O protocolo apresenta métodos detalhados para avaliar se o adjuvante da nanoemulsão ofiopogonina D promove respostas imunes celulares eficazes.
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Artigo de método
In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D
Neste artigo
Resumo
Resumo
Como ingrediente principal das vacinas, os adjuvantes podem induzir ou melhorar diretamente as respostas imunes poderosas, generalizadas, inatas e adaptativas associadas aos antígenos. Ophiopogonin D (OP-D), um componente purificado extraído da planta Ophiopogon japonicus, foi encontrado para ser útil como um adjuvante da vacina. Os problemas de baixa solubilidade e toxicidade do OP-D podem ser efetivamente superados usando um método de emulsificação de baixa energia para preparar a ofiopogonina D (NOD) em nanoemulsão. Neste artigo, uma série de protocolos in vitro para avaliação da atividade celular são examinados. Os efeitos citotóxicos da L929 foram determinados usando um ensaio kit-8 de contagem celular. Em seguida, os níveis de citocinas secretadas e o número de células imunes correspondentes após a estimulação e cultura de esplenócitos de camundongos imunizados foram detectados pelos métodos ELISA e ELISpot. Além disso, a capacidade de captação de antígenos em células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs), que foram isoladas de camundongos C57BL/6 e amadurecidas após incubação com GM-CSF mais IL-4, foi observada por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). É importante ressaltar que a ativação de macrófagos foi confirmada pela medição dos níveis de citocinas IL-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por kits ELISA após a cocultura de macrófagos peritoneais (PMs) de camundongos em branco com o adjuvante por 24 h. Espera-se que este protocolo forneça a outros pesquisadores abordagens experimentais diretas e eficazes para avaliar as eficácias da resposta celular de novos adjuvantes vacinais.
Introdução
As vacinas são um meio importante de prevenir e tratar doenças infecciosas e não transmissíveis. A adição adequada de adjuvantes e veículos de entrega às formulações de vacinas é benéfica para aumentar a imunogenicidade dos antígenos e gerar respostas imunes duradouras1. Além do alúmen adjuvante clássico (sal de alumínio), existem seis tipos de adjuvantes para vacinas que são atualmente comercializados: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 e Matrix-M5. Geralmente,....
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Protocolo
Todos os experimentos celulares foram realizados em um laboratório de engenharia celular equipado com salas de cirurgia básicas, salas de tampão, salas de cultura estéreis e salas de identificação e análise. O ambiente e as condições de trabalho estavam livres de contaminação microbiana e outros fatores prejudiciais. Os experimentos com animais foram conduzidos com base nas Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar e Ética Animal de Laboratório da Terceira Universidade Militar de Medicina.
1. Autoclave e preparação de materiais
- Preparar os reagentes e cons....
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Resultados
A avaliação da atividade celular dos adjuvantes OP-D e NOD foi concluída in vitro de acordo com o protocolo. Os fibroblastos L929 são um modelo de triagem útil para o teste de toxicidade in vitro do NOD (Figura 1). A quantificação dos níveis de citocinas inflamatórias no baço pode ajudar os pesquisadores a entender melhor a resposta imune (Figura 2). O monitoramento de CTLs com ELISpot é o padrão-ouro para avaliar a imunidade de células T antíg.......
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Discussão
As vacinas de subunidade fornecem excelente segurança, mas baixa imunogenicidade. A principal estratégia para aumentar a imunogenicidade é adsorver fisicamente ou acoplar antígenos com adjuvantes e incorporá-los aos sistemas de liberação de fármacos para promover a captação e apresentação por CDs. As saponinas vegetais naturais, como a saponina quillaia e seus derivados, são altamente tóxicas e não são adequadas para o desenvolvimento de vacinas humanas17. Portanto, o estudo dos efeitos tóxicos da.......
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Divulgações
Os autores declaram que não há interesses financeiros ou pessoais concorrentes que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pela subvenção nº 2021YFC2302603 do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves da China, bolsas nº 31670938, 32070924, 82041045 e 32000651 do Programa Nacional da Fundação de Ciências Naturais da China, bolsas nº 2014jcyjA0107 e nº 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing, concessão nº CYS21519 do Projeto de Pesquisa e Inovação de Pós-Graduação de Chongqing, concessão nº 2020XBK24 dos projetos especiais da Universidade Médica do Exército e concessão nº 202090031021 do Programa Nacional de Inovação e Empreendedorismo para estudantes universitários.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% de tripsina-EDTA (1x) | GIBCO, EUA | 25200056 | |
| placas filtrantes de 96 poços | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, EUA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| Camundongos BALB/c e camundongos C57BL/6 | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | ||
| (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Pequim, China | nulo | |
| Kits CCK-8 | Dojindo, Japão | CK04 | |
| Placa de Contagem de Células | Costar, Corning, EUA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Alemanha | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Microscópio invertido | Nikon, Japão | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, Índia | null | |
| ELISpot classic | AID, Alemanha | ELR06 | |
| Soro Fetal | Bovino GIBCO, EUA | 10099141C | |
| Leitor de Microplacas de Função Completa | Thermo Fisher Scientific, EUA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, EUA | 35050061 | |
| Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos Macrófagos | GM-CSF, R& D Systems, EUA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, EUA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Suíça | null | |
| IL-4 | PeproTech, EUA | 042149 | |
| linha celular L929 | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Microscopia Confocal de Varredura a Laser | Zeiss, Alemanha | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, França | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, França | 36372K | |
| Mouse IFN-&gama; Kit ELISA | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ kit ELISPOT pré-revestido | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Kit ELISA Mouse IL-17A | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, EUA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β Kit ELISA | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 Kit ELISA | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α Kit ELISA | Dakewe, China | 1217202 | |
| Aminoácidos não essenciais (100x) | Invitrogen, EUA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Solução de penicilina-estreptomicina | Invitrogen, EUA | 15070063 | |
| Faloidina | Solarbio, China | CA1620 | |
| Fosfato Solução salina tamponada | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 | Hyclone médio (Life Technology), EUA | SH30809.01 | |
| Piruvato de sódio (100 mM) | Invitrogen, EUA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, EUA | S3626 | |
| β- Mercaptoetanol | Invitrogen, EUA | 21985023 |
Referências
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeuti....
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Reimpressões e permissões
