Este protocolo descreve a síntese de peptídeos cíclicos penetrantes em células com ligações cruzadas aromáticas e a avaliação de sua permeabilidade através de barreiras biológicas.
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Artigo de método
Construção de Peptídeos Cíclicos Penetrantes em Células para Maior Penetração de Barreiras Biológicas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O câncer tem sido um grande desafio na saúde global. No entanto, o complexo microambiente tumoral geralmente limita o acesso da terapêutica a células tumorais mais profundas, levando à recorrência tumoral. Para vencer a penetração limitada de barreiras biológicas, peptídeos penetrantes de células (CPPs) foram descobertos com excelente capacidade de translocação de membrana e emergiram como transportadores moleculares úteis para entregar várias cargas nas células. No entanto, as PPCs lineares convencionais geralmente apresentam estabilidade proteolítica comprometida, o que limita sua permeabilidade através de barreiras biológicas. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares que possam penetrar em barreiras biológicas e exibir maior estabilidade proteolítica é altamente desejado para promover a eficiência na liberação de fármacos em aplicações biomédicas. Nós sintetizamos previamente um painel de CPPs cíclicos curtos com ligações cruzadas aromáticas, que exibiram permeabilidade superior em células e tecidos cancerosos em comparação com seus homólogos lineares. Aqui, um protocolo conciso é descrito para a síntese do peptídeo R8 cíclico de poliarginina fluorescentemente marcado e sua contraparte linear, bem como os principais passos para investigar sua permeabilidade celular.
Introdução
As últimas décadas testemunharam rápidos avanços no desenvolvimento de peptídeos penetrantes em células (CPPs) para liberação de fármacos. As PPCs têm sido amplamente utilizadas como transportadores moleculares para o tratamento de uma série de doenças potencialmente fatais, incluindo distúrbios neurológicos1,2, doenças cardíacas3, diabetes4, dermatoses5 e câncer 6,7. O câncer continua sendo um fardo de saúde global acompanhado por uma alta taxa de morbidade e mortalidade, apesar d....
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Protocolo
1. Preparação do equipamento
OBS: Realizar todos os procedimentos em exaustor de operação com equipamentos de proteção individual adequados.
- Montar o aparelho manual de síntese de peptídeos na capela de fumaça (Figura 1). Coloque as torneiras de três vias (ver Tabela de Materiais) no coletor de vácuo (ver Tabela de Materiais) e conecte-as ao nitrogênio (N2). Certifique-se de tampar as entradas não utilizadas.
- Fixe uma coluna de polipropileno de 10 ml (ver Tabela de Materiais) nas torneiras de três vias. Escorra a ....
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Resultados
Neste protocolo, um procedimento sintético para restringir a poliarginina linear R8 em sua forma cíclica foi apresentado. A SPPS foi realizada manualmente, utilizando-se aparelho simples (Figura 1). O processo sintético detalhado da SPPS é mostrado na Figura 2. Resumidamente, a resina estava suficientemente inchada, seguida pela desproteção do grupo protetor N α-Fmoc. Em seguida, o aminoácido N α-Fmoc protegido foi ancorado na resina .......
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Discussão
A estabilização química de peptídeos pela incorporação de restrições conformacionais tem se mostrado uma estratégia eficaz para melhorar a estabilidade e a permeabilidade celular do peptídeo26. Neste protocolo, um procedimento passo-a-passo é descrito para a síntese de CPPs cíclicas com ligações cruzadas aromáticas e a avaliação de sua permeabilidade através de barreiras biológicas. Comparada às ligações cruzadas hidrofílicas lactâmicas ou triazólicas22,27, a incorporação de ligações cruzadas arom.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pela Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) e pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2682021ZTPY075).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2-etanodiidol | Aladdin | K1722093 | fedor |
| 2- (7-Azobenzotriazol) -N, N, N', N', N'-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis (bromometil) bifenil | TCI | B1921 | |
| 4T1 células | ATCC | As células 4T1 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de FBS (Hyclone) em um 37 ° C incubadora umidificada contendo 5% de CO2. | |
| Acetonitrila | Toxicidade | 1484971 | de Adamas |
| Diclorometano | Energia | W330229 | pele prejudicial |
| Éter dietílico | Aldrich | 673811 | inflamável |
| Dimetilsulfóxido | Beyotime | ST038 | pele prejudicial |
| Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (DMEM) | Espectrômetro | ||
| Electrospray | Águas | G2-S Tof | |
| Ácido Etileno Diamina Tetracético (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Soro bovino fetal (FBS) | Citômetro de fluxo HyClone | ||
| Beckman Coulter | CytoFLEX | ||
| Isômero de isotiocianato de fluoresceína ( FITC) | Microscópio | Fluorescente Energy E0801812500 | |
| Carl Zeiss | Axio Observer 7 | ||
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-β Células HeLa Ala-OH | Adamas | 51341C | |
| As células ATCC | HeLa foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS (Hyclone) em um 37 ° C incubadora umidificada contendo 5% de CO2. | ||
| Cromatografia Líquida de Alta Eficiência | Agilent Agilent | 1260 | |
| Coluna de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4,6 &vezes; 150 mm (tamanho do poro 120 Å, tamanho de partícula 4 μ m) | |
| Liofilizador | SP Scientific | Vir Tis | |
| Metanol | Aldrich | 9758 | toxicidade |
| Placa de microtitulação | Thermo μ placa de queda | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritante |
| Leitor de microplacas multitecnologia | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N, N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritante |
| N, N-Dimetil formamida | Energia | B020051 | prejudicial à pele |
| Poly-Prep coluna | Bio-Rad | Colunas | cromatografia em polipropileno |
| Resina Rink Amide MBHA (0,572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Torneiras de três vias | Bio-Rad | 7328107 | |
| Inserção de placa de cultura de tecidos | LABSELECT | 14211 | |
| Ácido trifluoroacético | HEOWNS | T63278 | corrosivo |
| Triisopropilsilano | HEOWNS | T-0284475 | |
| Tripsina | BioFroxx | 1004 | |
| Coletor de vácuo | Promega | A7231 |
Referências
- Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
- Park, T. E., et al.
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Reimpressões e permissões
