O ensaio de ligação de proximidade permite a detecção, localização e quantificação da metilação da proteína arginina em tecido fixo

Summary

O ensaio de ligação de proximidade é uma técnica muito útil para localizar e quantificar a metilação da arginina de uma determinada proteína quando o resíduo de arginina modificado é desconhecido e/ou se nenhum anticorpo específico estiver disponível.

Abstract

A metilação da arginina está emergindo como uma modificação pós-traducional chave envolvida em uma ampla gama de processos biológicos. Seu estudo em tecido é frequentemente limitado pela falta de um anticorpo específico que reconheça o resíduo de arginina alvo. O ensaio de ligação de proximidade (PLA) foi originalmente desenvolvido para estudar as interações proteína/proteína. Aqui, descrevemos em detalhes um protocolo de PLA dedicado à detecção da metilação da arginina que aplicamos ao receptor de glicocorticóide (GR). Tendo mostrado anteriormente que o PRMT5 dimetila GRs nas células, usamos PLA com um anticorpo dimetil pan-simétrico e um anticorpo anti-GR para medir a metilação do GR em tumores de mama. Demonstramos que o PLA oferece uma abordagem única para medir a metilação da arginina de uma proteína-alvo, mesmo quando o local de metilação não foi identificado. Essa técnica pode ser estendida a outras modificações pós-traducionais onde anticorpos pan eficazes estão disponíveis. Portanto, detalhamos a tecnologia PLA usada para detectar a metilação da arginina em tecidos fixos usando GR como exemplo.

Introduction

A metilação da arginina por proteínas arginina metiltransferases (PRMTs) é uma modificação pós-traducional abundante (PTM) envolvida em vários processos biológicos. Os PRMTs catalisam a transferência de grupos metil dos resíduos de S-adenosil metionina para arginina. A família PRMT compreende nove membros classificados de acordo com o tipo de metilação que realizam. Todos os membros realizam monometilação (MMA). Os PRMTs do tipo 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 e 8) catalisam a dimetilação assimétrica (ADMA), enquanto os tipos 2 (PRMT5 e 9) catalisam a dimetilação simétrica (SDMA) e o tipo 3 (PRMT7) geram apenas MMA¹. Ao m....

Protocol

O consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente. O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional do Centro de Pesquisa do Câncer de Lyon.

1. Escolha dos anticorpos

1. Use anticorpos primários validados por IHQ ou imunofluorescência (IF).
   NOTA: Os anticorpos primários selecionados para o estudo são cruciais para o sucesso do PLA e, mais particularmente, no tecido fixo. O uso de um anticorpo validado por IHC ou IF aumentará a taxa de sucesso do experimento. A otimização e a especificidade dos anticorpos são necessárias antes da realização de....

Results

Usando o procedimento descrito acima, é possível detectar e quantificar a metilação de uma proteína de interesse. Aqui, mostramos o exemplo da metilação da RG por PRMT5. Os anticorpos e as condições experimentais para PLA foram previamente aplicados às células¹⁰. Resumidamente, os anticorpos primários direcionados a GR e SDMA são reconhecidos por sondas de proximidade conjugadas com oligonucleotídeos complementares. Então, a hibridização de uma sonda circular de DNA ocorre quando as proteínas estã.......

Discussion

A metilação da arginina, como outros PTMs, contribui para a regulação fina das funções das proteínas. No entanto, seu impacto é subestimado devido à dificuldade em avaliar essas modificações, principalmente devido à falta de ferramentas. Isso é particularmente verdadeiro ao estudar a metilação in vivo, onde a única maneira de medir a metilação da arginina é possuir anticorpos específicos que reconheçam o resíduo metilado da proteína de interesse. Isso constitui claramente uma li.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lâminas de adesão TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anticorpo anti-GR (camundongo)	Santa Cruz	sc393232
anticorpo anti-GR (camundongo)	santa cruz	sc393232
anticorpo anti-PRMT5 (coelho)	Merck	07-405
anticorpo anti-SDMA (coelho)	CST	13222
Automação d'inclusão	Leica	ASP 6025	Infiltração de parafina e preparação de blocos
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako diluente de anticorpos	Dako Agilent	S202230-2	diluente de anticorpos
Discovery ChromoMap Diaminobenzidina (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidina (DAB)
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  Sonda PLA anti-mouse menos	Sigma-Aldrich	DUO92004	Kit PLA  (sonda anti-coelho menos)
Reagentes de detecção insitu Duolink campo claro	Kit Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  (reagentes de detecção in situ)
Sonda PLA insitu Duolink anti-coelho mais	Sigma-Aldrich		DUO92002 Kit PLA  (sonda anti-coelho mais)
Duolink tampão de lavagem instancia campo claro	Kit Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  (tampão de lavagem in situ)
Etanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Etanol absoluto ≥ 99,8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, pronto a usar, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Lamínula de vidro totalmente automatizada	Leica	CV5030	lamínula de cobertura automatizada
Lamínulas de vidro 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxilina	Ventana	760-2021
Instrumento IHC	Roche	DISCOVERY XT	Automação de IHC
LCS	Miche	5264839001
Micrótomo	Thermo Scientific	Microm HM340E	Corte dos tecidos incluindo em blocos
Meio de montagem Pertex	Histolab	00801-FR
Caneta PAP para imunocoloração	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Cera de Parafina tek III, 4 x 2, 5 kg	Pipetas	4511
Pasteur	Tampão Fisher Scientific	12583237
PBS 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Tampão de reação 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche
Anticorpo secundário anti-rato	Abcam	ab133469
Anticorpo secundário OmniMap anti-coelho HRP	Roche	760-4311
Centro de incorporação de tecidos	MMF	EC 350
Xileno (mistura de isômeros) ≥ 98,5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscópio			de campo claro vertical