e a solução de CCK-8.
  12. Meça a absorbância a 450 nm usando um leitor de microplacas. Configure um poço de zeragem com apenas médio e CCK-8 para um valor de absorbância de linha de base. Calcule valores precisos de absorbância subtraindo o valor de absorvância zerado do valor de absorvência obtido ao plotar.
  13. Confirme se não há bolhas presentes em nenhum poço antes de testar com o leitor de microplacas, pois as bolhas interferirão no ensaio.

3. Estimulação dos eplenócitos

  1. Imunizar camundongos BALB/c com idade entre 6-8 semanas com 30 μg de antígeno proteico mais 30 μg de adjuvante através de uma injeção intramuscular (200 μL) no dia 0, dia 7 e dia 14 de acordo com os seguintes grupos experimentais: (1) grupo PBS, (2) grupo antígeno (Ag), (3) antígeno + grupo OP-D (Ag/OP-D), (4) antígeno + BNE (Ag/BNE), (5) grupo antígeno + NOD (Ag/NOD) e (6) antígeno + AlPO4 (Ag/Al).
  2. Sala de preparação: No dia 24 após a imunização primária, retire os ratos da sala de animais e eutanasie-os por uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%. Coloque os ratos em um prato de vidro e mergulhe em álcool a 75% por 5 min.
  3. Coloque os tubos de centrífuga em um rack de tubos de centrífuga, numere as placas de Petri descartáveis e adicione 5 mL de PBS a cada placa de Petri com uma pipeta de 10 mL.
  4. Faça uma incisão de 6-8 cm com uma tesoura no meio do lado ventral esquerdo do rato, rasgue a pele, exponha a parede abdominal e localize a longa faixa vermelha do baço.
  5. Levante o peritônio no lado inferior do baço com pinças, corte-o aberto e vire-o para cima para expor o baço. Levante o baço com pinças, separe o tecido conjuntivo sob o baço com uma tesoura oftálmica e remova o baço.
  6. Coloque o baço em uma placa de Petri contendo 5 mL de PBS e moça com peneira (200 malhas, 70 μm) e barra de moagem. Após a moagem, transfira o líquido para um tubo de centrífuga de 15 mL com um conta-gotas de cotovelo de acordo com a numeração.
  7. Centrifugar o líquido a 453 x g durante 5 minutos. Descarte o sobrenadante, adicione 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos a cada tubo, ressuspenda as células e lise à temperatura ambiente por 10 min.
  8. Adicione 10-12 mL de PBS a cada tubo, misture o tubo de cabeça para baixo e centrifugar a 453 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante, adicione 10 mL de PBS a cada tubo de centrífuga e ressuspenda as células.
  9. Pegue 20 μL de cada amostra em um poço da placa de contagem de células e registre o número de células vivas usando um contador de células automatizado.
  10. Centrifugar as amostras a 453 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Ressuspender as células, diluir para 2,5 x 106 células/mL com meio RF-10 (informações de formulação na Tabela 2) e adicionar a uma placa de 96 poços a 100 μL/poço.
  11. Diluir o antígeno com meio RF-10 a 10 μg/mL, adicionar 100 μL a cada poço e incubar por 3 dias a 37 °C em 5% de CO2.
  12. Aspirar a suspensão celular obtida de cada grupo de células em tubos de centrífuga de 1,5 mL, centrífuga a 453 x g por 20 min e aspirar o sobrenadante em um tubo de centrífuga limpo.
  13. Realize a detecção de conteúdo IFN-γ e IL-17A estritamente de acordo com as instruções do kit ELISA. Os métodos e procedimentos são os seguintes.
  14. Preparar 1x solução de trabalho tampão de lavagem (fornecida com o kit), solução de concentração de gradiente padrão (solução padrão de citocinas diluídas a 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,3 pg/mL e 15,6 pg/mL no tampão de diluição R [1x] fornecido com o kit), solução de trabalho de anticorpos biotinilados (solução de anticorpo biotinilado diluído a 1:100 usando o tampão de diluição R [1x] fornecido com o kit para formar a solução de trabalho), e solução de trabalho treptavidina-HRP, conforme necessário.
  15. Adicionar 100 μL/poço de solução padrão de citocina diluída no poço padrão, 100 μL/poço de amostra no poço de amostra (o tampão de diluição R [1x] fornecido com o kit é usado para a diluição da amostra) e 100 μL/poço de tampão de diluição R (1x) no poço de controle em branco.
  16. Adicionar solução de trabalho de anticorpos biotinilados a 50 μL/bem. Misture bem, cubra com uma membrana de vedação e incube a 37 °C por 90 min.
  17. Retire o líquido dos poços e adicione 1x solução de trabalho tampão de lavagem a 300 μL/poço. Descarte o líquido dos poços após 1 min. Repita este processo 4x permitindo que o líquido seque em papel de filtro de cada vez.
  18. Adicionar 100 μL/poço de solução de trabalho treptavidina-HRP. Cobrir e incubar as amostras a 37 °C durante 30 minutos. Centrifugar as amostras a 453 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
    NOTA: A solução de lavagem que permanece no poço de reação durante o processo de lavagem deve ser cuidadosamente acariciada até que nenhuma marca d'água possa ser vista no papel de filtro.
  19. Adicionar TMB a 100 μL/poço, incubar as placas a 37 °C por 5-30 min no escuro e julgar a reação de terminação de acordo com a profundidade de cor no poço (azul escuro). Normalmente, 10-20 min para o desenvolvimento de cores pode alcançar bons resultados.
  20. Terminar a reação rapidamente adicionando a solução de parada a 100 μL/poço. Detectar o valor de absorbância a 450 nm no prazo de 10 minutos após a terminação.
    NOTA: Equilibre o reagente à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da utilização.

4. Ensaio ELISpot

  1. Realizar a imunização dos camundongos e a coleta de esplenócitos exatamente como descrito nas etapas 3.1-3.10 acima. Execute os ensaios para IFN-γ e IL-17A em estrita conformidade com as instruções do kit. Os métodos e procedimentos são os seguintes.
  2. Retire a placa da embalagem selada, lave 4x com PBS estéril (200 μL/poço) e adicione 1640 meios de cultura completos (200 μL/poço) para equilibrá-la à temperatura ambiente por 2 h.
  3. Retirar o meio e diluir a suspensão de esplêncitos com meio RF-10 a 2 x 105 células/mL, adicionando 50 μL de células e antígeno por poço (concentração final: 10 μg/mL).
  4. Colocar a placa numa incubadora humidificada a 37 °C com 5% de CO2 durante 48 h. Não mova a placa durante esse período e tome medidas para evitar a evaporação (por exemplo, envolva a placa com papel alumínio).
  5. Diluir o anticorpo de detecção (BVD6-24G2-biotina) para 1 μg/mL (1:1.000) em solução salina tamponada com fosfato (0,5 mL:100 mL) contendo 0,5% de soro fetal bovino (PBS-0,5% FBS). Adicionar 100 μL/poço à placa e incubá-la à temperatura ambiente durante 2 h após filtração através de uma membrana de 0,22 μm.
  6. Decantar o líquido nos poços, adicionar 1x tampão de lavagem a 200 μL/poço e lavar 5x. Deixe por 30-60 s de cada vez e, pela última vez, deixe secar no papel borrado.
  7. Diluir a peroxidase de treptavidina-rábano (1:1.000) em PBS-0,5% FBS e adicionar 100 μL/poço. Incubar a placa durante 1 h à temperatura ambiente. Lavar a placa como indicado no passo 4.6.
  8. Adicionar 100 μL/poço de solução de substrato TMB pronta a utilizar e desenvolver até que apareça um ponto límpido. Pare o desenvolvimento da cor lavando extensivamente em água deionizada (enxaguar 5x-6x repetidamente). Se necessário, remova o bueiro (o plástico macio sob a placa) e enxágue o lado inferior da membrana.
  9. Examine e conte as manchas em um leitor ELISpot ou microscópio de dissecação após a placa ter secado.

5. Absorção por CDs

  1. Eutanasiar camundongos normais BALB/c por uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%. Mergulhe os ratos em álcool a 75% por 5 min.
  2. Corte uma incisão de 6-8 cm abaixo do abdômen do rato com uma tesoura e prenda as duas extremidades da abertura para separá-la em direções diferentes e expor as pernas do rato. Separe o fêmur do rato do corpo do rato e a tíbia da articulação e mantenha os ossos intactos em ambas as extremidades.
  3. Remova o tecido residual e a cartilagem das articulações articulares em ambas as extremidades do fêmur com tesoura e pinça. Mergulhe os fêmures em álcool a 75% por 5 minutos e, em seguida, mergulhe em solução estéril de PBS para lavar o álcool da superfície.
  4. Corte as extremidades dos fêmures com uma tesoura e lave a medula óssea em uma placa de Petri estéril com solução estéril de PBS seguida de aspiração com seringa de 1 mL. Repita a lavagem 3x-5x.
  5. Filtrar por uma peneira celular (200 malhas, 70 μm) e recolher os BMDCs num tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar as amostras a 290 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante, adicione 4 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos, ressuspeite e lise à temperatura ambiente por 5 min.
  6. Adicionar 10 mL de solução estéril de PBS para neutralizar o lisado, centrifugar a 290 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
  7. Ressuspender as células em 1 mL de DMEM contendo solução de penicilina-estreptomicina a 1% e FBS a 10% e contagem. Em seguida, adicione GM-CSF (20 ng/mL) mais IL-4 (10 ng/mL) ao meio, ajuste a concentração celular para 5 x 105/mL e inocular as células em coberturas.
  8. Adicionar a suspensão celular a uma placa de 6 poços a 2 mL/poço e colocar a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 por 48 h. Mude o meio completamente após 2 dias e mude metade do meio após 4 dias.
  9. Selecionar cinco poços com células em bom estado (células grandes e radiolúcidas com saliências dendríticas na superfície celular) utilizando um microscópio invertido com ampliação de 100x para o experimento no sétimo dia de cultura. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mL de soluções de GFP, OP-D + GFP e NOD + GFP diluídas com meio DMEM completo (concentração final de GFP: 20 μg/mL; concentração final adjuvante: 10 μg/mL) a cada poço e incube as placas a 37 °C por 30 min no escuro.
  10. Lave as placas 3x com PBS, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% a cada poço e incube à temperatura ambiente por 15 min. Remova o paraformaldeído após a fixação, incube as células com faloidina e DAPI até uma concentração final de 10 μg/mL por 10 min para coloração e, em seguida, lave 3x com PBS.
  11. Adicione 1 mL de PBS a cada poço e observe a absorção de antígenos usando CLSM, conforme descrito abaixo.
    1. Abra o software CLSM, clique em Sistema ZEN e aguarde a conclusão da inicialização do hardware.
    2. Clique nos atalhos GFP e DAPI na guia localizar para encontrar a área que pode ser observada. Desligue a luz fluorescente e a luz transmitida.
    3. Clique em Configuração inteligente no menu de aquisição para abrir a biblioteca de corantes e adicione três corantes fluorescentes: EGFP, faloidina e DAPI. Clique em Melhor Sinal > OK. Clique no canal EGFP na guia canais e clique em Ao vivo para selecionar o campo de visão correto na interface direita.
    4. Selecione 1 UA para o orifício, gire o parafuso de foco fino para ajustar a distância focal e selecione o plano focal apropriado. Clique em Range Indicator e ajuste a combinação de potência do laser e ganho mestre para que apenas pontos vermelhos esporádicos apareçam na imagem.
    5. Ajuste os canais de faloidina e DAPI com os mesmos parâmetros sem alterar a potência do laser.
    6. Selecione Stop Live e clique em Modo de aquisição para alterar os parâmetros de disparo: Tamanho do quadro: 1024 pixels x 1024 pixels; Velocidade de digitalização: 7; Média: 2x. Clique em Encaixar e selecione Dividir para ver todas as imagens tiradas. Salve as imagens.

6. Ativação de macrófagos

  1. Mergulhe os ratos C57BL/6 em álcool a 75% após a eutanásia e coloque-os virados para cima em uma placa de Petri de vidro em ordem numerada.
  2. Passe os ratos através da janela de transferência para a sala de operação estéril e coloque na mesa de operação por 5 minutos.
  3. Usando uma seringa, aspirar 10 mL de solução salina, inclinar os ratos para baixo a aproximadamente 45° e injetar no meio da cavidade abdominal. Retirar cerca de 5 ml de suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 ml por cada 10 ml e repetir a injeção 3x.
  4. Centrifugar a suspensão celular a 129 x g durante 5 minutos para obter macrófagos primários peritoneais de rato. Ressuspeite as células, ajuste a concentração celular para 2 x 106 células/mL com meio completo RPMI 1640 (contendo 10% de FBS) e inocular a suspensão celular em uma placa de 24 poços para garantir um número consistente de células por poço (1 mL/poço).
  5. Cultura a 37 °C em CO 2 a 5% durante a noite (aproximadamente 16-20 h), seguida de incubação com PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD e Ag/Al (concentração final de Ag: 5 μg/mL; concentração final adjuvante: 10 μg/mL; volume total:2 mL) por 24 h. Detectar os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α no sobrenadante de cultura com kits ELISA usando os métodos e procedimentos descritos nas etapas 3.12-3.19.

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Resultados

A avaliação da atividade celular dos adjuvantes OP-D e NOD foi concluída in vitro de acordo com o protocolo. Os fibroblastos L929 são um modelo de triagem útil para o teste de toxicidade in vitro do NOD (Figura 1). A quantificação dos níveis de citocinas inflamatórias no baço pode ajudar os pesquisadores a entender melhor a resposta imune (Figura 2). O monitoramento de CTLs com ELISpot é o padrão-ouro para avaliar a imunidade de células T antíg...

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Discussão

As vacinas de subunidade fornecem excelente segurança, mas baixa imunogenicidade. A principal estratégia para aumentar a imunogenicidade é adsorver fisicamente ou acoplar antígenos com adjuvantes e incorporá-los aos sistemas de liberação de fármacos para promover a captação e apresentação por CDs. As saponinas vegetais naturais, como a saponina quillaia e seus derivados, são altamente tóxicas e não são adequadas para o desenvolvimento de vacinas humanas17. Portanto, o estudo dos efeitos tóxicos da...

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Divulgações

Os autores declaram que não há interesses financeiros ou pessoais concorrentes que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela subvenção nº 2021YFC2302603 do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves da China, bolsas nº 31670938, 32070924, 82041045 e 32000651 do Programa Nacional da Fundação de Ciências Naturais da China, bolsas nº 2014jcyjA0107 e nº 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing, concessão nº CYS21519 do Projeto de Pesquisa e Inovação de Pós-Graduação de Chongqing, concessão nº 2020XBK24 dos projetos especiais da Universidade Médica do Exército e concessão nº 202090031021 do Programa Nacional de Inovação e Empreendedorismo para estudantes universitários.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina-EDTA (1x)GIBCO, EUA25200056
placas filtrantes de 96 poçosMillipore. Billerica, MACLS3922
AlPO4General Chemical Company, EUAnull
Automated Cell CounterCountstar, ChinaIC1000
Camundongos BALB/c e camundongos C57BL/6Beijing HFK Bioscience Co. Ltd
(GTCC)Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Pequim, Chinanulo
Kits CCK-8Dojindo, JapãoCK04
Placa de Contagem de CélulasCostar, Corning, EUACO010101
Cell Sievebiosharp, ChinaBS-70-CS
Centrifuge 5810 REppendorf, Alemanha 
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, EUAD9542
DMEM basic(1x) mediumGIBCO, USAC11885500BT
DSZ5000X Microscópio invertidoNikon, JapãoDSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)Mumbai, Índianull
ELISpot classicAID, AlemanhaELR06
Soro FetalBovino GIBCO, EUA10099141C
Leitor de Microplacas de Função CompletaThermo Fisher Scientific, EUAVL0000D2
GFPSigma-Aldrich, St. Louis, EUAP42212
GlutamaxInvitrogen, EUA35050061
Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos MacrófagosGM-CSF, R& D Systems, EUA315-03
HEPESInvitrogen, EUA15630106
HF 90/240 IncubatorHeal Force, Suíçanull
IL-4PeproTech, EUA042149
linha celular L929FENGHUISHENGWU, China  NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Microscopia Confocal de Varredura a LaserZeiss, AlemanhaLSM 980
MONTANE 85 PPISEPPIC, FrançaL12910
MONTANOX 80 PPISEPPIC, França36372K
Mouse IFN-&gama; Kit ELISADakewe, China1210002
Mouse IFN-γ kit ELISPOT pré-revestidoDakewe, ChinaDKW22-2000-096
Kit ELISA Mouse IL-17ADakewe, China1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kitebiosciences, EUA3521-4HPW-2
Mouse IL-1β Kit ELISADakewe, China1210122
Mouse IL-6 Kit ELISADakewe, China1210602
Mouse TNF-α Kit ELISADakewe, China1217202
Aminoácidos não essenciais (100x)Invitrogen, EUA11140050
Ophiopogonin-DChengdu Purui Technology Co. Ltd945619-74-9
Solução de penicilina-estreptomicinaInvitrogen, EUA15070063
FaloidinaSolarbio, ChinaCA1620
Fosfato Solução salina tamponadaZSGB-BIO, ChinaZLI-9062
Tampão de lise de glóbulos vermelhosSolarbio, ChinaR1010
RPMI 1640Hyclone médio (Life Technology), EUASH30809.01
Piruvato de sódio (100 mM)Invitrogen, EUA11360070
SqualeneSigma, EUAS3626
β- MercaptoetanolInvitrogen, EUA21985023
triglicerídeo caprílico/cáprico nulo 5811000398

Referências

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